PAGE电泳操作说明
(完整版)SDS-PAGE蛋白电泳方法
SDS-PAGE一. 实验原理SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。
在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。
由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。
蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。
基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。
二. 试剂器材30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制；注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。
分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；电泳缓冲液(1L)：称取试剂Tris 3.03g和甘氨酸 14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L (自然pH值为8.3，无需再调)，4℃ 贮存，可重复使用5-6次；2×加样缓冲液(10mL)：取下列试剂置于10mL塑料离心管中0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8) 2.0mL10%SDS溶液 4.0mL甘油 2.0mL巯基乙醇 2.0mL溴酚蓝 0.02g，混匀后1mL分装，-70℃可贮存6个月；10%AP：称取(NH4)2S2O3 1.0 g，溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份1mL，-20℃贮存；TEMED：分装成每份1mL，4℃避光贮存；水饱和正丁醇(100mL)：在玻璃瓶中加入50mL双蒸水和50mL正丁醇，振摇。
SDS-PAGE蛋白电泳标准操作规程
SDS-PAGE蛋白电泳标准操作----(纯度检测)一.目的：检测蛋白质的纯度是否达到生产抗体的要求。
二.依据：《分子克隆手册》，Ab-mart公司内部标准。
三. 职责：质量控制部。
四.试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。
五. 器皿与耗品：所有玻璃器皿使用前用玻璃清洁剂清洗, 80℃烤干。
tube、tip一次性使用。
六. 仪器设备：电泳仪（电源1--300V）电泳槽灌胶模具染色具凝胶扫描仪七. 环境要求：相对洁净环境，室温。
八. 溶液的配置：1.A液：1.5MTris·HCl pH8.8称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8,加超纯水定容至100 ml。
贴上标贴，4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）2.B液: 1MTris·HCl pH6.8称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8,加超纯水定容至100 ml。
贴上标贴，4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）3.C液: 30%丙烯酰胺称取29.2g丙烯酰胺(分析纯),0.8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解,再定容至100 ml,用滤纸过滤,。
贴上标贴，避光4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）4.D液:10%SDS称取10gSDS(分析纯),用超纯水溶解至100 ml.贴上标贴，室温储存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）5.E液:10%过硫酸胺称取10g过硫酸胺(分析纯), 用超纯水溶解至100 ml。
贴上标贴，-20℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）6.F液:TEMED(amersco)7.电泳缓冲液(10X)称取60.57g Tris碱(分析纯),288.268g甘氨酸(分析纯),20gSDS(分析纯),加超纯水定容至2000ml，临用前加超纯水稀释10倍，贴上标贴，室温储存。
SDS-PAGE电泳标准操作规程（SOP）rosoftOfficeWord文档
SDS-PAGE电泳标准操作规程（SOP）rosoftOfficeWord文档SDS-PAGE电泳标准操作规程(SOP)一．仪器装置1．电泳仪2．夹心式垂直电泳槽3．玻璃板：长14.5×11.5×2mm、短14.0×11.5×2mm4．可调微量移液器5．微量进样器6．转移脱色摇床二．试剂配制1．丙烯酰胺液（30%T/2.7%C）用天平分别称取58.4g丙烯酰胺（Acr）和1.6g N,N’-亚甲双丙烯酰胺（Bis），溶于120ml温热（37℃左右，以利于溶解Bis）的去离子水中，然后转移至200ml容量瓶中，补加去离子水至刻度，摇匀，用滤纸过滤后，检查其pH值应不大于7.0，贮存在棕色瓶中，4℃保存。
每隔2个月重新配制。
小心：丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应戴手套。
如不慎接触皮肤，应立即用水和肥皂清洗。
2．分离胶缓冲液（1.5M Tris-HCl，pH8.8）用天平称取36.3g三羟甲基氨基甲烷（Tris），溶于160ml去离子水中，用HCl调pH 值至8.8~8.9（先加5ml浓HCl，再逐滴加1M HCl调节），用去离子水定容至200ml，置棕色瓶中4℃保存。
3．浓缩胶缓冲液（0.5M Tris-HCl，pH6.8）用天平称取12.1g Tris，溶于160ml去离子水中，用HCl调pH 值至6.7~6.8（先加8ml浓HCl，再逐滴加1M HCl调节），用去离子水定容至200ml，置棕色瓶中4℃保存。
4．10% 十二烷基硫酸钠溶液用天平称取20.0g 电泳级十二烷基硫酸钠（SDS），加180ml去离子水，68℃水浴使溶解后，用去离子水定容至200ml，室温保存。
5．10% 过硫酸铵溶液用天平称取0.50g过硫酸铵（APS），溶于5ml去离子水中，分装Eppendof管冰冻保存。
6．四甲基乙二胺（TEMED）液7．分离胶覆盖液（（0.375M Tris-HCl，pH8.8，0.1% SDS）取分离胶缓冲液25ml、10% SDS溶液1.0ml，混匀，加去离子水定容至100ml，室温保存。
SDS-PAGE电泳的标准操作规程
SDS-PAGE电泳的标准操作规程（编号：039）1、目的及适用范围SDS-PAGE电泳的分离原理，是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的净电荷，消除了蛋白分子的电荷效应，使蛋白按分子大小分离，主要用于蛋白质分子量的测定、蛋白质混合组分的分离和蛋白质亚基组分的分析等方面。
2、主要仪器恒压或恒流电源、垂直板、制胶模具3、试剂及配制方法试剂配制方法或要求H2O 电阻率不低于18.2 MΩ.cm1.5 M Tris-HCl 1.5 moL/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.830% Acrylamide 30% 丙烯酰胺溶液（避光保存）10% SDS 10% SDS溶液10% APS 10% 过硫酸铵溶液（临用前配制）TEMED TEMED溶液1 M Tris-HCl 1 moL/L Tris-HCl缓冲液，pH 6.815.1g、甘氨酸94 g、SDS 5 g，水稀释至1 L，pH 8.35×电极缓冲液 Tris2×Loading buffer 100 mM Tris-HCl（pH6.8）、4% SDS、0.2% 溴酚蓝、20% 甘油，用于非还原SDS-PAGE电泳，如用于还原SDS-PAGE电泳，则再加2% β-巯基乙醇5×Loading buffer 250 mM Tris-HCl（pH6.8）、10% SDS、0.5% 溴酚蓝、50% 甘油，用于非还原SDS-PAGE电泳，如用于还原SDS-PAGE电泳，则再加5% β-巯基乙醇考马斯亮蓝染色液 0.1%考马斯亮蓝R250、25%异丙醇、10%冰醋酸，水稀释至1 L考马斯亮蓝脱色液醋酸100 mL、乙醇50 mL、水850 mL4、操作步骤4.1 制胶：取合适的密封垫片和两块已清洁的干燥的玻璃板，组装成灌胶的模具，按下表制成分离胶，灌入模具内一定高度（一般离玻璃板上端3.5 cm），小心加水或异丙醇封顶（约0.5 cm高），室温下聚合（温度不同，聚合时间不同，20℃大约需30 min）。
SDS-PAGE电泳注意事项
SDS-PAGE电泳的操作规程一、样品处理取适量体积的样品溶液（样品含约为0.5-5ug），加入5×样品缓冲液，用振荡器混匀，于95℃水浴中煮5分钟，并于离心机中12000r/min离心5分钟待上样用，煮完后室温冷却。
非还原不用煮。
二、配制凝胶溶液和灌胶A、预先计算好所需浓度胶的体积及配胶所需要的各种试剂的体积，按这些数据依次加入试剂并混匀，然后灌入预先装好并且用双蒸水试漏过的板层中（先是分离胶），在胶的上面加一小层水饱和的异丁醇，置于平整的桌面让其自然凝固。
B、待分离胶凝固后（以胶与异丁醇界面有折射为准），到掉上层的异丁醇，用双蒸水冲洗三次并用吸水纸吸干。
然后灌入预定浓度的、按步骤A配制的浓缩胶，插入加样梳（注意赶走气泡），平置于水平桌面，自然凝固。
C、待凝固后，放置1小时使胶充分交联凝固。
三、电泳1、拔掉梳子，用双蒸水冲洗加样孔，去除杂质及未凝固的胶溶液，然后装好电泳装置，加入电泳缓冲液（如阴阳极缓冲液不同，需要分别加入相应的缓冲液，另外，阴阳极电泳缓冲液不要混在一起）2、用20ul的微量加样枪上样。
3、电泳开始时，恒压模式下用80V的电压电泳，待指示剂溴酚蓝进入分离胶时，把电压提高到130-150V左右，直到溴酚蓝快走出分离胶时，终止电泳，切断电源，拆下凝胶分别切下上、下角标记胶的方向及区别是哪一块胶。
4、清洗胶架、玻璃及其他附件。
四、染色、脱色及结果的分析与保存1、把剥下的胶浸入染色液中，放在脱色摇床上摇1小时。
2、取出凝胶块，用蒸馏水冲洗干净，然后置于脱色液中脱色，摇荡脱色直到底色基本脱完。
3、脱完色的胶用凝胶成像系统照相并进行数据分析处理。
一、试剂的使用与管理1、30%的丙烯酰胺贮存液（棕色瓶中保存）、pH8.8的缓冲液、PH6.8的缓冲液、10%的AP、TEMED用完后请放回4℃冰箱。
2、2×上样缓冲液，用完后请存放于-20℃冰箱的指定位置。
3、中分子量marker请按照说明书配制，配制后于95℃水浴中煮5分钟，冷却后离心，分装到eppendorf管中，每管10 U L。
PAGE电泳原理与步骤
PAGE电泳原理与步骤电泳是一种将带电粒子在电场中移动的技术。
它广泛应用于生物化学、生物分析、药学和分子生物学等领域。
电泳的原理和步骤如下：一、电泳原理：1.带电粒子在电场中移动：带电粒子在电场中受到电场力的作用，从而产生移动，移动的方向和速度取决于粒子的电荷、尺寸和电场强度。
2.电泳液：电泳液是电泳中的介质，一般是由缓冲剂和溶质组成。
缓冲剂主要用于维持pH值，避免电解质的游离和脱水，同时确保带电粒子的稳定性。
3.分离原理：电泳主要通过带电粒子在电场中的迁移速度的差异来实现分离。
根据带电粒子的质量、大小、形状、电荷以及所受到的摩擦力等因素不同，迁移速度也会有所差异，从而实现粒子的分离。
二、电泳步骤：电泳实验通常包括以下步骤：1.制备电泳装置：首先需要制备一个电泳装置。
常用的电泳装置有板式电泳和管式电泳。
板式电泳是将样品放置在平板上进行分离，而管式电泳是将样品注入毛细管中进行分离。
装置的选择根据具体实验需要来确定。
2.制备样品：将待分离物质溶解在适当的溶剂中，使其成为电泳液的一部分。
同时，可以加入一些染料或标记物，以便观察分离结果。
3.加载样品：将样品按照要求加载到电泳装置上。
对于板式电泳，将样品通过特定偏移滤纸或溶胶将其加载到凝胶槽中。
对于管式电泳，将样品通过毛细管导入毛细管电泳装置。
4.施加电场：将电泳装置连接到电源上，在适当条件下施加电场。
电场的选择根据待分离物质的特性和所需的分离效果来确定。
5.电泳分离：在施加电场后，待分离物质开始移动。
移动过程中，不同成分依据其电荷、尺寸和形状的差异，以不同的速度迁移。
6.停止电泳：根据实验要求，适时停止电泳过程。
停止电泳后，可以通过染色、标记或其他检测方法，对分离结果进行观察和分析。
7.结果分析：根据不同实验目的，使用相关方法对分离结果进行分析。
可使用紫外可见光谱、荧光等技术进行定量或定性分析。
同时，可以根据分离结果进行下一步骤的实验设计和分析。
电泳是一种重要的分离和分析技术，具有广泛的应用前景。
SDS-PAGE凝胶电泳操作
SDS-PAGE凝胶电泳操作一、常规试剂的配制1. 30% 聚丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺 150g，甲叉双丙烯酰胺4g，双蒸水500ml，滤纸过滤后，棕色瓶避光4℃保存；2.1.5mol/L，pH 8.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：18.15g Tris，用1mol/L HCl定容至100ml，棕色瓶避光4℃保存；3. 1.0mol/L，pH 6.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：12g Tris，用1mol/L 调pH至100ml，棕色瓶避光4℃保存；4. 10% SDS溶液：10g SDS加水定容至100ml，完全溶解室温保存；5. 10% AP溶液：0.1g AP（过硫酸铵）加水定容至1ml，用前新鲜配制；6. 1×SDS-PAGE电泳缓冲液：25mM Tris（3.0285g/L），192mM甘氨酸（14.41g/L），0.1%SDS （1g/L），pH 8.30；7. 染色液：0.25g 考马斯亮蓝R-250溶解于45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸，过滤除去杂质；8. 脱色液：45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸；9. 固定液：50ml甲醇，40ml水，10ml冰醋酸；10. 2×SDS-PAGE上样缓冲液：10% SDS 0.4ml，0.375M Tris-HCl（pH 6.8）0.333ml，甘油0.2ml，1% 溴酚兰10μL，β-疏基乙醇100μL，加水定容至1ml，分装后-20℃保存。
二、样品的处理1. 蛋白含量较低的酶制剂或原料样品（1）粉剂（或颗粒）样品称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解1h（搅拌时间可根据实际情况进行增减），4000rpm离心10min，取离心上清液等体积加入20%的三氯乙酸聚沉30min，离心，弃去离心上清液，用70%的丙酮溶液洗涤沉淀，4000rpm离心10min，重复洗涤3-5次，将丙酮洗涤液吹干，加入适量（1-3ml）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。
BIORAD电泳仪及SDS-PAGE凝胶电泳操作规范
使用BIO-RAD电泳仪进行SDS-PAGE凝胶电泳的操作规范实验原理根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白，在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移速率主要取决于亚基分子量的大小。
实验所用仪器FR-200A全自动紫外与可见分析装置上海复日科技有限公司电泳仪 BIO-RAD公司TS-1型脱色摇床江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司实验用试剂低分子量蛋白Maker TAKARA4*上样缓冲 TAKARAPagn Blue protein staining solution Fermentas试剂的配制1.贮液的配制（1）凝胶储液取30g丙烯酰胺+0.8g甲叉双丙烯酰胺0.8g ,先用35ml双蒸水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释至100ml，过滤。
棕色瓶4℃保存一个月。
（2）1 mol/l Tris-HCL (PH 8.8)12.1g Tris(三羟甲基氨基甲烷)溶解在80ml双蒸水中，用4mol/l盐酸调PH至8.8。
再用双蒸水稀释至100ml，保存在4℃冰箱。
（3）1.0 mol/l Tris-HCL (PH 6.8)6.06g Tris溶解在40ml双蒸水中，用用4mol/l盐酸调PH至6.8。
再用双蒸水稀释至50ml，保存在4℃冰箱。
（4）10%过硫酸铵（APS）0.1g过硫酸铵+1ml双蒸水。
使用前新鲜配制（5）Tris–甘氨酸电泳缓冲液的配制（25mmol/L Tris；250mmol/L甘氨酸(pH8.3)）30.3gTris+ 144.2g甘氨酸+ 10gSDS，双蒸水定容至1L。
每次使用时10倍稀释。
（6）样品缓冲液使用4*SDS-PAGE loading buffer(Takara公司)，上样缓冲与样品比例1:3混匀，之后煮沸5min。
2.凝胶的配制注：上表所标体积为配制两块胶的用量。
若配制一块或多块，可按比例减半或加倍。
具体步骤如下：1、样品制备：40 µL蛋白+5*上样缓冲液10 µL，煮沸5 min，冷却后放冰箱下层保存，备用2、制胶1）用专用的医用棉口罩将胶板擦拭干净，电泳槽清洗干净，组装模具。
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非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、制胶
本实验室常用40ml 体系胶浓度9%
NH基团中的氢原子被甲基替换而得。
工作原理在于TEMED可以催化过硫酸铵或核黄素产生自由基，从而引发聚合反应，促进聚丙烯酰胺凝胶的形成。
根据不同情况TEMED和过硫酸铵可适量加减。
以上的各组分按顺序加入（TEMED最后加入），充分的摇匀后用玻璃棒引流到两块
玻璃板之间，当胶加到上部时，在灌胶口处插入梳子，此步骤要选择合适的梳子，且插入时要尽量缓慢，防止气泡的产生，影响点样，若有漏出要及时的补加聚丙烯酰胺溶液，后用夹子将下面和两边夹紧防止漏胶，放在室温下让其凝结15min以上。
制胶时底板(不带缺口)和盖板(带缺口)与胶接触的那一面以及梳子齿要保证干净，没有灰尘、胶颗粒等，制胶前一般会用酒精擦拭玻璃板表面和梳子齿。
凝固后上电泳仪前将夹子、胶条、梳子卸掉用水冲洗上样孔将残胶冲掉同时赶走气泡。
二、电泳
PCR 扩增产物由非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)垂直电泳分离检测。
稳定功率20W(电压200V±)，电泳时间一般1.5h，可根据产物片段大小适当调整。
1.预电泳，待凝胶聚合后，将梳子拔出，在电泳槽内加入 1×TBE，预电泳10分钟
2.上样，预电泳后，将PCR产物和loading buffer
3.5ul混合，用移液枪吸取5ul 混
合液轻轻地加入点样孔，尽量的减少加样时间，以防样本弥散。
3.接上电源进行电泳，
电泳槽和玻璃板要用夹子夹紧，否则漏缓冲液会让整个条带跑歪。
功率过高会使温度升高导致玻璃板炸裂，同时注意环境温度，天热时开空调或风扇散热。
三、染色
本实验采用银染法
1.电泳结束后，切断电源，倒去电泳缓冲液，卸去玻璃板，去掉胶条。
2．在托盘中加入固定液100ml/块胶。
将整版胶小心放入溶液中（要没过胶），水平摇床上摇2min。
3.加入1ml 20% 硝酸银溶液，8—10min。
后倒掉溶液，加清水洗一次。
4.托盘中加入显影液100ml/块胶，于摇床震荡至显色。
5.将洗干净的凝胶放在保鲜膜上包好，以备统计带型和照相。
染色效果(烟草SSR标记)
1.多块胶同时染时要多好记号，点样顺序也要明确，例如可在开始点样一侧切去一角作
为记号。
2注意防止胶破损，操作时小心。
可适当增加丙烯酰胺浓度。
3加硝酸银和显影液事不要直接对着胶加，容易把胶染花掉，建议顺着托盘边缘缓慢加入
4硝酸银用量，过多浪费，过少颜色太浅
5显影液中甲醛不宜过多，否则背景会很深。
显影液 100ml/块胶
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
配方
水稻indel标记所用胶条和梳子
本实验室变性胶一般为大玻璃板，可重复点样。
胶条和梳子均是塑料薄片制成，所以胶很薄，制胶时底板涂亲和剂(bind-sliane)盖板涂非亲和剂(repel-silane)，跑胶结束后胶粘贴在底板上。
与胶接触的玻璃板面要用酒精反复擦拭，所制胶很薄，一旦玻璃板有灰尘倒胶时会产生气泡。
染色同样用银染法。
还可以用荧光染料进行染色，染料加入pcr体系中，跑胶结束后在凝胶成像仪中观察结果（新楼一楼用此方法）。