细菌的革兰氏染色
《革兰氏染色》课件
该方法基于细菌细胞壁的构造和成分 差异，通过染色剂对细菌细胞壁的吸 附和渗透作用，显示出不同的颜色， 从而进行鉴别。
革兰氏染色中使用的试剂及其作用
结晶紫
用于初步染色，能与细 胞壁结合，形成不溶性
复合物。
碘液
用于加强结晶紫与细胞 壁的结合，使染色更明
显。
酒精
脱色剂，去除染料与细 胞壁结合的复合物，使
染色
结晶紫染色
将结晶紫染液滴加在载玻片上，覆盖 菌体，染色1-2分钟。
冲洗
用吸水纸吸去多余染液，用清水轻轻 冲洗载玻片，洗去未结合的染料。
水洗和脱色
水洗
用流水冲洗载玻片，洗去未结合的染料。
脱色
将载玻片放入脱色液中染液滴加在载玻片上，覆盖菌体，复染1-2分钟。
色或粉红色。
03
革兰氏染色的操作步骤
涂片
涂片
将待染色的菌体轻轻涂布在载玻 片上，确保菌体均匀分布。
干燥
将涂有菌体的载玻片放在室温下 自然干燥，避免强烈气流或直接 阳光照射。
固定
火焰固定
通过短时间轻触载玻片边缘，用火焰迅速固定菌体，使其与载玻片粘附。
冷却
将固定后的载玻片放在干净的桌面上自然冷却。
染色时间
染色时间过长或过短都会影响 染色效果和观察结果。
脱色时间
脱色时间过长或过短都会影响 染色效果和观察结果。
染色方法
不同的染色方法可能会影响染 色效果和观察结果。
05
革兰氏染色的应用和意 义
在医学诊断中的应用
01
鉴别细菌种类
革兰氏染色是鉴别细菌种类的重要方法之一，通过染色结果的不同可以
将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，有助于医生对感染进
细菌革兰氏染色
05
革兰氏染色的注意事项与局限性
染色过程中的注意事项
染色时间
染色时间对染色结果的影响较大，过短或过长的 染色时间都可能导致染色效果不佳。
涂片厚度
涂片过厚或过薄都会影响染色效果，需保持适当 的涂片厚度。
脱色程度
脱色时间与脱色剂的浓度需严格控制，否则会影 响染色结果。
染色液的新旧
染色液使用一段时间后，颜色会变淡，影响染色 效果，需定期更换。
细菌革兰氏染色
目
CONTENCT
录
• 革兰氏染色的历史与发展 • 革兰氏染色的基本原理 • 革兰氏染色的操作步骤 • 革兰氏染色的结果分析 • 革兰氏染色的注意事项与局限性
01
革兰氏染色的历史与发展
革兰氏染色技术的起源
1884年，丹麦医生革兰发明了革兰氏染色法，用于 区分细菌的形态和性质。
革兰氏染色法最初用于鉴别肠道细菌，如大肠杆菌 和志贺氏菌。
革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，经过染色后菌体形态饱满，不易被 渗透，呈现出比较清晰的紫色或蓝紫色。
革兰氏阴性菌的染色结果
红色或淡红色
革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，经过革兰氏染色后呈现红色或淡红色，这是由于 其细胞壁较薄，容易渗透染色液，与碘液结合形成复合物，呈现出红色或淡红 色。
菌体形态透亮
由于革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，经过染色后菌体形态透亮，容易观察其形态 特征。
03
革兰氏染色的操作步骤
涂片
取洁净的载玻片，在中央涂一薄层琼 脂，用接种环取少量待检细菌涂布均 匀，然后迅速将涂有细菌的载玻片置 于酒精灯火焰上加热，使琼脂凝固。
冷却后将玻片翻转，用铅笔在背面画 一横线，再将玻片正面朝上放置于显 微镜载物台上。
固定
用夹子夹住载玻片一端，用火焰加热固定液（甲醇或乙醇）直至冒蒸汽，然后将 载玻片放入固定液中，持续加热1-2分钟，使细菌被固定在载玻片上。
实验三 细菌的革兰氏染色
五、作业
• 绘图
• 1．革兰氏染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图。
六、思考题
• 1、革兰氏染色成功与否需要注意哪些问题？为什么？ • 2、现有一株菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴定是革兰氏阳
性菌还是革兰氏阴性菌，如何确定你的染色结果的正确性？ • 3.为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阴性？ • 4.你认为革兰氏染色中那个步骤可以省略，在什么情况下可以省
➢2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色 液被稀释而影响染色效果。
➢3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体 死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
Staphylococcus aureus
Escherichia coli Mixture of G+ and G- Bacteria
略？
革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，脂类含量高，所 以当被脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增加，使结晶紫 —碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复 染剂的红色。
三、实验材料
1、涂片染色用的细菌培养物 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌（对数生长期） 2、染色液和试剂：结晶紫（crystal violet ）、碘液（Gram’s
iodine）、95%酒精、蕃红（safranin ）、香柏油（cedar oil)、擦 镜液 3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、酒精灯、擦镜纸、接种环、镊 子。
四、革兰氏染色的方法和步骤
➢1. 涂片：在载玻片的左、中、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左 边涂金黄色葡萄球菌，中间涂混合涂片，右边涂大肠杆菌。
细菌革兰氏染色
• 实验原理
而革兰氏染色阴性 细菌肽聚糖层很薄，含 量少，脂肪含量高，经 乙醇处理后部分细胞壁 脂类可能被溶解并改变 其组织状态，细胞壁孔 径变大或通透性增加， 不能阻止溶剂透入，酒 精将结晶紫与碘的复合 物洗脱，细菌被脱色， 经复染后染成红色，
革兰氏阴性菌细胞壁结构图
• 实验原理
所有本实验的成败关键是酒精脱色， 脱色不够将革兰氏染色阴性转变为革兰 氏染色阳性，脱色过度将革兰氏染色阳 性变成革兰氏染色阴性。其次涂片要均 匀、薄；再者菌龄也可影响染色性，菌 龄老，陈旧的细菌培养物，往往G+转变 成G-，一般做革兰氏染色用18小时左右 的细菌培养物，不要超过24小时，以免 影响染色性。
• 染色程序
涂片
干燥
固定
染色
水洗
干燥
镜检
• 结果判断
金黄色葡萄球菌
大肠杆菌
细菌革兰氏染色法
巴州质检所 阿依尼萨.艾依提
微生物中细菌是很小的生物体，无 色透明，未经染色往往不易被识别，因 此只有借助于染色法可使细菌着色，与 背景形成鲜明对比，才容易在显微镜下 观察。并且还可以通过染色的方法鉴别 革兰氏染色特性.
革兰氏染色
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定 的重要性状。它是1884年由丹麦医师 Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态，而且 还可将所有细菌区分为两大类：染色反 应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用 G+表示；染色反应呈红色的称为革兰氏 阴性细菌，用G-表示。革兰氏染色是细 菌学上最常用的鉴别染色法。
• 革兰氏染液
1、碱性染料 （美蓝、碱性复红、结晶紫 ） 2、媒染剂 （碘液 ） 3、脱色剂 （95%的乙醇） 4、复染液 （复红溶液、番红溶液、沙 黄溶液）
革兰氏染色名词解释
革兰氏染色名词解释革兰氏染色（Gram staining）是一种常用的细菌鉴定和分类方法，由丹麦细菌学家克里斯蒂安·格拉默（Christian Gram）于1884年首次提出，并被广泛应用于临床微生物学和实验室研究中。
革兰氏染色的原理是通过对细菌细胞壁的染色特性进行区分。
细菌的细胞壁在结构上分为两种类型：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏阳性菌具有厚实的胞壁，其细胞壁主要由多聚肽和多糖组成，对革兰氏染色染料结构相对稳定。
而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，含有一个内膜和一个较薄的胞壁，对革兰氏染色染料结构不稳定，容易被清洗脱色。
革兰氏染色方法通常由紫晶染液（crystal violet)、碘液（iodine）、酒精脱色液（ethyl alcohol）和洗净液（wash buffer）组成。
以下是革兰氏染色的步骤：1. 取一块无菌玻璃片，用手套或钳子夹住，然后在玻璃片上滴加一滴样本（可以是细菌培养物或分离纯培养的菌液），将细菌均匀涂抹于玻璃片上形成细菌涂片。
2. 将预先烘干的细菌涂片放置在静止的温和热环境中，使菌液完全固定在玻璃片上。
3. 将预热的紫晶染液倒在细菌涂片上，让染液覆盖整个细菌涂片，静置片上1分钟。
4. 倒掉多余的紫晶染液，用洗净液将染液冲干净。
5. 加一倍稀释的碘液在细菌涂片上，静置片上1分钟。
6. 倒掉多余的碘液，用洗净液将碘液冲洗干净。
7. 用酒精脱色液滴在细菌涂片上，进行制片人定时（通常为15-30秒），直到底色变得非常浅。
8. 倒掉酒精脱色液，用洗净液将细菌涂片冲干净。
9. 加入红粉溶液，让染料覆盖细菌涂片，静置片上1分钟。
10. 倒掉多余的红粉溶液，用洗净液将细菌涂片洗净，待片子晾干。
观察结果时，革兰氏阳性菌会呈现出紫色或蓝色，因为其细胞壁能够保留紫晶染料和碘复合物的结晶。
而革兰氏阴性菌则会呈现出红色或粉红色，因为其细胞壁无法保留紫晶染料和碘复合物的结晶，在酒精脱色过程中已经被去除。
细菌革兰氏染色
（3）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准。 （4）设定阴性和阳性对照，确保实验的可靠性。
五、思考题
讲述革兰氏染色 的原理，并指出
1 E.C和B.S分别属 于革兰氏阳性或 阴性？
当对未知菌进行 革兰氏染色时，
3 怎样能证明你的 染色技术和结果 的正确性？
致密、坚硬、多皱、不 易用针挑起，不透明。 孢子成熟后，表面粉末 状，干燥(常有土腥味)。
三、实验材料
1、制片观察：曲霉、根霉、青霉、犁头霉、 酿酒酵母
2、菌落观察： （1）霉菌：曲霉、根霉、青霉、犁头霉 （2）酵母菌：红酵母、酿酒酵母 （3）细菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 （4）放线菌：S11、S14
Heat fixing
crystal violet stain wash with water
Staining
Counterstai n with
Safranin
注意事项：
（1）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀， 固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
（2）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱色 时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不
（平板一套可打开用于显微观察，一套不用 打开用于菌落形态观察）
四．实验方法
五．水浸片观察真菌形态
1. 根霉、曲霉、青霉和犁头霉——在载玻片上滴加一滴蒸馏水，用接 种针以无菌操作方式挑取少许菌丝于蒸馏水中充分展开（借助另一 接种针），盖上盖玻片（从一边向另一边覆盖，避免产生气泡）。
2. 酵母菌——用吸管吸取一滴酵母细胞悬液，盖上盖玻片。 ● 镜检：用低、高倍镜观察细胞形态。
C.Gram（革兰）
于1884年
实验细菌的简单染色与革兰氏染色
掌握简单染色和革兰氏染色的操作方法
简单染色
将细菌涂片或培养物直接与染料混合 ，然后进行观察。操作简单，适用于 初步观察细菌形态。
革兰氏染色
一种特殊的染色方法，通过结晶紫初 染、碘液媒染、酒精脱色和沙黄复染 等步骤，将细菌分为革兰氏阳性菌和 革兰氏阴性菌两类。
出版年份：XXXX年
THANK YOU
简单染色方法简便，操作相对容易，但只能显示细菌的形态 和结构，不能提供细菌的种类信息。
革兰氏染色原理
01
02
03
04
05
革兰氏染色是一种常用 的细菌鉴别染色法，通 过使用结晶紫、碘液和 酒精等染料对细菌进行 染色，能够将细菌分为 革兰氏阳性菌和革兰氏 阴性菌两大类。
革兰氏染色的原理主要 是基于细菌细胞壁的成 分和结构不同，导致对 染料的吸附和着色能力 。
复染
将涂片浸入稀释后的伊 红或沙黄染色液中，染
色一定时间后取出。
冲洗
用清水冲洗涂片，去除 染色液。
观察
在显微镜下观察染色结 果，判断细菌是革兰氏
阳性还是阴性。
05
实验结果与分析
简单染色结果与分析
染色结果
通过简单染色法，细菌被 染上了不同的颜色，如红 色或紫色。
03
04
涂片制备
将细菌均匀涂在载玻片上，晾 干。
染色
将涂片浸入染色液中，染色一 定时间后取出。
冲洗
用清水冲洗涂片，去除染色液 。
观察
在显微镜下观察染色结果，判 断细菌类型。
革兰氏染色步骤
01
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03
涂片制备
微生物实验-革兰式染色
细菌的革兰氏染色与显微观察一、实验原理革兰氏染色原理：细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结，当用乙醇处理时，由于脱水而引发网状结构的孔径变小，通透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。
革兰氏阴性菌的细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
显微镜成像原理：现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。
显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。
在载玻片与镜头之间加滴镜油主要是为了增加照明亮度和增加显微镜的分辨率。
以油代替空气作为光的传播介质，减少光线的折射或全反射，使观察到的像更加清晰。
二、实验器材1.菌落：大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物、金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物、枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物。
2.溶液或试剂：蒸馏水、碘液、结晶紫染色液、95%酒精、番红染色液、香柏油。
3.仪器：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、镊子、擦镜纸。
三、实验步骤革兰氏染色：1.涂片取出载玻片，点燃载玻片，燃尽载玻片上的酒精和灭菌，在中间轻轻点一小滴蒸馏水，用接种环在试管的斜面培养基上，轻轻挑取少量菌体，整个过程试管口都要处在酒精灯的上方，而且速度要快，以防污染培养基。
然后在载玻片的小水滴以转圈的动作涂片，待水滴混浊后停住，等其干燥、固定。
2.初染滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于菌落上，染色1～2min ，倾去染色液，有细水从载玻片上方向下冲洗，至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。
3.媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。
4.脱色将载玻片上面的水甩净，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管加95%的酒精脱色，直至流出的酒精刚好不出现蓝色，立即用水冲净酒精，将载玻片上水甩净。
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金黄色葡萄球菌与大肠杆菌
六、实验思考题
1.绘出大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄 绘出大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、 绘出大肠杆菌 球菌的形态图，注明放大倍数及颜色。 球菌的形态图，注明放大倍数及颜色。 2.为什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不能 为什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不能 超过24小时 小时？ 超过 小时？ 3.你的实验结果与课本中所述是否一致？如果 你的实验结果与课本中所述是否一致？ 你的实验结果与课本中所述是否一致 不一致，试分析原因。 不一致，试分析原因。 4.当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样 当你对一株未知菌进行革兰氏染色时， 当你对一株未知菌进行革兰氏染色时 才能确保你的操作正确，结果可靠？ 才能确保你的操作正确，结果可靠？
关键点： 关键点： 严格掌握乙醇脱色程度，如脱色过度， 严格掌握乙醇脱色程度，如脱色过度， 乙醇脱色程度 则阳性菌被误染为阴性菌； 则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够 阴性菌被误染为阳性菌。 时，阴性菌被误染为阳性菌。 菌龄也影响染色结果， 菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养 也影响染色结果 时间很长，或已死亡及部分自行溶解了， 时间很长，或已死亡及部分自行溶解了， 都常呈阴性反应。 都常呈阴性反应。
另外， 另外，与细菌细胞壁的化学组成及结 构有关。 构有关。 革兰氏阳性细菌由于细胞壁肽聚糖含量高， 革兰氏阳性细菌由于细胞壁肽聚糖含量高， 脂类含量低，乙醇处理使细胞壁脱水， 脂类含量低，乙醇处理使细胞壁脱水，肽 聚糖层孔径变小，通透性降低， 聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶紫碘 复合物被保留在细胞内，细胞不被脱色。 复合物被保留
1.对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡 对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、 对大肠杆菌 萄球菌分别进行革兰氏染色。 萄球菌分别进行革兰氏染色。 2.对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌混合涂片进 对大肠杆菌、 对大肠杆菌 行革兰氏染色。 行革兰氏染色。
大肠杆菌（ 大肠杆菌（G ）
-
枯草芽孢杆菌（ 枯草芽孢杆菌（G+）
细菌的革兰氏染色法
一、目的要求
学习并掌握革兰氏染色的方法。
二、实验材料
1.菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金 黄色葡萄球菌。 2.染料：草酸铵结晶紫液、路哥氏碘 液、95%乙醇、番红液。 3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒 精灯、无菌生理盐水、香柏油、二甲 苯等。
三、基本原理
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用 的一种鉴别染色法。 的一种鉴别染色法。 1884年由丹麦医师 年由丹麦医师Gram创立。 创立。 年由丹麦医师 创立
细菌先经碱性染料结晶紫染色，再经碘液 媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的 细菌紫色不被脱去，有的可被脱去，因此 可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳 性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G）。
为观察方便，脱色后再用一种红色染料， 为观察方便，脱色后再用一种红色染料，如 碱性番红等进行复染。阳性菌仍带紫色， 碱性番红等进行复染。阳性菌仍带紫色， 阴性菌则被染上红色。 阴性菌则被染上红色。有芽孢的杆菌和绝 大多数球菌， 大多数球菌，以及所有的放线菌和真菌都 成革兰氏正反应；弧菌， 成革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数 致病性的无芽孢杆菌都成负反应。 致病性的无芽孢杆菌都成负反应。
革兰氏阴性菌细胞壁脂类物质含量高， 革兰氏阴性菌细胞壁脂类物质含量高， 肽聚糖含量较低，乙醇溶解了脂类物质， 肽聚糖含量较低，乙醇溶解了脂类物质， 使细胞壁通透性增加，结晶紫——碘复 使细胞壁通透性增加，结晶紫 碘复 合物易被抽出，于是被脱色。 合物易被抽出，于是被脱色。
再有阳性菌菌体等电点较阴性菌低， 再有阳性菌菌体等电点较阴性菌低， 在相同pH条件下进行染色 条件下进行染色， 在相同 条件下进行染色，阳性菌吸附碱 性染料较多，因此不易脱去， 性染料较多，因此不易脱去，阴性菌则相 所以染色时的条件要严格控制。 反。所以染色时的条件要严格控制。
革兰式阳性菌和革兰氏阴性菌在化 学组成和生理性质上有很多差别， 学组成和生理性质上有很多差别，染色 反应不一样。 反应不一样。 一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊 的核蛋白质镁盐与多糖的复合物， 的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与 碘和结晶紫的复合物结合很牢， 碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱 色，阴性菌复合物结合程度低，吸附染 阴性菌复合物结合程度低， 料差，易脱色， 料差，易脱色，这是染色反应的主要依 据。
四、方法与步骤
操作过程如下： 操作过程如下： 涂片→干燥 固定 草酸铵结晶紫染色 涂片 干燥→固定 干燥 固定→草酸铵结晶紫染色 水洗→路哥氏碘液媒染 （1min）→水洗 路哥氏碘液媒染 ） 水洗 水洗→95%乙醇脱色（30s） 乙醇脱色（ （1min）→水洗 ） 水洗 乙醇脱色 ） →水洗 番红复染（1min）→水洗 干 水洗→番红复染 水洗→干 水洗 番红复染（ ） 水洗 镜检。 燥→镜检。 镜检