农杆菌感受态制备转化
农杆菌感受态细胞的制备及转化
农杆菌感受态细胞的制备及转化、浸润烟草1）挑取农杆菌单菌落于3 ml Sm（1000倍稀释）抗性的LB液体培养基中，28o C振荡培养过夜；2）取过夜培养菌液500μl加入到50ml的Sm抗性的LB液体培养基中，28o C振荡培养至OD600为0.5；3）5000rpm离心5min，倒掉培养液；4）加入10ml 0.15M NaCl悬浮农杆菌细胞，5000rpm 5min；5）倒掉上清，加入1ml 预冷的20mM CaCl2悬浮细胞，冰浴24h内使用，或者分装成每管200μl，液氮中速冻，保存于-70 o C备用。
取200μl感受态细胞，加入1ug质粒DNA，液氮中速冻1min，37o C水浴5min，加入1ml LB，28o C慢速振荡培养4－6h后，涂布于含有相应抗生素的固体培养基平板上，28o C 培养约48h。
挑取平板上长出的单菌落，接种于LB液体培养基（含有50μg/ml Kan和100μg/ml sm）中，28℃振荡培养过夜，碱裂解法小量提取质粒DNA，进行PCR及酶切鉴定。
用于浸润的菌液制备MMA buffer：10mmol/L MgCl2(95.21)，10mmol/L MES(195.23)，100μmol/L 乙酰丁香酮(196.20)（Acetosyringone）(MgCl2 :2g MES :2g 乙酰丁香酮:50ul)1）取单菌落接种于3ml LB（含有50μg/ml Kan和100μg/ml SM）培养基中28℃振荡培养过夜；2）取1ml活化后的菌液接入50ml LB（含有50μg/ml Kan和100μg/ml SM）中，28℃振荡培养至合适浓度OD600约0.8-1.0；3）4℃，4000rpm离心15min，沉淀用MMA buffer重悬，菌液终浓度为OD600约1.0-2.0；4）室温静置2hr以上，用1ml注射器对合适苗龄的本生烟进行浸润。
农杆菌感受态制备转化
农杆菌感受态制备转化
农杆菌感受态制备
1、划平板，单克隆培养
2、放单克隆于5mllb培养基中，挥至饱和状态（1-2day）
3、50m离心管中4500rpm，15min
4、50ml菌体用1ml氯化钙（预冷）悬浮，冰上操作
5、每100ul分装于冷冻管中，
液氮速冻后，-70℃保存
农杆菌转变
1．50ul感受态+5ul质粒，放入液氮速冻2min2．37℃热激5min
3.提1mllb，28℃培育3-4h
3.8000rpm/min去上清，200ullb悬浮，涂板吹干农杆菌抗性：利福平+庆大霉素+载
体抗性。
（gv3101）庆大霉素40mg/ml（0.4g/10ml）；利福平50mg/mldmso溶解
200mllb+200ul母液
农杆菌转回植物
1.植物去顶三天后转化，转前一天交足水
2.摇菌od600=1.2~1.6（先大挥后，挑200ul小挥200ml）
3.室温5000rpm，15min，弃上清，悬浮于等体积渗透培养基中（200ml/转化）每
1000ml渗透培养基：1/2ms2.42g；蔗糖50g；mes0.5g；用1mkoh调ph到5.8/5.7，定容
到1000ml，加10ul1mg/ml6-ba，加200ulsilwetl-7，混匀，将菌液悬浮，od=0.8左右。
不得低于0.7.
4.将菌液放入大平皿中，植株煮沸20s砌上白盆，过夜后掀开正常培育。
农杆菌感受态制备和转化：电转法和热击法
农杆菌感受态制备和转化：电转法和热击法电转法1）挑取新鲜单菌落接种到10mL YEP培养基（含50ug/ mL利福平）的试管里，28℃、200r/min培养过夜。
2）稀释2 mL培养过夜的农杆菌到含200 mL YEP培养基的500 mL三角瓶里，28℃、200r/min培养至OD600达0.5。
4℃、5000 r/min离心5分钟收集细胞。
3）用适量体积的 10%的甘油（用去离子水配置）重悬洗涤沉淀2次，洗涤时一定要轻柔地把细胞悬均匀，每次4℃、5000 r/min离心5分钟收集细胞，小心将上清倒掉。
4）将细胞重悬于1 mL 10%的甘油里，细胞可以立即使用，也可分装成每管40μL（质粒连接产物体积不能超过感受态细胞体积的1/10，否则容易爆杯），经液氮速冻后，-70℃冰箱保存备用。
5）取一管感受态细胞放在冰上融化，加入100ng DNA样品混匀，将样品放入冰上的电击杯中，按照电击仪厂商说明进行电击转化，之后涂布在含有相应抗生素的YEB平板上培养（质粒抗性+农杆菌菌株抗性）。
热击法1）挑单菌落于2 mL YEP培养基（含Rif 50mg/ mL）中28℃过夜活化；2）取2 mL过夜菌液接种于200 mL YEP培养基中28℃振荡培养生长至OD600约等于0.5左右；3）冰上放置30 min左右，5000 rpm离心5 min；4）在60 mL冰水浴预冷的无菌0.1M CaCl2溶液中中悬浮细胞；5） 5000 rpm离心5 min，悬浮细胞加入20 mL冰水浴预冷的含15%甘油的0.1M CaCl2，轻敲管壁使菌体悬浮均匀，每管200 µL 进行分装，液氮速冻后保存于-80℃待用；6）取200 µL感受态细胞，加入0.5 µg质粒DNA，液氮中速冻5 min，37℃水浴热击5min，之后迅速置于冰水浴中冷却2 min，然后加入1 mLYEB 空白培养基，28℃低速振荡培养4 hr；7） 6000 rpm离心2 min，弃部分上清，留约200 µL溶液，重悬细胞，涂布于含有相应抗生素的YEB 平板上，28℃倒置培养约36 hr。
实验三农杆菌感受态细胞制备及转化
农杆菌介导基因转化
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条 件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发 状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有 一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到 植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农 杆菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的T-
植物基因工程实验技术
实验三、农杆菌感受态细胞制备 及转化
王欢欢 二零一二.十
OD值与细菌生长曲线
I.调整期（lag phase） II.对数期( logarithmic phase)
III.稳定期（stationary phase）
IV.衰亡期（decline phase）
在对数生长期，OD值可以代表菌体密度，细菌悬液浓度与光密度成正 比，可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液浓度。但当生长 到一定时间后，OD值不会再增加.
农杆菌感受态的制备
A • 挑取农杆菌单菌落于液体培养基中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜活化
B
• 菌液按1:50的比例转接于50ml新鲜培养基中，振荡培养至OD600为0.4-0.6；
C
• 菌液转移至10 ml的离心管中，冰浴30 min
D
• 4℃，5 000 rpm离心5 min, 弃上清，收集菌体
整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化效率将会
降低。 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行， 所有的试剂都要灭菌
感受态细胞制备及转化中出现的问题
感受态长期保存要进行速冻，立即用-80 ℃冰箱或液氮速冻，而在使用 时，用37 ℃水浴或手掌体温进行速融，避免冰晶形成过程对细胞造成的 伤害，导致细胞破损不能存活。 感受态细胞不能反复冻融。 涂板后时间过长会有假阳性转化子的出现，抗生素在37℃过夜后失活， 抗生素作用是抑制未转化的感受态细胞生长，而不能将这些细胞杀死，
农杆菌感受态的制备及电击转化
农杆菌感受态的制备及电击转化（1）将农杆菌EHA105菌株在含有50 mg/l 利福平的LB固体培养基上划线，28℃培养36~48 h；（2）挑取单克隆，于10 ml 含50 mg/l 利福平的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；（3）当OD600达到0.5~0.7时，6 000 r/min 4℃离心10 min收集菌体；（4）用预冷的10%无菌甘油洗菌体3次后用2 ml预冷的10%无菌甘油重悬沉淀，分装后于-70℃保存备用；（5）取重组质粒（pROK2-LbDREB）1 μl，加入100 μl EHA105感受态细胞，混匀后冰上放置；（6）将混合液放入预冷的电击杯中，1 800 V电击；（7）电击完成后迅速取出，加入500 μl LB液体培养基，迅速吸打混匀，尽可能多的将混合液移入无菌的离心管中，28℃摇菌1 h复苏；（8）取适量菌液涂布于含50 mg/l 卡那、50 mg/l 利福平的LB固体培养基上，28℃培养36~48 h；①农杆菌感受态细胞制备a. 在新活化的农杆菌EHA105/GV3101平板上，挑取单克隆于LB液体培养基（含利福平50mg/l）中，28℃，220r/min振荡培养至OD600达到0.6-0.7；b. 取1.5ml无菌离心管，每管分装1ml菌液，6000r/min离心10min；c. 去除上清，用1ml 10%无菌甘油重悬菌体，6000r/min离心10min，重复此过程3次，充分洗涤菌体以去除残留的培养基；d. 向洗好的菌体用100μl 20%无菌甘油重悬，-70℃保存备用。
②根癌农杆菌的电击转化a. 取-70℃保存的农杆菌感受态细胞，加入100ng重组质粒（pCAM-EG），吸打混匀后移入预冷的电击杯中；b. 1800V电压电击后迅速取出电击杯，加入500μl LB液体培养基，迅速吸打混匀；c. 尽可能多的吸出电击杯中的培养基，移入到无菌1.5ml无菌离心管中，28℃，振荡培养1h；d. 取转化的菌液200μl涂布于LB固体培养基（含利福平50mg/l和卡那霉素50mg/l）平板，28℃倒置培养24-48h。
农杆菌的转化流程
农杆菌的转化流程方案一1. 农杆菌的培养及感受态的制备①农杆菌菌株划YM平板，26—28℃培养48 h;②挑取单菌落接种到40 ml 无抗生素的YM液体培养基中，250 r/min，26-28℃悬浮培养12-16 h；③将菌液转入灭过菌的50 ml离心管中，4℃，8000 r/min，离心8 min;④弃上清，加入用100 mM NaCl （4℃预冷）重悬收集的农杆菌；⑤ 4℃，8000 r/min，离心8 min;⑥弃上清，加入原始菌液1/50体积（800μ l/管（此时的感受态农杆菌可以直接用于转化）并分装成100μ l)的20 mM CaCl2重悬菌体；⑦置液氮中10 s，放入—20℃冰箱中保存备用。
2。
农杆菌的转化(冻融法)将感受态农杆菌置于冰上，加入1μg质粒DNA（体积不宜超过10 μ l），充分混匀，冰上放置30 min；②置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中，待其融化；③加1 ml 无抗生素的YM 液体培养基于28℃，230 r/min 培养2—4 h;(或直接用1 mlμl，留500 μ l于管中④ 3000 r/min 离心2 min收集菌体,将上清吸去500 培养菌直接涂布含抗生素的YM平板）；⑤重悬菌体并涂布到含有适当抗生素的YM平板上吹干，28℃培养48 h；⑥挑取单菌落接种到筛选液体YM培养基中,28℃,250 r/min 培养48 h，将菌液用于保存或转化；注：EHA105抗利福平霉素，LBA4404抗硫酸链霉素.在转化前后的所有培养基中均可加入相应的这两种抗生素，以防止杂菌污染.以上挑菌及抗生素加入工作均在超净台上进行.3．转基因烟草体系的建立⑴烟草无菌苗的培养:① 70%乙醇消毒烟草种子30 s后,用无菌水清洗两次,更换NaClO处理25—30 min，无菌水清洗四次;②将灭菌后的种子移至1/2 MS固体培养基（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4)、1。
实验三农杆菌感受态细胞制备及转化
所以涂板后无单菌落出现，出现长满板的情况为抗生素失活。
农杆菌感受态的制备
A • 挑取农杆菌单菌落于液体培养基中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜活化
B
• 菌液按1:50的比例转接于50ml新鲜培养基中，振荡培养至OD600为0.4-0.6；
C
• 菌液转移至10 ml的离心管中，冰浴30 min
D
• 4℃，5 000 rpm离心5 min, 弃上清，收集菌体
农杆菌介导基因转化
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条 件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发 状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有 一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到 植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农 杆菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的T-
E
• 菌体重悬于4ml冰预冷的20 mM的CaCl2中，冰浴10-20 min
F
• 4℃，5 000 rpm离心5 min，弃上清 • 菌体重悬于1ml冰预冷的20 mM的CaCl2，分装100µ l/管，24 h内使用或液氮速冻 后-70 °C保存
G
感受态制备的要点：
OD600：0.4～0.6 OD值超过0.6必须重新活化 当OD达到0.3时，每隔20min测一次OD值。 分光光度计要测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态，有沉淀要 摇匀。注意比色杯的正确选择及使用 光电比色法定量测试原理：朗伯比尔定律：“当一束平行单色光垂直通过某一均 玻璃比色杯只适用于可见光区,在紫外区测定时要用石英比色杯。石英玻璃在紫 匀非散射的吸光物质时, 其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比”。 外线到红外线的整个光谱波段都有较好的透光性能，可见光透过率在９３％以 其中“吸收层厚度”就是实践中的比色杯厚度，如果测试中使用的比色杯不是同 上，特别是在紫外光谱区，最大透过率可达８０以上，而普通的玻璃在紫外光 一套，就无法保证其厚度一致，也就人为导致测试结果出现偏差。 谱区的透过率较差。一般，测定波长在350毫微米以上时，可以用玻璃比色杯；
关于电激法做农杆菌的转化的问题(农杆菌,电激法,质粒)
农杆菌感受态细胞制备方法1．农杆菌稀释100倍过夜培养；3．5000rpm离心5min，弃去上清液；4．沉淀用1.5 ml 25mM CaCl2悬浮,冰浴20min；5．5000rpm离心5min，弃去上清液；6．每管用50μl CaCl2悬浮，20 min 后用于转化；7．加入质粒DNA 0.1～1μg，之后冰浴30 min；8．放入液N2中5min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；10．取出10～50μl菌液涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。
转化时一般200μl感受态细胞悬液（OD600为0.5-0.6）中加入的质粒含量不超过50ng,体积不超过10μl。
电转化步骤如下：1. 从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；2. 取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。
3. 将40～100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml 的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。
4. 打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。
5. 将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部；6. 将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1000μl的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。
7．37℃，220－250rpm复苏1小时。
8. 取20ul转化产物加160ulSOC涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。
其余菌液加1：1的30％的甘油后混匀－80℃保存。
注：每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal 80μl ，SOC 80μl，IPTG 20 μl。
电击杯清洗流程1．用清水将电击杯稍冲一下。
2．向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr。
3．弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。
4．加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30分钟。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
农杆菌感受态制备
1、划平板，单克隆培养
2、挑单克隆于5ML LB培养基中，摇到饱和（1-2day）
3、50m离心管中4500rpm，15min
4、50ml菌体用1ml氯化钙（预冷）悬浮，冰上操作
5、每100ul分装于冷冻管中，液氮速冻后，-70℃保存
农杆菌转化
1．50ul感受态+5ul质粒，放入液氮速冻2min
2．37℃热激5min
3. 加1mlLB，28℃培养3-4h
3. 8000rpm/min去上清，200ulLB悬浮，涂板吹干
农杆菌抗性：利福平+庆大霉素+载体抗性。
（GV3101）
庆大霉素40mg/ml （0.4g/10ml）；利福平50mg/ml DMSO溶解
200ml LB + 200ul母液
农杆菌转植物
1.植物去顶三天后转化，转前一天交足水
2.摇菌OD600=1.2~1.6 （先小摇后，取200ul大摇200ml）
3.室温5000rpm，15min，弃上清，悬浮于等体积渗透培养基中（200ml/转化）
每1000ml渗透培养基：1/2 MS 2.42g；蔗糖50g；MES 0.5g；用1M KOH调PH到5.8/5.7，定容到1000ml，加10ul 1mg/ml6-BA，加200ul silwet l-7，混匀，将菌液悬浮，OD=0.8左右。
不得低于0.7.
4.将菌液倒入大平皿中，植株浸泡20s盖上白盆，过夜后揭开正常培养。