PAGE电泳操作说明

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

一、制胶

本实验室常用40ml 体系胶浓度9%

NH基团中的氢原子被甲基替换而得。工作原理在于TEMED可以催化过硫酸铵或核黄素产生自由基，从而引发聚合反应，促进聚丙烯酰胺凝胶的形成。

根据不同情况TEMED和过硫酸铵可适量加减。

以上的各组分按顺序加入（TEMED最后加入），充分的摇匀后用玻璃棒引流到两块

玻璃板之间，当胶加到上部时，在灌胶口处插入梳子，此步骤要选择合适的梳子，且插入时要尽量缓慢，防止气泡的产生，影响点样，若有漏出要及时的补加聚丙烯酰胺溶液，后用夹子将下面和两边夹紧防止漏胶，放在室温下让其凝结15min以上。

制胶时底板(不带缺口)和盖板(带缺口)与胶接触的那一面以及梳子齿要保证干净，没有灰尘、胶颗粒等，制胶前一般会用酒精擦拭玻璃板表面和梳子齿。

凝固后上电泳仪前将夹子、胶条、梳子卸掉用水冲洗上样孔将残胶冲掉同时赶走气泡。

二、电泳

PCR 扩增产物由非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)垂直电泳分离检测。稳定功率20W(电压200V±)，电泳时间一般1.5h，可根据产物片段大小适当调整。

1.预电泳，待凝胶聚合后，将梳子拔出，在电泳槽内加入 1×TBE，预电泳10分钟

2.上样，预电泳后，将PCR产物和loading buffer

3.5ul混合，用移液枪吸取5ul 混

合液轻轻地加入点样孔，尽量的减少加样时间，以防样本弥散。

3.接上电源进行电泳，

电泳槽和玻璃板要用夹子夹紧，否则漏缓冲液会让整个条带跑歪。

功率过高会使温度升高导致玻璃板炸裂，同时注意环境温度，天热时开空调或风扇散热。

三、染色

本实验采用银染法

1.电泳结束后，切断电源，倒去电泳缓冲液，卸去玻璃板，去掉胶条。

2．在托盘中加入固定液100ml/块胶。将整版胶小心放入溶液中（要没过胶），水平摇床上摇2min。

3.加入1ml 20% 硝酸银溶液，8—10min。后倒掉溶液，加清水洗一次。

4.托盘中加入显影液100ml/块胶，于摇床震荡至显色。

5.将洗干净的凝胶放在保鲜膜上包好，以备统计带型和照相。

染色效果(烟草SSR标记)

1.多块胶同时染时要多好记号，点样顺序也要明确，例如可在开始点样一侧切去一角作

为记号。

2注意防止胶破损，操作时小心。可适当增加丙烯酰胺浓度。

3加硝酸银和显影液事不要直接对着胶加，容易把胶染花掉，建议顺着托盘边缘缓慢加入

4硝酸银用量，过多浪费，过少颜色太浅

5显影液中甲醛不宜过多，否则背景会很深。

显影液 100ml/块胶

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

配方

水稻indel标记所用胶条和梳子

本实验室变性胶一般为大玻璃板，可重复点样。胶条和梳子均是塑料薄片制成，所以胶很薄，制胶时底板涂亲和剂(bind-sliane)盖板涂非亲和剂(repel-silane)，跑胶结束后胶粘贴在底板上。

与胶接触的玻璃板面要用酒精反复擦拭，所制胶很薄，一旦玻璃板有灰尘倒胶时会产生气泡。染色同样用银染法。

还可以用荧光染料进行染色，染料加入pcr体系中，跑胶结束后在凝胶成像仪中观察结果（新楼一楼用此方法）。