常用蛋白交联方法及其对胶原的影响
蛋白交联度测定
百泰派克生物科技
蛋白交联度测定
蛋白质交联是一种结合使用特定的蛋白交联剂和质谱（MS）检测来揭示蛋白质和相互作用蛋白质复合物的结构特征的方法，该方法促进了蛋白相互作用分析中已建立方法和生物信息学工具的发展。
蛋白交联度是指蛋白交联后相邻两个交联点的平均相对分子质量，蛋白交联度是表征蛋白交联程度的关键指标，可采用溶胀平衡法和动态扭振法等方法来测定蛋白交联度。
通过测定蛋白交联度可用于评估蛋白交联剂的交联程度及其作用效果，蛋白交联度是提高蛋白交联程度的重要挑战之一。
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion质谱平台，Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC技术提供交联法蛋白相互作用分析服务，该服务包括体内交联、体外交联、化学交联和光敏交联等，以解析蛋白的空间结构、体内瞬时蛋白质相互作用以及稳定的相互作用等。
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EDC_NHS交联对胶原物理化学性能的影响_王迎军
华南理工大学学报(自然科学版)第35卷第12期Journal of Sou th C hina U n iversity of TechnologyV ol .35 N o .122007年12月(N atu ral Science Edition )D ecem ber 2007文章编号:10002565X (2007)1220066205 收稿日期:20072052253基金项目:国家“973”重大基础研究项目(2005C B623902);广东省自然科学基金团队项目(4205786) 作者简介:王迎军(19542),女,教授,博士生导师,主要从事生物医用材料和组织工程材料研究.E 2mail:i m wangyj@scut .edu .cnE DC /NHS 交联对胶原物理化学性能的影响3王迎军 杨春蓉 汪凌云(华南理工大学材料科学与工程学院,广东广州510640)摘 要:为了提高胶原的物理化学性能,采用12乙基232(32二甲基氨丙基)2碳化二亚胺(EDC )和N 2羟基琥珀酰亚胺(NHS )交联剂对胶原进行交联,考察了不同交联剂浓度对胶原物理化学性能的影响,并通过红外、差示扫描量热分析(DSC )、吸水率、膨胀动力学、抗酶解性能、扫描电镜(SE M )等技术手段对胶原交联前后的性能进行表征.研究结果表明,胶原经E DC /NHS 交联后,热稳定性、形态稳定性增强,抵抗酶解的能力显著增加,胶原的显微结构由交联前的无序状态变为紧密有序的结构.说明E DC /NHS 交联可有效改善胶原的物理化学性能.关键词:胶原;交联;物理化学性能;12乙基232(32二甲基氨丙基)2碳化二亚胺;N 2羟基琥珀酰亚胺中图分类号:O 636.1;T Q 314.4 文献标识码:A 胶原具有天然的低毒性、低抗原性、低免疫性、可引导细胞再生以及与人体相容性好的优点,被广泛应用于生物医学材料和临床医疗领域[122].但未经交联处理的胶原支架往往具有降解速率过快、易发生收缩形变以及机械性能不足等缺点,无法满足组织工程支架的要求.目前,胶原支架稳定化处理的方法主要是通过物理或化学的方法对支架进行交联.其中,物理方法有真空干热交联、紫外(UV )和γ射线交联等,这些方法的优点是不引入有毒化学物质,能保持胶原良好的生物相容性,但单独采用物理交联往往不能获得均一的、理想的交联强度,因此化学交联方法得到更为广泛的应用.常见的化学交联剂有醛类(甲醛、戊二醛等)、碳化二亚胺类、双环氧类物质以及氰异酸盐等[324].其中,戊二醛是一类广泛应用于胶原基生物材料的交联剂,能降低胶原支架的抗原性,但是戊二醛交联剂存在降低胶原支架生物相容性和易导致胶原支架钙化等潜在的危险.研究表明,即使戊二醛残留质量浓度低至310mg/L 时仍有毒性,其未发生反应的官能团或胶原在酶的作用下发生降解时所释放的这些官能团均可能引起细胞毒性反应[5].利用碳化二亚胺,特别是12乙基232(32二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC )交联胶原生物医学材料,要优于醛类交联剂.碳化二亚胺只是帮助胶原分子的羧基和氨基之间形成酰胺键,而本身并没有成为实际交联的一部分,碳化二亚胺首先是和羧基偶合形成一个O 2异酰基脲结构,这一活化中间物受到NH 2基团进攻形成酰胺交联,而活化中间物可以消除并被清洗掉.E DC 交联剂具有无毒、生物相容性良好的特点,并且EDC 交联的胶原基支架表现出更为优异的细胞相容性,该类交联剂得到各国研究者的广泛关注[6].本实验选用无毒、生物相容性良好的E DC /NHS (N 2羟基琥珀酰亚胺)作为胶原的交联剂,并对交联前后胶原的物理化学性质及显微结构特征进行比较研究.1 实验1.1 主要材料I 型牛胶原溶液,pH =412,浓度为518%,由广州创尔公司提供.12乙基232(32二甲基氨丙基)碳二亚胺(C 8H 17N 3·HCl )和N 2羟基琥珀酰亚胺(C4H5NO3)分别由上海吉尔生化公司和上海伯奥生物科技有限公司提供.以22(N2吗啡林)乙撑磺酸(MES,C6H13NO4S)为缓冲剂,由上海源聚生物科技有限公司提供.L2羟脯氨酸由上海普博欣公司提供.1.2 胶原交联将胶原溶液置于低温冰箱(VXE380型,法国Jouran公司)中,在-80℃下冷冻12h后,转入冷冻干燥机(ALPHA224型,德国Christ公司)中,在真空状态下冷冻干燥24h,直至完全脱水,得到胶原网络基质.再将此干燥胶原基质浸入不同浓度的E DC溶液中,将NHS按nEDC ∶nNHS为4∶1的量加入,以MES为缓冲剂调pH值至515.4℃下放置24h,再用011mol/L的Na2HP O4溶液浸泡1h,经去离子水清洗后在真空状态下冷冻干燥至完全脱水.1.3 胶原交联特征分析1.3.1 胶原的红外光谱表征用Vect or33型傅立叶变换红外光谱仪(德国B ruker公司)测定胶原的红外光谱.1.3.2 胶原的交联度测定胶原的交联度根据Bubins的方法测量[7].利用三硝基苯硫酸(T NBS)和氨基酸官能团的化学反应,通过检测其紫外吸光度值来测量交联胶原基质中自由氨基数量,以自由氨基数量的变化来表征胶原的交联度.1.3.3 胶原交联前后的变性温度采用差示扫描量热分析法(DSC)比较胶原交联前后的变性温度.本测试在德国NETZSCH公司生产的204F1型差示扫描量热分析仪上进行,准确称取一定量(5～6mg)的样品于DSC铝坩埚中,坩埚加盖密封后,以空坩埚作为参比,从293K加热至473K,升温速率5K/m in,样品室的氮气流量20mL/m in. 1.3.4 胶原交联前后的吸水率将干燥胶原样品(质量为m)浸泡于磷酸缓冲溶液(P BS)(pH=714)溶液中24h,用滤纸吸去表面水分直至无液体滴下,称重为m1.吸水率W的计算公式为W=[(m1-m0)/m0]×100%.1.3.5 胶原交联前后膨胀动力学特征膨胀动力学测试以小分子的乙酸为浸透介质.所用胶原基质样品为圆片状,在25℃条件下,将胶原基质浸入015mol/L的乙酸溶液,于不同时间记录圆片的体积变化.1.3.6 胶原交联前后酶解稳定性(1)羟脯氨酸标准曲线的测定精密吸取L2羟脯氨酸的标准母液(质量浓度分别为110、210、310、410、510μg/mL)210mL于试管中,各加入0105mol/L的对甲苯磺酰氯胺钠110mL,摇匀,于室温放置氧化20m in后,加315mol/L的高氯酸溶液110mL,摇匀,静置5m in终止氧化.最后,加入对二甲氨基苯甲醛试剂110mL,摇匀,于60℃水浴中显色20m in,冷却后用721型分光光度计在560n m处测定吸光度值.以L2羟脯氨酸质量浓度(μg/mL)为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制出标准曲线,并回归出标准曲线方程.(2)胶原降解样品中的羟脯氨酸的测定胶原海绵基质的酶解稳定性通过体外胶原酶降解试验评价.将准确称量的的胶原海绵基质浸入一定浓度的胶原酶/P BS(pH=714)溶液中,置于37℃培养箱消化,样品每天更换培养液,在不同时间终止消化,将消化液置于冰水浴中冷却,然后于离心机中离心20m in(3000r/m in),取上清液,加浓度为6mol/L的盐酸溶液,于110℃下水解12h,用紫外-可见吸收光谱测定上清液中羟脯氨酸的含量[8].1.3.7 胶原交联前后的电镜观察应用荷兰Phili p s公司生产的30XLFEG型扫描电镜(SE M)观察交联及未交联胶原基质的形貌.对样品的观察面进行喷金,厚度约10nm.2 结果与讨论2.1 胶原交联发生机制和表征E DC可促发胶原发生交联,通过与胶原结构中冬氨酸和谷氨酸残基上的羧基进行反应形成一种促发剂———不稳定的脲衍生物,NHS通过形成更稳定的酯而增强碳二亚胺交联产物的稳定性[9210].交联过程中E DC、NHS不进入胶原基质,而是转变成水溶性的脲衍生物(如图1所示),细胞毒性很小[11213]. 图2为胶原基质交联前后的红外吸收光谱(I R)图.从图2中未交联胶原的红外谱图可以看出,3305c m-1处的吸收峰是酰胺A带的νN H伸缩(氢键),3082c m-1附近的吸收峰是酰胺B带的νN H伸缩,1688c m-1主要为酰胺基Ⅰ带中C O伸缩振动和N H弯曲振动,1559c m-1处吸收对应的是酰胺Ⅱ带C N伸缩振动和N H弯曲振动,酰胺基Ⅲ(1242c m-1)主要为N H官能团弯曲振动,强度较低.由E DC/NHS交联胶原的机制可知,胶原分子间的酰胺化使得相对应的伯氨基数减小,酰胺键增加,在图2中交联后胶原的红外光谱图中主要表现为酰胺Ⅱ带(1557c m-1)与酰胺Ⅰ带(1688c m-1)吸收峰强度比值的减小,即1557c m-1处与1688c m-1处76 第12期王迎军等:E DC/NHS交联对胶原物理化学性能的影响的吸收峰面积比值降低,上述这些吸收峰强度的变化(酰胺基Ⅱ带吸收峰强度降低,而酰胺Ⅰ带吸收峰强度变化不大)表明交联反应的发生.图1 E DC /NHS 交联胶原的机制Fig .1 Mechanis m of cr osslinking of collagen with E DC/NHS图2 胶原交联前后I R 图Fig .2 I R s pectra of uncr osslinked and cr osslinked collagen2.2 胶原的交联度胶原基质的交联度可通过调节E DC 浓度来控制.经不同浓度E DC /NHS 交联后胶原的自由氨基数与E DC 浓度的关系图如图3所示.自由氨基数与交联度成反比,自由氨基数越多,交联度越低.由图3可见,当EDC 浓度在015～2g/L 范围内,随着EDC 浓度的增加,自由氨基数呈线性降低的趋势,说明胶原的交联度在不断增加.当E DC 质量浓度超过2g/L 时,自由氨基数的降低变得很缓慢,交联度几乎不再进一步变化,这主要是当E DC 质量浓度在015～2g/L 范围内,胶原中的自由氨基几乎全部参与了交联反应,使得胶原中剩余的自由氨基数量快速降低,当E DC 质量浓度超过2g/L,交联反应慢慢达到平衡,自由氨基数的降低变得缓慢.图3 E DC 质量浓度对交联胶原中自由氨基数的影响Fig .3 Effect of the mass concentrati on of E DC on free am inogr oup s in cr osslinked collagen2.3 胶原交联前后吸水率和结构稳定性未交联胶原基质的吸水率可达到420%,如图4所示.经EDC /NHS 交联后,胶原吸水率随EDC 浓度增大而减小,当E DC 质量浓度为015g/L 时,交联胶原的吸水率为380%,当EDC 质量浓度为2g/L 时,交联胶原的吸水率减至320%,吸水率的降低与交联度密切相关,交联度越大,吸水率越低,通过对EDC 浓度的调控,可得到适宜吸水率的胶原基质.图4 不同E DC 浓度交联胶原基质的吸水率Fig .4 W ater abs or p ti on of cr osslinked collagen with differentmass concentrati on of E DC 溶胀是大分子物质吸收液体自发扩大体积的过程,通过测量胶原在乙酸溶液中的溶胀率可评价未交联及不同交联程度胶原在乙酸溶液中的形态稳定性.从图5可以看出,未交联的胶原浸入乙酸溶液15m in 后达到饱和,30m in 后完全溶解在乙酸溶液中.相比之下,交联样品的体积变化更小,溶解在乙酸溶液中所需的时间更长,且随着E DC 浓度的增加,溶胀率降低.当EDC 质量浓度达到2g/L 时,胶原1h 后仍保持着紧密结构,甚至1个月之后也未溶解.溶胀度大小反映胶原基质的交联度,溶胀度越86华南理工大学学报(自然科学版)第35卷小,交联度越高.图5 溶胀时间对胶原溶胀率的影响Fig .5 Effect of incubati on ti m e on s welling rati o of collagen 实验观察到胶原的溶胀过程大致分为两步:首先,胶原吸收乙酸后其结构达到饱和状态;其次,乙酸侵蚀胶原,使其体积扩张直至溶解.胶原经EDC /NHS 交联后其结构更加稳定,使得溶胀率降低,这与文献报道的结论相一致[14215].2.4 胶原交联前后热稳定性在胶原材料的研究中,DSC 被广泛应用于测量胶原的变性温度(T d ).变性温度是胶原熔点温度的间接反映,每一种胶原都有其特定的熔点温度.变性温度的大小由几方面因素决定:如胶原交联程度和结晶度、胶原纤维的有序性等,通过比较胶原在交联前后T d 的变化来表征胶原稳定性的不同.胶原的变性主要是由于胶原材料中两交联点区域内的三股螺旋结构向无规线团结构的改变,当胶原处于高温环境时,维持其三股螺旋结构稳定性的非共价结合力受到破环,导致胶原分子的解缠绕,分子结构从有序折叠态变为无规卷曲态,天然构象被破坏.而共价交联能有效增加胶原材料内的共价交联点,降低交联单元的尺寸,从而提高胶原的变性温度.表1给出了胶原交联前后的变性温度.未交联的胶原基质T d 值为32712K,经E DC /NHS 交联后,随着E DC 浓度的增加,胶原基质的T d 值大幅度增表1 经E DC /NHS 交联后胶原基质的变性温度Table 1 T d of collagen sa mp les cr osslinked by E DC /NHS 样品编号E DC 质量浓度/(g ·L -1)T d /K10327.220.5331.63 1.0335.342.0340.2大.当E DC 质量浓度为2g/L 时,T d 值达到34012K,说明EDC /NHS 交联可通过增加胶原基质的交联密度来提高其热稳定性.2.5 胶原交联前后体外降解性能胶原降解后产生含羟脯氨酸的小分子肽和游离的羟脯氨酸,通过检验含羟脯氨酸的小分子肽链来确定胶原的损耗.因胶原中羟脯氨酸是肽链上的脯氨酸经羟化作用而形成的,而分解所释放的羟脯氨酸不能重新合成胶原,所以羟脯氨酸的小肽段的出现可正确反映胶原的降解情况.羟脯氨酸氧化后,其所形成的产物结构类似于吡咯氧化物,它能与艾氏试剂(对二甲氨基苯甲醛)缩合而形成红色的产物,通过比色法测定胶原的降解情况.采用721型分光光度计测定所配制的羟脯氨酸标准溶液在560n m 处的吸光度,测得羟脯氨酸标准品的质量浓度ρ(μg/mL )与吸光度D 的线性标准曲线方程为:ρ=012694+2819722×D ,相关系数r 2=019978,利用此方程可通过吸光度求得胶原消化液羟脯氨酸的含量,如图6所示.图6 降解时间对羟脯氨酸质量浓度的影响Fig .6 Effect of degradati on ti m e on the mass concentrati on ofhydr oxyp r oline 从未交联的胶原酶解曲线来看,到第3天,胶原的降解已经达到平衡,说明未交联的胶原基质的酶降解期大约为3～4天.用E DC /NHS 交联后,降解的羟脯氨酸浓度降低,说明交联剂对胶原发生了作用,在胶原分子间形成了有效的交联.低的交联剂浓度对胶原的交联作用有限,可能只是对胶原基质表面进行了交联,因而导致降解趋势随时间增加而增大,而不是趋于缓和.随着交联剂浓度的增大,降解的羟脯氨酸浓度进一步降低.可以看出,经EDC /NHS 交联后,胶原基质被胶原酶降解的羟脯氨酸含量大幅度降低,表明EDC /NHS 交联能有效地提高96 第12期王迎军等:E DC /NHS 交联对胶原物理化学性能的影响胶原的抗酶解能力,延缓了胶原的降解时间.这主要是由于交联作用使酶无法和胶原分子充分接触,酶的分解只能在胶原分子的表面进行,因此减缓了胶原的降解.2.6 胶原交联前后显微结构胶原基质交联前后的结构特征如图7所示.由图7可见交联后其结构更加紧密有序,呈现相互连接、平行排列的高度多孔状结构,孔径在100到200μm 之间.这种高度有序的结构可以使生物材料具有更好的生物相容性、更高的细胞识别能力以及更强的抗降解能力[16217].E DC /NHS 通过交联提高胶原基质稳定性的同时,又保持了胶原基质的三维多孔结构,说明EDC /NHS 是一种优良的交联剂.图7 胶原基质交联前后SE M 图Fig .7 SE M phot os of uncr osslinked and cr osslinked collagen3 结论从以上实验可以看出,采用EDC /NHS 作为交联剂对胶原进行交联处理,发生了交联反应,胶原的变性温度和抗酶解能力提高,吸水率和溶胀率降低,同时交联后的胶原微结构更加紧密有序,说明其热稳定性和结构稳定性增强,具备更优良的性能,可在医学上得到更广泛的应用.参考文献:[1] 刘白玲.胶原在生物医学领域的应用[J ].皮革科学与工程,1999,9(3):36242.L iu Bai 2ling .App licati on of collagen 2based materials in bi omedicine [J ].Leather Science and Engineering,1999,9(3):36242.[2] 王迎军,赵晓飞,卢玲,等.角膜组织工程支架壳聚糖-胶原复合膜的性能[J ].华南理工大学学报:自然科学版,2006,34(8):125.W ang Ying 2jun,Zhao Xiao 2fei,Lu L ing,et al .Perf or mance of chit osan 2collagen blend me mbrane as cornea tissue en 2gineering scaffold [J ].Journal of South China University of Technol ogy:Natural Science Editi on,2006,34(8):125.[3] Khor E .Methods for the treat m ent of collagenous tissues f orbi op r ostheses [J ].B i o materials,1997,18(2):952105.[4] Ray mond Z,Pieter J D,Van W ache m P B,et al .Succes 2sive epoxy and carbodii m ide cr oss 2linking of der mal sheep 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layers.The results show that(1)si m ilar t o that in pure liquid Zn,the diss oluti on of s olid N i in liquid Zn containing Fe may result in the for mati on ofγ2N i2Zn5and δ2N iZn8phase layers;(2)s omeΓ22Fe5Zn6N i89particles may for m in the liquid near the s olid/liquid interface due t o the existence of Fe;and(3)the diss oluti on p r ocess of N i in the liquid Zn unsaturated with Fe is si m ilar t o that in pure liquid Zn and is g overned by a m ixed contr ol mechanis m inv olving the diffusi on of nickel at om in N i2Zn all oy layers and the che m ical reacti on at the interfaces,while the diss oluti on rate of N i in the liquid Zn supersaturated with Fe is mainly contr olled by the diffusi on of N i at o m acr oss a concentrati on boundary layer.It is thus concluded that the existence of Fe in liquid Zn accelerates the diss oluti on of s olid N i.Key words:s olid phase;liquid metal;diss oluti on;nickel;zinc (上接第70页)[16] Junquiera L C,B rentani R B.A si m p le and sensitivemethod f or the quantitative esti m ati on of collagen[J].Anal B i oche m,1979,94(1):96299.[17] Tsai C L,H su S H,Cheng W L.Effect of different s ol2vents and cr osslinkers on cyt ocompatibility of Type II collagen scaff olds f or chondr ocyte seeding[J].A rtif O r2 gans,2002,26(1):18226.I nfluence of E DC/NHS Crossli n ki n g on Physi coche m i calProperti es of Coll agenW ang Ying2jun Yang Chun2rong W ang L ing2y un(School of Materials Science and Engineering,S outh China Univ.of Tech.,Guangzhou510640,Guangdong,China)Abstract:I n order t o i m p r ove the physicoche m ical p r operties of collagen,12ethyl232(32di m ethyl a m inop r opyl)car2 bodii m ide(E DC)/N2hydr oxysuccini m ide(NHS)was used as a cr osslinking agent f or collagen matrices,and the effect of cr osslinking agent dosage on the physicoche m ical p r operties of collagen was investigated.Then,the mea2 sure ments of FT2I R,DSC and SE M were perf or med and the water abs or p ti on,the s welling rati o and the collagenase resistance were tested t o characterize the physicoche m ical p r operties of the collagen bef ore and after the cr osslink2 ing.The results de monstrate that,after the cr osslinking,the ther mal stability,the mor phol ogical stability and the enzy matic resistance all i m p r ove significantly,and that the dis ordered m icr ostructure of collagen changes t o a dense and ordered state.It is thus concluded that the E DC/NHS cr osslinking greatly i m p r oves the physicoche m ical p r o2 perties of collagen.Key words:collagen;cr osslinking;physicoche m ical p r operty;12ethyl232(32di m ethyl a m inop r opyl)carbodii m ide; N2hydr oxysuccini m ide。
交联方法对草鱼皮胶原蛋白海绵性能的影响
交联方法对草鱼皮胶原蛋白海绵性能的影响汪海波;梁艳萍;李云雁;王敏;方成;汪海婴【摘要】In this study, the effect of crosslinking method on biological properties of grass carp skin collagen sponge was discussed. Collagen was extracted from skin of grass carp ( Ctenopharyngodon idellus) and collagen sponge was prepared from this collagen. Then,this collagen sponge was crosslinked with different methods,such as UV, dehydrothermal, EDC/NHS and glutaraldehyde crosslinking processes. At the same time, the biological and mechanical properties of those collagen sponges, including degree of crosslinking, denaturation temperature,tensile strength and enzymatic sensitivity in vitro,were evaluated and compared. Experiment results indicated that the grass carp skin collagen was type I collagen. The degree of crosslinking of different crosslinking methods decreased in the order of glutaraldehyde (72. 0% ) > EDC/ NHS(32. 5% ) > dehydrothermal(29. 9% ) > UV( 15. 6% ). Compared with control collagen sponges,the denaturation temperature (67. 4 ℃), tensile strength ( 125. 6 kPa)and enzymatic sensitivity in vitro of collagen sponges crosslinked by glutaraldehyde were significantly improved ( P < 0.05 ); EDC/NHS crosslinking could lead to obvious increasing in denaturation enthalpy (6. 86 J/g)and moderate improving on tensile strength (98.6 kPa) and enzymatic sensitivity for collagen sponge ( P < 0.05). The changes of biological and mechanical properties of collagen sponges after being crosslinked by dehydrothermal and UV crosslinkingprocesses were not notable. The results of FTIR showed that glutaraldehyde crosslinking could improve properties of collagen sponges by forming new covalent bond in triple helix structure of collagen, while EDC/NHS crosslinking do that by forming new hydrogen bonds among collagen molecules. This research shows that glutaraldehyde and EDC/NHS crosslinking could lead to obvious improvement in properties of collagen sponges but the influences on properties of collagen sponges after being crosslinked by dehydrothermal and UV crosslinking processes were limited.%为探讨不同交联方法对草鱼皮胶原蛋白海绵材料性能的影响,实验以草鱼鱼皮为原料,提取、纯化胶原蛋白并制备胶原海绵材料.在此基础上,分别用紫外交联、热交联、戊二醛交联以及EDC/NHS交联方法处理胶原海绵,通过测定材料的交联度、热变性温度、拉伸强度和体外抗酶降解性能,比较了不同方法的交联效果.结果发现,提取所得的草鱼皮胶原蛋白为典型的Ⅰ型胶原；经不同方法交联处理后,海绵材料交联度依次为戊二醛(72.0％) ＞EDC/NHS(32.5％)＞热交联(29.9％)＞紫外交联(15.6％)；与对照胶原材料相比,戊二醛处理后,胶原材料的热变性峰值温度(67.4℃)、最大拉伸强度(125.6 kPa)和体外抗酶降解性能均有显著提升(P＜0.05)；EDC/NHS处理后,胶原材料的热变性焓显著提升(6.86 J/g),同时材料的拉伸强度(98.6 kPa)和体外抗酶降解性能也得到适度增加(P＜0.05).紫外交联和热交联对草鱼皮胶原材料性能的改善作用比较有限,并可能导致胶原分子的部分变性.红外光谱的分析结果表明,戊二醛处理可导致草鱼皮胶原三螺旋分子内产生新的共价键交联从而使材料性能改善,而EDC/NHS处理主要导致胶原分子间产生新的氢键交联并可提高胶原材料的稳定性.研究表明,戊二醛和EDC/NHS交联能有效提高胶原海绵材料的性能,而热交联和紫外交联对材料性能的改善作用非常有限.【期刊名称】《水产学报》【年(卷),期】2013(037)001【总页数】9页(P132-140)【关键词】草鱼;鱼皮;胶原蛋白;交联【作者】汪海波;梁艳萍;李云雁;王敏;方成;汪海婴【作者单位】武汉工业学院化学与环境工程学院,湖北武汉430023;武汉工业学院化学与环境工程学院,湖北武汉430023;武汉工业学院化学与环境工程学院,湖北武汉430023;武汉工业学院化学与环境工程学院,湖北武汉430023;武汉工业学院化学与环境工程学院,湖北武汉430023;华中科技大学同济医学院,湖北武汉430030【正文语种】中文【中图分类】TS254.9胶原蛋白(collagen)是机体结缔组织(皮肤、跟腱等)中最主要的结构蛋白之一，根据其结构和功能的不同又可细分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等27种类型［1］。
蛋白交联(参考资料)
蛋白质交联方法及其应用蛋白质交联系指将小分子物质（如药物、半抗原等）或大分子物质(如酶、蛋白毒素等)以共价键的方式连接于蛋白质分子，以制备人工抗原、酶标抗体、载体释放药物、抗体导向药物和免疫毒素等。
随着放射免疫分析法、酶标免疫技术、载体药物学和导向物学的发展，蛋白质交联技术的方法和手段也不断改进和完善，并且在生物学和医学领域得到愈来愈广泛的应用。
蛋白质交联方法首先发展于人工抗原的制备研究。
自70年前Landsteiner第一次合成人工抗原以来，人们将许多没有抗原性的小分子物质(半抗原)如化学药物、神经递质和激素等与蛋白质或多糖等载体大分子共价结台；使其具备抗原性，以诱发动物产生特异性抗体，用于放射免疫分析等。
为了使放射免疫分析达到灵敏度高、特异性强的要求，前人对半抗原和蛋白质连接的方法进行了大量的研究，建立了重氮化法、戊二醛法、混合酸酐法、二异氰酸酯法及卤代硝基苯法等交联技术。
近10多年来发展起来的酶标免疫检测技术，要求制备保持酶的生物活性和抗体的免疫结合活性的酶—抗体偶合物。
常用的交联方法如戊二醛法、碳二亚胺法和混合酸酐法不可避免地要产生酶或抗体的自身交联产物或多聚物，致使交联效率降低、结合物活性减弱。
为了克服这一不足，人们发展了异型双功能交联试剂，如N—羟基琥珀酰亚胺—3—(2吡啶基二硫)—丙酸酯，以实现控制交联，提高交联反应的选择性和交联产物的均一性。
将药物与大分子载体连接，制备药物一载体结合物，以改善和控制药物在体内的转运和代谢，实现缓释给药和定向给药，提高生物利用度和治疗指数。
这是现代药物研究领域一个崭新的分支。
载体药物必须能够在体内定量、定位释放原型药物，因此要求设计pH敏感或特定酶敏感的偶联键。
导向药物的发展对蛋白质交联方法提出了更高的要求。
早在1906年，Ehrlich就提出了靶向给药的设想。
随着生物医学的发展，这一设想不断得到具体的实现。
单克隆抗体作为导向载体的出现，更使导向药物的研究成为当代药物研究中最活跃和最引人注目的领域之一，而其中研究得最广泛的是肿瘤治疗的抗体导向研究。
蛋白交联
蛋白质交联方法及其应用蛋白质交联系指将小分子物质（如药物、半抗原等）或大分子物质(如酶、蛋白毒素等)以共价键的方式连接于蛋白质分子，以制备人工抗原、酶标抗体、载体释放药物、抗体导向药物和免疫毒素等。
随着放射免疫分析法、酶标免疫技术、载体药物学和导向物学的发展，蛋白质交联技术的方法和手段也不断改进和完善，并且在生物学和医学领域得到愈来愈广泛的应用。
蛋白质交联方法首先发展于人工抗原的制备研究。
自70年前Landsteiner第一次合成人工抗原以来，人们将许多没有抗原性的小分子物质(半抗原)如化学药物、神经递质和激素等与蛋白质或多糖等载体大分子共价结台；使其具备抗原性，以诱发动物产生特异性抗体，用于放射免疫分析等。
为了使放射免疫分析达到灵敏度高、特异性强的要求，前人对半抗原和蛋白质连接的方法进行了大量的研究，建立了重氮化法、戊二醛法、混合酸酐法、二异氰酸酯法及卤代硝基苯法等交联技术。
近10多年来发展起来的酶标免疫检测技术，要求制备保持酶的生物活性和抗体的免疫结合活性的酶—抗体偶合物。
常用的交联方法如戊二醛法、碳二亚胺法和混合酸酐法不可避免地要产生酶或抗体的自身交联产物或多聚物，致使交联效率降低、结合物活性减弱。
为了克服这一不足，人们发展了异型双功能交联试剂，如N—羟基琥珀酰亚胺—3—(2吡啶基二硫)—丙酸酯，以实现控制交联，提高交联反应的选择性和交联产物的均一性。
将药物与大分子载体连接，制备药物一载体结合物，以改善和控制药物在体内的转运和代谢，实现缓释给药和定向给药，提高生物利用度和治疗指数。
这是现代药物研究领域一个崭新的分支。
载体药物必须能够在体内定量、定位释放原型药物，因此要求设计pH敏感或特定酶敏感的偶联键。
导向药物的发展对蛋白质交联方法提出了更高的要求。
早在1906年，Ehrlich就提出了靶向给药的设想。
随着生物医学的发展，这一设想不断得到具体的实现。
单克隆抗体作为导向载体的出现，更使导向药物的研究成为当代药物研究中最活跃和最引人注目的领域之一，而其中研究得最广泛的是肿瘤治疗的抗体导向研究。
胶原的提取_改性_交联及其应用
特性和易于操作等方面的性能, 往往要通过交 进行 20 至 30 分钟的静置。
联剂在胶原材料上嫁接一些生物活性物质( 通 在胶原的复合中使用可溶性 EDC 作为交
常为聚糖类物质) 来形成复合材料。此外还可以 联剂而不用其它复合方法主要有 以下几点优
— 41 —
CHINESE J. DIA L. & ART IF . ORGANS Vol. 15 No . 4 December , 2004
一个有效方法, 而且具有没有任何毒性成分存 在的优点。紫外线照射可以引起芳香的氨基酸
第一步: 用碳化二酰胺来激活硫酸软骨素 中易于反应的羧基团形成反应中介物。
残基如铬胺酸和 苯丙氨酸内不成对电子的形 第二步: 反应中介物慢慢凝结于胶原或二
成。经其照射后在相邻的胶原蛋白分子上产生 胺的氨基酸基团上来产生相应的氨基化合物。
理能降低自由氨基酸的含量并且能提高胶原的 力、胶原的弹性系数和形成孔状结构的能力。将
机械强度。
硫酸软骨素结合到胶原上是通过化学交联剂的
4. 2. 3 光辐射法 大量的研究显示紫外线或 C射线照射是引发胶原蛋白类生物材料交联的
作用, 交联剂用的是 EDC, 通过两步完成, 此外 还要用到二胺来辅助反应 。 〔46〕
酰基叠氮化合物。酰基叠氮化合物被广泛用于 性。此外在交联过程中使用乙醇一方面能对材
交联富含胶原蛋白的组织, 如心包组织。在这个 交联方法中, 胶原蛋白的天冬酰胺或谷氨酰残
料进行消毒另一方面能清除未参 加反应的物 质。通过和其它交联剂相比较, 发现 NDGA 与
基的羧基侧链基团转入到酰基迭氮化合物上, 利用和肼反应而转换生成酰基脲, 然后和赖氨 酸或羟赖氨酸残基上的伯胺基反应产生酰胺交
胶原的提取_改性_交联及其应用.1pdf
J V asc Sur g,2000,32(2):35327 Baer R P,Whitehill T E,Sarkar R,et al.Retr ov ir al-mediated tra nsduction o f endo thelial cells w ith the lac Z gene impair s cellular pro lifera tio n in v itr o and g r aft endo thelializat ion in v iv o.J V asc Sur g,1996,24(5):892胶原的提取、改性、交联及其应用徐新宇天津市泌尿外科研究所,天津 300211 摘要 胶原蛋白或称胶原是动物体内含量最丰富的蛋白质,在动物体内起支持、保护、连接等多种作用。
目前,胶原已广泛应用于医学医药工业、食品工业、日用化学品工业、生物合成及胶原修饰等领域,本文现将胶原的提取、改性、交联及其应用加以综述。
关键词:胶原蛋白 交联 提取 改性1 胶原的结构及其性质 胶原是人体和脊椎动物的主要结构蛋白,是支持组织和结缔组织(皮肤、肌腱和骨骼的有机成分)的主要组成部分。
胶原蛋白中含有大量的甘氨酸(31.4%～33.8%)、脯氨酸(11.7%～13.8%)、羟基脯氨酸(9.4%～12.5%),同时因为在胶原中羟基脯氨酸比较均一,因此测量羟基脯氨酸的量,很容易计算出胶原含量〔1〕。
胶原蛋白是一种纤维蛋白,其基本组成单元是原胶原分子。
原胶原蛋白分子结构由N-末端区域、螺旋区域和C-末端区域组成,借助于原胶原蛋白氨基蛋白酶和羧基蛋白酶分别将原胶原的N-末端和C-末端区域断裂而形成胶原蛋白。
原胶原分子定向整齐排列,分子之间通过共价键交联,形成稳定的胶原微纤维。
由结构分析了解,原胶原分子由三个自身按左螺旋排列的多肽键构成,其中两个肽键是一样的,第三个稍有不同。
这种螺旋结构的的纤维状蛋白分子量约30万左右,长达3000~,而直径仅15 ~。
一种重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶制备方法及应用
一种重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶制备方法及应用1. 引言1.1 概述本文介绍了一种制备重组III型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶的方法及其应用。
胶原蛋白和透明质酸钠是生物医学领域中常用的材料，具有广泛的应用前景。
通过将胶原蛋白和透明质酸钠进行双重交联处理，可以得到具有优秀性能和生物相容性的凝胶材料，可应用于组织工程、药物传输系统等领域。
1.2 文章结构本文共分为五个部分进行描述和讨论。
引言部分主要对文章进行概述，并介绍了文章的结构安排。
第二部分将对胶原蛋白和透明质酸钠进行详细介绍。
第三部分将详细叙述胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶的制备方法，包括原料准备、胶原蛋白交联处理以及透明质酸钠交联处理等步骤。
第四部分将对制备的凝胶样品进行性能测试与结果分析，包括物理性能测试和生物相容性评价结果分析等内容。
最后一部分为结论与展望，对本研究的主要结果进行总结，并对研究的不足之处和未来的应用前景进行展望。
1.3 目的本文的目的是介绍一种新颖的制备方法来获得胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶，并通过对其性能测试和分析，探索其在特殊应用领域中的潜在应用价值。
通过这项研究，我们希望为开发新型生物材料，改善组织工程和药物传输系统等领域的治疗效果提供有益参考和支持。
2. 胶原蛋白和透明质酸钠介绍：2.1 胶原蛋白：胶原蛋白是人体中最丰富的一种结构性蛋白质，占据总体的30%，在皮肤、骨骼、肌肉、血管和内脏等组织中起着重要的支持和连接作用。
它由三个左旋螺旋状α链构成，每个α链含有近千个氨基酸残基，并以其特殊的氨基酸序列Gly-X-Y 而闻名，其中X和Y通常为丙氨酸和羟磷酸。
胶原蛋白具有很好的生物相容性、生物可降解性和低免疫原性等优点，在医学领域得到广泛应用。
由于其天然来源具有一定局限性，因此通过基因工程技术或从动物组织中提取纯化过程中也实现了合成胶原蛋白。
2.2 透明质酸钠：透明质酸钠是一种多糖类化合物，由N-乙醇胺引起的D-葡萄糖和D-坎头糖二磷酸盐通过β-1,3-醛缩合成链呈线性结构，也被称为透明质酸、玻璃质酸或玻尿酸。