Western-Blotting实验报告(优选.)
实验报告三--免疫印迹
实验三：免疫印迹1 原理免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
本试验采用湿法转移。
免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。
大多数应用前者。
本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。
转移结束后，蛋白质的检测可分成三个步骤进行：首先，将膜同特异性抗体孵育数小时或过夜，然后将膜同可特异性识别上述抗体（一抗）的第二抗体（二抗）孵育，通常二抗连接有如辣根过氧化物酶等标记物。
目的蛋白可由该酶催化的显色反应在膜上形成有色产物加以检测。
本实验用的是酶标抗IgG，故不加一抗。
2 试剂与仪器2.1 试剂（所有试剂均供两组用）2.1.1 转移缓冲液Tris 3.025g甘氨酸14.413g甲醇20mL加蒸馏水约800mL，调pH至8.3，定容1000mL2.1.2 Tris缓冲盐溶液(TBS)Tris 2.42gNaCl 27.750g加蒸馏水约800mL，调pH至7.5，定容1000mL2.1.3 TTBSTBS 800mLTween-20 400μl2.1.4 封闭液及抗体稀释液脱脂奶粉0.3gTBS 100mL2.1.5 底物溶液二氨基联苯胺（DAB） 5.0mgTBS 18mLH2O220μl 临用前配2.1.6 丽春红总蛋白质染色液丽春红1g4%乙酸100mL2.1.7 5%小牛血清生理盐水小牛血清7.5mL0.85%生理盐水定容至150mL2.1.8 酶标抗IgG（1：1500）酶标抗IgG 0.1mL5%小牛血清生理盐水定容至150mL2.2 仪器夹心式电泳槽，电泳仪，硝酸纤维素膜，直径9cm培养皿，剪刀，镊子，刀片，微量移液枪，普通滤纸3 试验步骤3.1 SDS-PAGE电泳分离所需试剂、仪器以及分离步骤完全与实验六相同，故此处从略。
Western Blotting实验
WB实验蛋白质提取：1、取适量新鲜大鼠肌肉组织100mg，加1ml预冷的RIPA裂解液（中），在冰上于玻璃研磨器中充分研磨，放置5min，4℃、12000r离心15min，取上清即为蛋白提取液。
蛋白定量后4份的蛋白提取液与1份的5X蛋白上样缓冲液混合。
-80℃冰箱保存。
2、蛋白上样前沸水煮5min， 5ul、10 ul、15 ul交替上样。
制备SDS-PAGE胶:10%分离胶溶液12ml（两块胶）1 双蒸水 4.86ml2 1.5MTris-HCl缓冲液，pH8.8，0.4%SDS 3ml3 30%丙烯酰胺溶液4ml4 10%AP 100ul5 TEMED 8ul灌胶至制胶架绿色小门上1mm处，然后轻柔地加入双蒸水，隔绝空气，室温静置30分钟待凝5%浓缩胶5ml（两块胶）1 双蒸水 2.87ml2 0.5MTris-HCl缓冲液，pH6.8，0.4%SDS 1.25ml3 30%丙烯酰胺溶液0.83ml4 10%AP 50ul5 TEMED 5ul待分离胶完全凝聚后（能看出折线），倒掉双蒸水，用滤纸吸干。
灌满浓缩胶，轻柔的从一侧开始放入梳子，30分钟待凝。
注意！！！烧杯中剩余的未凝的配胶溶液不要随意丢弃，要装在回收胶的50ml离心管里，待完全凝集没有毒性后丢弃。
电泳：将凝好的胶板装入电泳仪（短板向内，玻璃板下面的气泡要排出），内外槽均加入电泳缓冲液，内槽要加满。
左边第一孔加Marker：10μl /孔，其它孔上样品，每孔加5-15μl。
电压80V，待跑出浓缩胶、进入分离胶后，调电压至120V或100V--至目标条带到达中间位置，如果电泳太慢，体系有问题！5×电泳缓冲液配方：槽内的电泳液可以回收，但是外槽的不要回收1 Tris碱15.1g2 甘氨酸94g3 SDS/10%SD5g/50mlS4 HCl 调pH8.35 双蒸水1000ml补充至考马斯亮蓝染色：染色时间：1小时脱色时间：脱色30分钟后换脱色液，（染色液和脱色液回收）脱色至结果满意为止，然后换成清水。
免疫印迹实验报告
免疫印迹实验报告一、实验目的免疫印迹（Western blotting）是一种广泛应用于分子生物学、生物化学和免疫学等领域的技术，用于检测和定量特定蛋白质在样品中的表达水平。
本次实验的目的是通过免疫印迹技术检测目标蛋白在不同样品中的表达情况，以验证实验假设并为进一步的研究提供数据支持。
二、实验原理免疫印迹实验基于抗原抗体特异性结合的原理。
首先，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）将蛋白质样品按照分子量大小分离。
然后，将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相支持物（如硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜）上。
接着，膜与特异性抗体进行孵育，使抗体与目标蛋白结合。
最后，通过检测抗体的存在来确定目标蛋白的表达水平。
检测抗体的方法通常包括使用酶标记的二抗结合底物产生显色或发光信号，或者使用荧光标记的二抗通过荧光检测系统进行检测。
三、实验材料和设备1、材料细胞裂解液蛋白酶抑制剂蛋白标准品一抗（特异性针对目标蛋白）二抗（酶标记或荧光标记）化学发光底物（或荧光检测试剂）预染蛋白分子量标准硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜电泳缓冲液转膜缓冲液封闭液（如脱脂奶粉或牛血清白蛋白溶液）洗涤液（含吐温 20 的磷酸盐缓冲液）2、设备电泳仪和电泳槽转膜装置摇床冰箱酶标仪（或荧光检测仪器）四、实验步骤1、蛋白样品制备收集细胞或组织样本，加入适量的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，在冰上裂解一定时间。
离心收集上清液，即为蛋白样品。
2、 SDSPAGE 电泳制备 SDSPAGE 凝胶，根据目标蛋白的分子量选择合适的分离胶浓度。
将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性。
上样，进行电泳，直至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部。
3、转膜电泳结束后，将凝胶浸泡在转膜缓冲液中平衡。
按照“三明治”结构组装转膜装置，依次为阴极、滤纸、凝胶、膜、滤纸、阳极。
在冰浴或冷室中进行转膜，根据蛋白分子量和转膜条件确定转膜时间。
4、封闭转膜结束后，将膜放入封闭液中，在摇床上孵育一定时间，以封闭非特异性结合位点。
实验七蛋白质免疫印迹实验WesternBlotting
一 实验原理
电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物 上是通过电转移仪器完成的。它是将固 体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二 者结合在一起，然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治” 结构，放入电转移仪器上，加入电泳缓 冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝胶 上转移到固体支持物上。
一 实验原理
二试剂和 NaCl 8g,KCl 0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2PO4 0.24g 加双蒸水800ml,用HCl调pH到pH7.4,再加水到1000ml, 分装后，15磅20分钟灭菌。 4-氯萘酚显色液：用30mg 4-氯萘酚（简称4-CN）溶 于1ml无水乙醇中制成母液。将50μ14-CN对母液和 5μ130%的H2O2加入到5ml 0.05M/L Tris-Cl(pH7.6)中。 氨基黑染色液：0.1%氨基黑10-B、45%甲醇、10%冰 乙酸 氨基黑脱色液：90%甲醇、2%冰乙酸、8%水
二试剂和器材
2．器材 电转移仪器 恒温摇床 硝酸纤维素薄膜 Whatman 3MM滤纸 电泳仪 裁纸刀 φ25cm培养皿
玻璃棒
三 操作步骤
1蛋白质电转移 戴上手套，取下SDS-PAGE凝胶，小心剥离凝胶。裁剪与凝胶同样大的 硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角 剪去一角作为标记。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的表面，使水从 膜的下部浸透以去除其间气泡，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液 中浸湿，用蒸馏水淋洗石墨电极，先将三层浸湿的滤纸放在阳极上，在 滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间的气泡，再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小 心平铺在滤纸上，用玻璃棒小心去除气泡。随后将12%SDS-PAGE凝胶 舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，用玻璃棒小心去除气泡，再将三层浸湿 的滤纸平铺在凝胶上，沁心去除气泡，最后加上石墨电极板，接通电源 进行电转移，电流的大小由凝胶的大小决定，为0.65mA/平方厘米。电 转移2小时后，停止通电，卸掉电转移装置，取下凝胶进行考马斯亮兰 染色，以检测电转移是否完全。小心取下硝酸纤维素薄膜，放在一张干 滤纸上，吸干30-60分钟后，开始进显色反应。
蛋白印迹实验报告
蛋白印迹实验报告篇一：实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验目的1.了解Western blot的原理及其意义，掌握Western blot的操作方法；2.应用Western blot 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到尼龙膜上的重组蛋白。
实验原理Western印迹法简称蛋白质印迹法。
蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键的形式与蛋白质结合，从而固定住蛋白质；以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体起免疫反应，再和酶标记或同位素标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中温育，或通过放射自显影显出谱带，即可检测出样品中的特异蛋白组分。
试剂与器材试剂1.转移缓冲液：甘氨酸（39 mmol/L），Tris 碱（48mmol/L），SDS （%），200ml 甲醇（20%），定容至1,000mL；2.封闭液：5% 脱脂奶粉，% 叠氮钠，溶于PBST溶液中；3.丽春红S（Ponceaus）染液：丽春红S溶于1mL 冰乙酸中，加水至100mL；洗膜液：PBS 缓冲液含% Tween 20；5．DAB浓缩显色液（50X）：DAB （二氨基联苯胺）是根过氧化物酶的底物之一，临用前稀释。
6．5 x PBS：在1600mL蒸馏水中溶解Na 2HPO4 , Na H2PO4, 40g Na Cl,用/L NaOH调pH至，加水定容至2升。
高压灭菌20 分钟，室温保存。
用前稀释至1x 。
7．SDS-PAGE电泳用溶液和试剂。
器材电泳装置一套;2.电转移膜装置3.抗体-酶反应摇床操作方法〈一〉电转移1．将蛋白质样品进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑出胶后停止电泳（1）。
2．载手套切6-8张定性滤纸和一张尼龙膜，它们的大小应与凝胶的大小相同。
在尼龙膜的一（左）角作一记号（或剪角），与滤纸和海棉（纤维）垫浸泡于转移缓冲液中。
免疫印迹技术实验报告
免疫印迹技术实验报告一、引言免疫印迹技术（Western Blotting）是一种用于检测特定蛋白质的定性和定量分析方法。
它基于免疫学原理，通过将待测蛋白质进行电泳分离，并利用抗体与目标蛋白质特异性结合的原理，最终实现对目标蛋白质的检测和定量分析。
本实验旨在通过免疫印迹技术检测目标蛋白质在不同样本中的表达水平，并观察其变化情况，以深入了解该蛋白质的功能和作用机制。
二、实验步骤1. 样本制备首先，我们需要准备样本。
样本可以是细胞或组织。
在实验中，我们选择了A 细胞和B细胞作为样本，分别进行后续实验。
2. 蛋白质提取将A细胞和B细胞分别加入适量的细胞裂解缓冲液，通过离心等操作将细胞裂解并获取蛋白质提取物。
3. SDS-PAGE电泳分离将蛋白质提取物加入SDS-PAGE凝胶中，进行电泳分离。
电泳时间和电压根据实验需要来确定。
4. 转膜将电泳分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚丙烯酰胺膜上。
转膜可以通过湿法或半湿法等方法实现。
5. 阻断将转膜后的聚丙烯酰胺膜放入阻断液中，在室温下进行阻断。
阻断的目的是防止非特异性结合。
6. 一抗处理将目标蛋白质的一抗加入到含有阻断液的培养皿中，将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在一抗液中，进行一抗处理。
一抗的选择根据目标蛋白质的特异性来确定。
7. 洗涤将转膜的聚丙烯酰胺膜从一抗液中取出，进行洗涤。
洗涤的目的是去除非特异性结合的抗体。
8. 二抗处理将与目标蛋白质一抗结合的二抗加入到含有阻断液的培养皿中，将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在二抗液中，进行二抗处理。
9. 洗涤将转膜的聚丙烯酰胺膜从二抗液中取出，再次进行洗涤，确保清洗干净。
10. 显色将合适的显色剂加入到含有阻断液的培养皿中，将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在显色剂中，进行显色反应。
显色剂的选择根据实验需要和目标蛋白质的特性来确定。
11. 照相观察显色结果，并使用相机拍摄转膜的聚丙烯酰胺膜，记录实验结果。
三、结果与讨论根据实验步骤，我们成功地使用免疫印迹技术检测了A细胞和B细胞中目标蛋白质的表达情况。
Western blotting实验报告
Western BlottingLin Chengyu Bio 04 2010030007 Cooperator: Liu Yidi1Introduction1.1Background informationWestern blotting is the procedure that proteins separated by PAGE may be transferredfrom the gel to a thin support matrix, usually a nitrocellulose membrane, which stronglybinds and immobilizes proteins. The protein blots on the membrane surface are thenutilized for further analysis, often coupled with immunological detection techniques.This experiment takes human and horse IgG as the antigen. After treated by SDS-PAGE,transfer the proteins to the nitrocellulose membrane and take rabbit-anti-horse IgG as theprimary antibody, and enzyme-linked goat-anti-rabbit IgG as the secondary antibody.1.2Major principlesWestern blotting consists of two major steps, immobilization and immunoblotting.Immobilization mainly uses electric field force or gravity, as shown in Figure 1.Figure 1 ImmobilizationThe proteins, carrying negative charges, move against the electric field to the anode, thatis, from the gel to the nitrocellulose membrane.Immunoblotting uses immunological techniques, as shown in Figure 2.Figure 2 Immunoblotting1Blocking step is necessary which will block all the remaining hydrophobic binding siteson the nitrocellulose membrane. The primary antibody recognizes the specific proteinand is recognized by the enzyme-linked secondary antibody, so both of them bind totheir target. The enzyme linked to the secondary antibody catalysis the specific reactionwhich leads to light or color, which can be recognized as a band on the nitrocellulosemembrane.2Experiment operation2.1SDS-PAGE(1)Prepare an 8% SDS-PAGE gel;(2)Load the samples in the gel following Table 1;Table 1 The loading plan of SDS-PAGE(3)Galvanize the gel box to separate proteins;(4)Take the gel from gel box, then cut it into 2 separate gels between Lane 6 and 7;(5)Stain one gel with (Lane 1-6) with Comassiee Brilliant Blue overnight. Distain itlater to make the original copy to compare with the other gel which is for transfer.2.2Immobilization(1)Prepare 8 pieces of filter paper and one nitrocellulose membrane in the same size asthe gel and soak them in transfer buffer for 15 min;(2)Soak the SDS-PAGE gel in the transfer buffer;(3)Place the gel, filter papers, and nitrocellulose membrane following the order shownin Figure 1;(4)Transfer in constant-current electrophoresis (I = A / cm2 * 0.8 mA) for 1.5 h;(5)Soak the membrane in BSA solution for blocking non-specific protein-binding, 4 ºCovernight.2.3Immunoblotting(1)Wash the membrane with fresh PBST and keep in this environment;(2)Cover the membrane with primary antibody solution in a plastic bag and seal it;(3)Incubate for 2 h at R.T.;(4)Wash the membrane with fresh PBST, 5 min for each time, and repeat twice;(5)Cover the membrane with secondary antibody solution in a plastic bag and seal it;(6)Incubate for 1.5 h at R.T.;(7)Wash the membrane with fresh PBST, 5 min for each time, and repeat twice;(8)Develop the membrane in substrate solution;(9)Stop the developing step in ddH2O and dry the membrane in filter paper directly. 3Raw data and its processing3.1SDS-PAGEThe gel image is shown in Figure 3.Figure 3 SDS-PAGELane I: 10 μL human IgGLane II: 10 μL horse IgGLane III: 5 μL human IgGHuman IgG band is at approx. 100 kDa, while horse IgG smaller, at approx. 95 kDa.3.2ImmunoblottingThe membrane image is shown in Figure 4.Figure 4 ImmunoblottingLane I: 10 μL human IgGLane II: 10 μL horse IgGLane III: 5 μL human IgGAs can see in Figure 4, using rabbit-anti-horse IgG anti-serum as the primary antibody,Lane II, which contains 10 μL horse IgG, shows a clear and dark band. And there iscross binding between rabbit-anti-horse IgG anti-serum and human IgG, which isindicated by two bands shown in Lane I and Lane III. What’s more, the higher theconcentration (10 μL vs. 5 μL), the more cross binding are shown in the membrane.4Result and discussion4.1Result4.1.1The human IgG is about 100 kDa, and horse IgG 95 kDa.4.1.2The specific binding between horse IgG and rabbit-anti-horse IgG anti-serum isgood, while there is cross binding between human IgG and rabbit-anti-horseIgG anti-serum.4.2Discussion4.2.1Lane I in SDS-PAGEThe band in Lane I which corresponds with 10 μL human IgG is not parallel tothe slots. The most probable reasons are:(1)While loading, the samples stays too long time in the slot;(2)The surface of the concentrated gel is not flat in Lane I;(3)The surface of the separating gel is not flat due to unsuitable removal of thecomb.4.2.2Horse IgG band in immunoblottingThe band is not sharp enough, because there are lots of subtypes of horse IgG,causing a bad separate effect.4.2.3Lane II in immunoblottingAs can see in Figure 4, Lane II contains lots of regions that is also colored(background), it is mainly because during the washing step, especially washingthe primary antibody, we add too much PBST in the petri dish, causing littlewashing force, and lots of primary antibody remaining on the membranenon-specific binding to the proteins.5Reference【1】/biotech/exp/protein/westernblot/2009/e89175533.html。
蛋白质印迹法实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质印迹法的基本原理和操作步骤。
2. 学习如何利用蛋白质印迹法检测目标蛋白的表达水平。
3. 掌握蛋白质印迹法的实验操作技巧，为后续相关实验奠定基础。
二、实验原理蛋白质印迹法（Western Blot）是一种常用的蛋白质检测技术，通过特异性抗体与待测蛋白结合，实现对目标蛋白的高灵敏度和高特异性检测。
实验原理如下：1. 蛋白质提取：从组织、细胞或体液中提取总蛋白质，避免蛋白质的降解和失活。
2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：将提取的蛋白质进行SDS-PAGE，根据蛋白质分子量大小进行分离。
3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相载体（如硝酸纤维素膜或PVDF膜）上。
4. 免疫反应：用特异性抗体与转移至固相载体上的目标蛋白结合，然后与酶或同位素标记的第二抗体发生反应。
5. 显色或放射自显影：通过底物显色或放射自显影等手段，实现对目标蛋白的检测和定量。
三、实验材料1. 细胞株：大鼠原代脊髓星形胶质细胞2. 主要试剂：DMEM/F12培养基、胎牛血清、裂解液、PBS、NaCl、SDS、聚丙烯酰胺凝胶、硝酸纤维素膜、PVDF膜、特异性抗体、酶联第二抗体、底物、显影液等。
3. 仪器：玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、-20低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床等。
四、实验步骤1. 细胞培养：将大鼠原代脊髓星形胶质细胞在DMEM/F12培养基和胎牛血清的条件下培养，直至达到实验所需状态。
2. 蛋白质提取：用裂解液提取细胞总蛋白质，并进行蛋白质浓度测定。
3. SDS-PAGE：将提取的蛋白质进行SDS-PAGE，根据蛋白质分子量大小进行分离。
4. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜或PVDF膜上。
5. 免疫反应：将转膜后的膜与特异性抗体进行孵育，然后用酶联第二抗体进行孵育。
6. 显色：加入底物，观察目标蛋白条带的出现，并通过扫描成像系统进行定量分析。
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Western Blotting本次试验的目的是使同学们掌握Western Blotting法鉴定目标蛋白的原理和熟悉Western Blotting的方法，并了解抗原抗体结合反应的影响因素。
Western Blotting的blotting译为印迹法，是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
Western既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。
它通常分为两种方法：同时Western又具有多种识别蛋白质的显色方法，主要有以下几种：i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。
一、实验原理Western Blotting（蛋白质免疫印迹法）是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳奋力的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质为抗原，与之对应的第一抗体发生免疫结合反应，一抗再与酶或同位素标记的第二抗体发生免疫结合反应，经过底物显色活放射自显影以检查电泳分离的提议目的蛋白成分。
蛋白质印迹技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异性高、敏感等诸多优点，能从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测。
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)、N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)和催化剂(AP)、加速剂(TEMED聚合成的三维网孔结构(凝胶）。
据有无浓缩效应可将电泳分为两类：i.连续系统：缓冲液pH值、凝胶浓度相同，带电粒子靠电荷及分子筛效应区分。
ii.不连续系统：缓冲离子成分、pH值、凝胶浓度不同，带电粒子在电场中由电效应、分子筛效应、浓缩效应区分。
SDS-PAGE的原理是：依靠SDS带有大量负电荷来掩盖蛋白质表面的净电荷：同时由于在电泳溶液中加入了SDS和巯基乙醇，因此它还可以改变蛋白质构象：在实验中要注意：印迹法需要较好的蛋白质凝胶电泳技术，是蛋白质样品达到良好的分离效果，而且要注意胶的质量，是蛋白质容易转移带固相支持物上，另外蛋白质在电泳过程中分离得到的条带被保留在膜上，在随后的宝物阶段不丢失和扩散。
免疫印迹分析之需要很小体积的时间，较短的时间过长，操作容易，适用于理论和应用上的研究。
本实验采用人血清为材料，人类Ig根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异性的不同，分为五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。
其中IgG占血清免疫球蛋白总量的75%～80%。
人的IgG由两条重链和两条轻链组成，它们之间以二硫键相连。
在加SDS的电泳条件下，分子中的二硫键被还原成游离的巯基，四条链分开，重链迁移速度较慢，轻链迁移速度较快，可跑出两条带。
对此样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，用电转移法将蛋白质转印到硝酸纤维素薄膜上，用兔抗人IgG为第一抗体，用辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG为第二抗体，在过氧化物酶第五存在的情况下，检测人的IgG。
二、试剂，器材和实验材料【试剂】1.30％丙烯酰胺贮备液：29.2g 丙烯酰胺，0.8g 甲叉双丙烯酰胺，加重蒸水至100ml。
2.浓缩胶缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8。
3.分离胶缓冲液：3mol/L Tris-HCl，pH8.9。
4.10％过硫酸铵(w/v)：临用前用蒸馏水配制。
5.10％SDS(w/v)。
6.10％TEMED。
7.电极缓冲液：甘氨酸11.28g, SDS 0.4g, Tris 2.4g, 加水至800ml，pH8.3。
8.样品缓冲液：0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH6.8，20％甘油，4％SDS，10％巯基乙醇，0.005％溴酚兰。
9.考马斯亮蓝R250染色液：考马斯亮蓝R250 0.25g，30%乙醇，10%冰乙酸。
10.脱色液：乙醇6ml，冰乙酸2ml，加水至20ml。
11.TBS（Tris-HCl,NaCl）缓冲液：20mmol/L Tris-HCl,12.500mmol/L NaCl，pH7.5，每组配150ml。
13.TTBS：取100mlTBS，加250μl 20％Tween-20。
14.封闭液及抗体稀释液：3％脱脂奶粉-TBS，每组配10ml。
15.底物溶液：2.5mg二氨基联苯胺（DAB）+ 10mlTBS +10μl H2O2，临用前配制。
16.考马斯亮蓝R250染色液：考马斯亮蓝R250 0.25g，30%乙醇，10%冰乙酸，总体积500ml。
17.脱色液：乙醇6ml，冰乙酸2ml，加水至20ml。
【器材】1.夹心式电泳槽2.转移电泳槽3.电泳仪【实验材料】1.人血清2.硝酸纤维素膜三、实验步骤ⅠSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1.灌胶前的准备：将两块玻璃板洗净晾干或用吹风机吹干，嵌入本体的凹槽中，长玻板朝外，短玻板朝内，两块玻璃板之间就形成了凝胶室。
合上滑块，拧螺栓锁紧凝胶室，检查凝胶室底部是否与本体底端重合。
然后将以上组合放入制胶架，插入并旋转凸轮，即可灌胶。
2.配制胶液3.灌胶：将配制好的分离胶液倒入两块玻璃板之间的凝胶室中，待胶液加至距短玻璃板顶端约1.5cm处时停止灌胶，然后在胶液表面上小心加入厚约0.5cm的水层，以保持分离胶面平整，同时隔绝空气，空气中的氧对凝胶的聚合有阻碍作用。
待凝胶和水之间出现清晰界面时，说明分离胶已聚合，大约30min完成聚合。
倾去分离胶上层的水，将配制好的浓缩胶液加到分离胶上，至接近短玻璃板的顶端，插上样品梳，放置待其聚合。
4.配制电极缓冲液：甘氨酸14.1g，SDS 0.5g，Tris 3g，加水至1000ml，pH8.3。
每组配1000ml。
5.制样：5μl人血清，加45μl水，再加50μl加样缓冲液。
沸水浴加热8分钟，10000rpm离心2分钟,取上清液作为样品。
另按说明书制备好蛋白质分子量标准样品。
6.加样：1、加入电极缓冲液；a) 拔出样品梳；b）选3个样品槽，用微量进样器加样，中间槽加入5μl分子量标准蛋白样品，两旁槽各加入10μl人血清样品。
稳压120V电泳，当溴酚蓝前沿到达距底部0.5cm左右时，停止电泳。
7.切胶：根据切割线，先竖切后横切，宽胶条为两泳道，含人血清样和分子量标准蛋白样，考马斯亮蓝R-250全蛋白染色。
窄胶条为一泳道，为人血清样，转印后对目标蛋白免疫染色。
8.胶条保存：将两个胶条用保鲜袋包好，贴上标有自己名字的标签-20℃冻存。
Ⅱ转印蛋白质到硝酸纤维素膜上1.将带有人血清和标准蛋白的宽胶带用考马斯亮蓝R250染色、脱色：将宽胶条放到培养皿中，用蒸馏水清洗后，加入约10ml考马斯亮蓝R-250染色液染色1小时左右，然后换成脱色液脱色，不时摇动。
更换几次脱色液，至背景无色透明，条带清晰为止。
2.放置NC膜和胶条：a)⑴.切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素膜，用转移缓冲液或水浸泡5min使之湿润。
b)⑵.准备2张滤纸和海绵一起浸泡在转移缓冲液中。
c)⑶打开转移转移槽的胶板，依次放入：a.一张浸湿的海绵b. 一张浸湿的滤纸c. 用转移缓冲液冲洗过的胶，并小心地赶走滤纸和胶之间的气泡d. 硝酸纤维素膜，在膜的右下角剪一小角，以标明电泳方向e. 一张浸湿的滤纸f. 一张浸湿的海绵。
3.转移：小心地合上胶板，按胶侧为负极，膜侧为正极的方向放入转移电泳槽中，加转移缓冲液至满。
插好转移电泳装置的电极，打开电泳仪开关调至稳压60V，电泳1h，转移结束后打开胶板取出硝酸纤维素薄膜。
Ⅲ膜的酶联免疫染色1.封闭：用TBS缓冲液洗膜1min后，将膜封入塑料薄膜袋内，留一开口。
加封闭液1ml后封闭开口，37℃摇床上摇动30min。
2.加封闭液及抗体a)与第一抗体结合(1)弃封闭液，加入适当稀释的1ml第一抗体溶液(兔抗人IgG)，封口后37℃摇床上轻轻摇动50min。
(2)取出膜，用TTBS洗膜3次，每次1min。
再封入一新的塑料薄膜袋内。
b)与酶标第二抗体结合(3)加入适当稀释的1ml辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，37℃摇床上轻轻摇动50min。
(4)取出膜，用TTBS洗3次，每次1min，最后用TBS溶液洗1次，以去除Tween-20。
加底物溶液显色将膜浸入10ml底物溶液中，至显色清楚后，用水清洗，以除去多余的底物。
转入水中保存。
3.结果分析：在凝胶成像分析系统上照相，并分析结果。
测量分子量标准蛋白的迁移距离，作出标准曲线，再测出硝酸纤维素膜上的人IgG带的迁移距离，在标准曲线上查出人IgG重链的分子量。
实验结果：做标准蛋白曲线的的凝胶的总长为7.53cm带有人血清IgG的硝酸纤维素膜的总长为7.24cm由公式y = -1.1451x + 2.0366知：当x（重链相对迁移率）=0.33时，y=1.6587 得IgG重链相当分子量为：45.57KDa当x（轻链相对迁移率）=0.56时，y=1.3953 得IgG轻链相当分子量为：24.85KDa讨论：一、实验注意事项：四、.丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有神经毒性，注意不要沾在皮肤上，如有沾染可用水洗净。
聚合成聚丙烯酰胺后毒性即消失。
五、电泳槽只能用水冲洗，不能用刷子刷，以免刷断铂电极丝；注意保护玻璃板。
六、一抗的选择是影响免疫印迹成败的主要因素。
多克隆抗体结合抗原能力较强、灵敏度高，但易产生非特异性的背景；单克隆抗体识别抗原特异性较好，但可能不识别在样品制备时因变性而失去了空间构型的抗原表位，且易发生交叉反应。
因此，兼有多克隆抗体和单克隆抗体优点的混合单克隆抗体近年特别被推荐，它是由一组能与抗原分子中的不同且不易变性的抗原表位结合并不易出现交叉反应的单克隆抗体混合构成。
七、.如果反应灵敏度不高，可增加凝胶的厚度到1.5mm（厚度超过2.0mm 时，凝胶转移效率受限）；也可在电泳条带不发生变形的前提下，尽量提高蛋白样品的上样量。
八、滤纸/凝胶/转印膜/滤纸夹层组合中不能存在气泡，可用玻璃棒在夹层组合上滚动将气泡赶出，以提高转膜效率；上下两层滤纸不能过大，避免导致直接接触而引起短路。