离子交换层析讲解
离子交换层析名词解释
离子交换层析名词解释
离子交换层析（Ion exchange chromatography，简称IEC）是一种分析和分离离子的技术方法。
在离子交换层析中，样品溶液被注入到一个含有离子交换树脂的柱子中，离子交换树脂具有特定的离子交换基团，可以选择性地吸附和释放样品溶液中的离子。
离子交换层析的分离原理基于离子交换树脂对溶液中的离子的亲和力不同。
当样品溶液通过柱子时，带有相同电荷的离子与离子交换树脂产生吸附作用，而带有相反电荷的离子则可以自由通过。
通过调节溶液的pH值、离子浓度和离子交换树脂的性质，可以实现对不同离子的选择性分离。
离子交换层析常用于分离和纯化蛋白质、核酸和多肽等生物大分子，并且在药物研发、环境分析和生命科学研究中得到广泛应用。
离子交换层析
• 3.离子交换剂的性质. 3.离子交换剂的性质. 离子交换剂的性质 • 避免缓冲离子与交换剂上的离子发生交换, 避免缓冲离子与交换剂上的离子发生交换, • 引起pH变化,降低交换容量. 引起pH变化,降低交换容量. pH变化 • 4.缓冲液必须不影响被分离物质的测定. 4.缓冲液必须不影响被分离物质的测定. 缓冲液必须不影响被分离物质的测定
• 2.按其载体分类 按其载体分类 • (1)离子交换树脂 离子交换树脂: 离子交换树脂 • 主要有聚苯乙烯型树脂和聚酚型树脂. 主要有聚苯乙烯型树脂和聚酚型树脂 • 聚苯乙烯树脂由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成一网状 结构. 结构
• 交联剂 二乙烯苯 交联剂:二乙烯苯 • 二乙烯苯 • 交联度 交联度= ———————— ×100% • 苯乙烯+二乙烯苯 苯乙烯 二乙烯苯 • 苯乙烯和二乙烯苯混合成不同的比例就可获得不同交 联度的树脂. 联度的树脂 • 二乙烯苯相对于苯乙烯的量越大 获得的树脂交联度就 二乙烯苯相对于苯乙烯的量越大,获得的树脂交联度就 越大. 越大 • 交联度大的树脂结构紧密、孔隙小 大分子量的离子就 交联度大的树脂结构紧密、孔隙小,大分子量的离子就 不能进入树脂颗粒内发生离子交换. 不能进入树脂颗粒内发生离子交换 • 交联度的范围从 ～16% 交联度的范围从1%～
• 即溶液中的离子与离子交换剂上的功能基团交换反应 即溶液中的离子与离子交换剂上的功能基团交换反应 离子与离子交换剂上的功能基团 的过程. 的过程
离子交换过程示意： 离子交换过程示意： 起始 吸附 解吸 x+ : 起始缓冲离子 y+ ：待分离离子 z+ ：待分离离子
完成
•
带电荷量少,亲和力小的先被洗脱下来 带电荷量多 带电荷量少 亲和力小的先被洗脱下来;带电荷量多 亲和力小的先被洗脱下来 带电荷量多, 亲和力大的后被洗脱下来. 亲和力大的后被洗脱下来
离子交换层析法
五、缓冲液的选择
缓冲液酸碱度的选择，决定于被分离物质的等电点、稳定 性、溶解度和交换剂离子的pK值。使用阴离子交换纤维时要选 用低于pK值的缓冲液，若欲分离的物质属于酸性，则缓冲液的 pH值要高于该物的等电点；用阳离子交换纤维时要选用高于 pK值的缓冲液，目的物属于碱性物质的话，缓冲液要低于该物 等电点的pH值。 缓冲液离子以不干扰分离物活性测定、不影响待测物溶解 度、不发生沉淀为原则，如使用UV吸收法测样品，那么 pyridine或barbital这类会吸收UV的物质就不适用。
三、树脂的选择
最常见的离子交换树脂材质是聚苯乙烯苯二乙烯（polystyrenedivinylbenzene）， 它是由苯乙烯（styrene）和苯二乙烯 （divinylbenzene）聚合产生的三维网状结 构，举例来说，Dow化学公司所生产的树脂 Dowex 50×8，表示含8%苯二乙烯。 具体的，根据交换树脂的性能，树脂可分 为阳离子与阴离子交换树脂：
1. 阳离子交换树脂 分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型树脂含有－R－ SO3H，中强酸型树脂含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2， 弱酸型树脂含有－COOH或－OH。 阳离子交换树脂进行的反应 如下：
2. 阴离子交换树脂 分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有铵盐，四级铵盐 [ － N+(CH3)3] 为强碱型树脂，三级以下铵盐 [－N(CH3)2]、[ － NHCH3]、[ －NH2] 都属弱碱型树脂；同时具有强碱和弱碱型基 团的，为中强碱型的树脂。阴离子交换树脂进行的反应如下：
洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可 逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适 宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目 的物的位置，并回收目的物。
离子交换层析 PPT
依据胺基碱性的强弱,又可分为强碱性(含季胺基)、弱碱性 (含叔胺、仲胺基)及中强碱性(既含强碱性基团又含弱碱性基 团)三种阴离子交换剂。
它们与溶液中的离子进行交换时,反应式为:
依据电荷基团的强弱,可分为强酸型(带磺酸的基团,R－ SO3H)、中强酸型(含磷酸基团或亚磷酸基团,R－PO3H2)及 弱酸型(带羧基和酚基的树脂, R－COOH或R－苯环－OH) 三种。
这些交换剂在交换时,氢离子为外来的阳离子所取代,如下 式所示:
R－COOH＋Na+＝R－COONa＋＋H+
②阴离子交换剂
离子交换层析就是利用离子交换剂的荷电基团,吸附溶 液中相反电荷的离子或离子化合物,被吸附的物质随后为带 同类型电荷的其他离子所置换而被洗脱。由于各种离子或离 子化合物对交换剂的结合力不同,因而洗脱的速率有快有慢, 形成了层析层。
离子交换机理
❖ A+自溶液中扩散到树脂表面 ❖ A+从树脂表面进入树脂内部的
素（ DEAE-C ）
交换剂
— (CH 2 ) 2 N + H (C 2 H 5 ) 2
0.1~1.0
pH<8.6
氨基乙基纤维素 中等碱型阴离
（ AE-C ）
子交换剂
— (CH 2 ) 2 N + H 2
Ecteda 纤维素 （ ECTE-C ）
中等碱型阴离 子交换剂 — (CH 2 ) 2 N + (C 2 H 4 OH) 3
(2) 亲水性离子交换剂
与水亲和性较大,有纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖等。 ①纤维素离子交换剂
离子交换层析
离子交换层析离子交换层析是常见的层析方式之一，它以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行,广泛应用于氨基酸、多肽、蛋白质、糖类、核苷和有机酸等的分析、制备、纯化以及溶液的脱色、中和等方面。
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography 简称为IEC ）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。
带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。
离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。
由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH 条件下，其带电状况也不同。
阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。
结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。
反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH 值洗脱下来。
基本原理离子交换剂的组成 离子交换剂是由基质、电荷基团(或功能基团)和反离子构成的。
离子交换层析（固定相）的特性 在水中呈不溶解状态，但能释放反离子，同时与溶液中其他离子或离子化合物可逆性结合，并且结合后本身的理化性质不变 如：RA + B+ RB + A+ 或RA + B- RB + A-离子交换层析的原理 由于离子交换剂的选择性，对不同的离子或离子化合物有不同的结合力，所以用洗脱剂洗脱时，结合力小的先被洗脱出来，结合力大的后被洗脱下来，从而达到分离混合物的目的(离子交换剂的选择性决定其与溶液中离子的结合力大小，通常用离子交换剂与溶液中离子的反应平衡常数表示)[RB][A +]= [RB][B +] 当[A+]=[B+]时若 K B A ＞1，即[RB]＞[RA],表示离子交换剂对B+的结合力比A+ 大 若 K B A = 1，即[RB]=[RA],表示离子交换剂对B+的结合力与A+ 相等 若 K BA ＜1，即[RB]＜[RA],表示离子交换剂对B+的结合力比A+ 小 KB A 值是反映离子交换剂对不同离子的结合力或选择性的参数 规 律①强酸性阳离子交换剂对H+的结合力比对Na+小 ②强碱性阴离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-小得多 ③弱酸性离子交换剂对H+的结合力比对Na+大 ④弱碱性离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-大B AK][][RA RB KB A对于呈两性离子的蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等，与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的理化性质及在特定pH条件下呈现的离子状态。
离子交换层析
液。平衡缓冲液的离子强度和pH的选择首先要保证各个待分 离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子 交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交 换剂的结合有较大的差别。
一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。尽量使
杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。在一些情况下可以 使杂质与离子交换剂牢固地结合，而样品与离子交换剂结合 不稳定，也可以达到分离的目的。
离子交换层析的基本操作
（1） 层析柱
离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，
离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和 柱长比一般为1:10到1:50之间，层析柱安装要垂直。装 柱时要均匀平整，不能有气泡。
装柱用于平衡离子交换柱的缓冲
■ 胶体的组成与外型：
Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods p.24
Cellulose Sephcel Monobead
Pharmacia (1980) Separation News: 5
离子交换剂的选择、处理和保存
Buffer: 0.01 M Tris-HCl, pH 8.0
mg / mL gel
Adapted from Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods p.64
影响交换容量的因素很多，主要可分为两个方面。
换剂上的样品组份洗脱下来。
柱效
通过柱子分离得到窄而对称的洗脱峰的能力（分辨率）
装柱的质量
树脂颗粒的大小
正确的洗脱条件
第四节 离子交换层析(第二章)
1、原理
生物大分子如蛋白质、核酸等多价电解质有不 同的分子大小及电荷排列方式。离子交换剂是通 过化学键合的方法向惰性支持物上连接可解离的 化学基团后的产物。可人为选择性地使其带有正 电荷或负电荷。当在一定pH下净电荷为负的蛋白 质分子可通过静电键结合到带正电荷的离子交换 剂(称为阴离子交换剂)上；反之，称为阳离子交 换剂。 大分子依其与离子交换剂亲和力的不同， 而在以不同牢度被吸附于离子交换剂，通过改变 离子强度或(和)pH使大分子再从离子交换剂上先 后被洗脱下来。
最高分辨率，细 颗粒，小制备量 (g/run, mg/run).
高分辨率，中等颗 粒度(30-40 m)。 可以扩大制备量。 一般分辨率，较大 制备量，较大颗 粒度(60-90 m)。 低分辨率，快速大 容量，大颗粒度 (90-200 m)
最高分辨率，细 颗粒，小制备量 (g/run, mg/run).
脱液的离子强度和pH值，这样各种氨基酸将以不 同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。全自 动氨基酸分析仪就是采用这种原理制成。
3)分离纯化生物大分子物质 离子交换层析是依据物质的带电性质的不 同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物 大分子的一种重要手段。
由于生物样品的复杂性，一般很难只经过一次 离子交换层析就达到高纯度，往往要与其它分离 方法结合使用。 使用离子交换层析分离样品要充分利用其 按带电性质来分离的特性，只要选择合适的条件， 通过离子交换层析可以得到较满意的分离效果。
6）样品的浓缩、脱盐 离子交换层析得到的样品往往盐的质量分 数较高，而且体积较大，样品质量分数较低。所以 一般离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处 理。
柱层析装置：
层析柱、部分收集器、磁力搅拌器、恒流泵、检测器
离子交换层析法的原理
离子交换层析法的原理
离子交换层析法是一种根据物质带电性质差异，从而实现分离纯化的层析技术。
该方法的原理是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子的溶液为流动相，利用离子交换剂对需要分离的各种蛋白质结合力的差异，而将混合物中不同蛋白质进行分离。
离子交换的本质是目标物和介质功能配基之间的静电相互作用，蛋白质的带电性是由蛋白质多肽中带电氨基酸决定的，而蛋白质中氨基酸的电性又取决于介质中的pH，所以蛋白质的带电性也就依赖于介质的pH。
层析时，离子交换树脂的分子中有活性基并带有阴、阳电荷，在水溶液中可与其它阴、阳离子起交换作用，这种交换作用是可逆的，遵循化学平衡原理。
通过连续添加洗脱液，溶液平衡向右进行，可以把原有离子交换树脂上的活性离子洗脱下来，而带有相同电荷的离子被交换吸附在树脂上，然后被吸附的物质又可用另一种洗脱液洗下来，从而达到分离提取的目的。
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三、离子交换剂的种类和性质 1.离子交换剂的基质
• 其中：聚苯乙烯离子交换剂（又称为聚苯乙烯树脂）是以
苯乙烯和二乙烯苯合成的具大、流速快。但它与 水的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白的变 性。故一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、 核苷酸等。 以纤维素（Cellulose）、球状纤维素（Sephacel）、葡聚 糖（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）为基质的离子交 换剂都与水有较强的亲和力，适合于分离蛋白质等大分子 物质，葡聚糖离子交换剂一般以Sephadex G－25和G－50 为基质，琼脂糖离子交换剂一般以Sepharose CL－6B为基 质。关于这些离子交换剂的性质可以参阅相应的产品介绍。
离子交换层析
原理及应用
一、简介
• 1、定义：
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换 剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交 换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力 大小的差别而进行分离的一种层析方法
2、发展历程
• 1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交
二、基本原理 阴离子交换
• 通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子
强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加， 洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上 的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置 换出来，随洗脱液流出。 与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来， 而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度 才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与 离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下 来，从而达到分离目的。
X+ Y-↔ A-
二、基本原理
• 从上面的反应式中可以看出，如果A离子与离子交 •
•
换剂的结合力强于Y离子，或者提高A离子的浓度， 或者通过改变其它一些条件，可以使A离子将Y离 子从离子交换剂上置换出来。 也就是说，在一定条件下，溶液中的某种离子基 团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结 合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就 是离子交换层析的基本置换反应。 通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶 液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交 换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。
•
三、离子交换剂的种类和性质 2.离子交换剂的电荷基团
• 根据与基质共价结合的电荷基团的性质，
可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴 离子交换剂。 • 阳离子交换剂的电荷基团带负电，可以交 换阳离子物质。 • 阴离子交换剂的电荷基团带正电，可以交 换阴离子物质。
• •
换过程中发现离子交换现象。 本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯 乙烯离子交换树脂。 50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用 于氨基酸的分析。 目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一 种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基 酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。
•
二、基本原理
二、基本原理
• 离子交换剂的电荷基团对不同的离子有不同的结合力。 • 一般来讲，离子价数越高，结合力越大；价数相同时，原
• •
子序数越高，结合力越大。如阳离子交换剂对离子的结合 力顺序为：Li+ 蛋白质等生物大分子通常呈两性，它们与 离子交换剂的结合与它们的性质及pH有较大关系。 以用阳离子交换剂分离蛋白质为例，在一定的pH条件下， 等电点pI高于pH的蛋白带正电，能与阳离子交换剂结合， 一般pI越高的蛋白与离子交换剂结合力越强。 而实际上，由于生物样品的复杂性以及其它因素影响，一 般生物大分子与离子交换剂的结合情况较难估计，往往要 通过实验进行摸索。
• 离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离
• •
子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。 离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一 类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的 化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。 离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、 电荷基团和平衡离子。
二、基本原理
二、基本原理
• 其中R代表离子交换剂的高分子聚合物基质； • X- 和X+ 分别代表阳离子交换剂和阴离子交
换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基 团，Y+ 和Y- 分别代表阳离子交换剂和阴离 子交换剂的平衡离子； • A+ 和A- 分别代表溶液中的离子基团。 • （如下图）：
示意图：
R
XY+↔ A+
二、基本原理 阴离子交换
• 阴离子交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，
•
与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。 待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性 基团。加样后，负电基团可以与平衡离子进行可 逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电 基团和中性基团则不能与离子交换剂结合，随流 动相流出而被去除。
•
二、基本原理
• 各种离子与离子交换剂上的电荷基团的结合是由
• •
静电力产生的，是一个可逆的过程。 结合的强度与很多因素有关，包括离子交换剂的 性质、离子本身的性质、离子强度、pH、温度、 溶剂组成等等。 离子交换层析就是利用各种离子本身与离子交换 剂结合力的差异，并通过改变离子强度、pH等条 件改变各种离子与离子交换剂的结合力而达到分 离的目的。
三、离子交换剂的种类和性质
• 可三方面性质对离子交换剂进行分类： • 1.离子交换剂的基质 • 2.离子交换剂的电荷基团 • 3.交换容量
三、离子交换剂的种类和性质
• 1.离子交换剂的基质 • 离子交换剂的大分子聚合物基质可以由多
种材料制成，如：聚苯乙烯离子交换剂、 纤维素（Cellulose）、球状纤维素 （Sephacel）、葡聚糖（Sephadex）、琼 脂糖（Sepharose）等等。
• 电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带
• •
电的可进行离子交换的基团。 平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能 与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。 平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子 基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离 子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生 交换作用，称为阴离子交换剂