《化妆品微生物标准检验方法》GB ～ ——
化妆品 cma 微生物 认证检测项目
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化妆品微生物标准检验方法细菌总数测定及注解
化妆品微生物标准检验方法细菌总数测定及注解化妆品微生物标准检验方法细菌总数测定及注解中华人民共和国国家标准化妆品微生物标准检验方法细菌总数测定 UDC 668：576 .85.07(GB7918.2－87)Standard methods of microbiological examination for cosmeticsStandard plate count细菌总数系指1g或1ml化妆品中所含的活菌，数量。
测定细菌总数可用来判明化妆品被细菌污染的程度，以及生产单位所用的原料、工具设备、工艺流程、操作者的卫生状况，是对化妆品进行卫生学评价的综合依据。
本标准采用标准平板计数法。
1 方法提要化妆品中污染的细菌种类不同，每种细菌都有它一定的生理物质性，培养时对营养要求，培养温度、培养时间、pH值、需氧性质等均有所不同。
在实际工作中，不可能做到满足所有菌的要求，因此所测定的结果，只包括在本方法所使用的条件下（在卵磷脂、吐温80营养琼脂上，于37℃培养48h)生长的一群嗜中温的需氯及兼性厌氧的细菌总数。
2 培养基和试剂2.1 生理盐水：见GB 7918-87《化妆品微生物标准检验方法总则》。
2.2 卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基成分：蛋白胨 20g牛肉膏 3g氯化钠 5g琼脂 15g卵磷脂 1g吐温80 7g蒸馏水 1000ml制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80将其他成分(除琼脂外)加到其余蒸馏水中，溶解。
加入已溶解的卵磷脂、吐温80，混匀，调pH值为7.1～7.2，加入琼脂，121℃(15 1b)20min高压灭菌，储存于冷暗处备用。
3 仪器3.1 锥形烧瓶。
3.2 量筒。
3.3 pH计或精密pH试纸。
3.4 高压消毒锅。
3.5 试管。
3.6 灭菌平皿：直径9cm。
3.7 灭菌刻度吸管：10ml、2ml、1ml。
3.8 酒精灯。
3.9 恒温培养箱。
3.10 放大镜。
4 操作步骤4.1 用灭菌吸管吸取1:10稀释的检样2ml，分别注入到两个灭菌平甲内，每皿1ml。
化妆品微生物检验方法标准
化妆品微生物检验方法标准概述：化妆品微生物检验是对产品中的微生物含量和活性进行检测，旨在确保化妆品的质量和安全性。
本文将介绍化妆品微生物检验的方法标准，包括采样方法、微生物总数测试、致病微生物测试等内容。
一、采样方法采样是化妆品微生物检验的第一步，正确的采样方法对检验结果的准确性至关重要。
总体的采样方法包括以下几个方面：1. 选取适当数量和规格的样品，并确保样品具有代表性；2. 使用干净的取样工具，避免污染样品；3. 选择不同生产批次和生产日期的化妆品进行采样，以评估产品的质量稳定性；4. 遵循严格的卫生规范和操作规程进行采样。
二、微生物总数测试微生物总数测试是对化妆品样品中微生物总数量的测定。
其目的是评估产品的细菌污染程度和是否符合相关的卫生标准。
以下是常用的微生物总数测试方法：1. 高效液相色谱法（HPLC）：该方法通过分离、测定化妆品中微生物代谢产物的含量，从而推断微生物总数；2. 膜过滤法：通过将样品通过膜过滤器，然后将膜培养在适当的培养基上，计数培养基上出现的菌落数量；3. 稀释平板计数法：将样品进行系列稀释后，移取适量的稀释液均匀涂布在含有适当培养基的平板上，培养并计数菌落数量；4. 流式细胞术：利用流式细胞仪对样品中微生物进行计数和鉴定。
三、致病微生物测试致病微生物测试是对化妆品样品中致病微生物含量的检测。
该测试主要关注常见的致病菌，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等。
以下是常用的致病微生物测试方法：1. 酶免疫分析法（ELISA）：通过检测样品中致病菌特异性的抗原或抗体来判断样品是否存在致病菌；2. PCR技术：通过引物特异性扩增样品中的致病菌DNA，从而检测样品是否受到致病菌污染；3. 快速培养技术：利用快速培养方法，减少培养周期，快速检测致病菌的存在。
四、标准和参考文献化妆品微生物检验方法的标准和参考文献主要包括国际组织和国家相关机构发布的标准。
以下是几个常见的标准：1. 国家药品监督管理局发布的《化妆品质量规范》2. 国际标准化组织（ISO）发布的相关标准，如ISO 21149：2020 "Cosmetics -- Microbiology -- Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria"3. 美国食品药品管理局（FDA）发布的相关指导文件，如《微生物检验的尺度适应性》总结：化妆品微生物检验是保证化妆品质量和安全的重要环节。
化妆品原料微生物检验标准
化妆品原料微生物检验标准一、细菌总数1.目的：评估化妆品原料的细菌污染程度，反映化妆品生产过程中的卫生状况。
2.采样方法：随机取样，按照标准程序进行细菌总数的测定。
3.判定标准：细菌总数小于或等于1000 CFU/g（CFU/ml）为合格，超过此标准为不合格。
二、霉菌和酵母菌总数1.目的：评估化妆品原料的霉菌和酵母菌污染程度，反映原料的卫生状况。
2.采样方法：随机取样，按照标准程序进行霉菌和酵母菌总数的测定。
3.判定标准：霉菌和酵母菌总数小于或等于100 CFU/g（CFU/ml）为合格，超过此标准为不合格。
三、耐热大肠菌群1.目的：检测化妆品原料中是否存在耐热大肠菌群，反映原料的卫生状况。
2.采样方法：随机取样，按照标准程序进行耐热大肠菌群的测定。
3.判定标准：未检出耐热大肠菌群为合格，检出耐热大肠菌群为不合格。
四、金黄色葡萄球菌1.目的：检测化妆品原料中是否存在金黄色葡萄球菌，预防感染性疾病的发生。
2.采样方法：随机取样，按照标准程序进行金黄色葡萄球菌的测定。
3.判定标准：未检出金黄色葡萄球菌为合格，检出金黄色葡萄球菌为不合格。
五、铜绿假单胞菌1.目的：检测化妆品原料中是否存在铜绿假单胞菌，预防感染性疾病的发生。
2.采样方法：随机取样，按照标准程序进行铜绿假单胞菌的测定。
3.判定标准：未检出铜绿假单胞菌为合格，检出铜绿假单胞菌为不合格。
六、沙门氏菌1.目的：检测化妆品原料中是否存在沙门氏菌，预防感染性疾病的发生。
2.采样方法：随机取样，按照标准程序进行沙门氏菌的测定。
3.判定标准：未检出沙门氏菌为合格，检出沙门氏菌为不合格。
七、志贺氏菌1.目的：检测化妆品原料中是否存在志贺氏菌，预防感染性疾病的发生。
2.采样方法：随机取样，按照标准程序进行志贺氏菌的测定。
3.判定标准：未检出志贺氏菌为合格，检出志贺氏菌为不合格。
八、大肠埃希氏菌O157:H71.目的：检测化妆品原料中是否存在大肠埃希氏菌O157:H7，预防感染性疾病的发生。
化妆品卫生标准
化妆品卫生标准化妆品卫生标准 GB 7916-87化妆品安全性评价程序和方法化妆品安全性评价程序和方法 GB 7919-87化妆品卫生化学标准检验方法化妆品卫生化学标准检验方法汞 GB 7917.1-87(及注解) 化妆品卫生化学标准检验方法砷 GB 7917.2-87(及注解) 化妆品卫生化学标准检验方法铅 GB 7917.3-87(及注解) 化妆品卫生化学标准检验方法甲醇 GB 7917.4-87(及注解)检验样品预处理方法测定无机成分的样品预处理测定有机成分的样品预处理化妆品禁用、限用等成分的检验方法pH值酸碱度汞砷铬镉氟化物铋甲醇苯酚、氢醌4-羟基苯磺酸锌巯基乙酸及其盐类氧化型染发剂中染料防腐剂防晒剂着色剂（色素）激素磺氨灭脓佛手柑茨烯内酯喷雾气体卵磷脂硬酯酰干草酸化妆品中维生素E的检验方法化妆品成品系统分析止汗和除臭产品头发定型剂冷烫产品指甲油香水和香气的分析化妆品微生物标准检验方法化妆品微生物标准检验方法总则及注解 GB 7918.1-87细菌总数测定的标准检验方法及注解 GB 7918.2-87粪大肠菌群标准检验方法及注解 GB 7918.3-87绿脓杆菌标准检验方法及注解 GB 7918.4-87金黄色葡萄球菌标准检验方法及注解 GB 7918.5-87化妆品中常见其它微生物的检验化妆品中霉菌和酵母菌的检验粉类化妆品中需氧芽孢菌和蜡状样芽孢杆菌的检验化妆品原料和生产环境中污染菌的检验化妆品的防腐及防腐效力试验化妆品诊断标准及其处理原则化妆品皮肤病诊断标准及处理原则总则 GB 17149.1-1997 化妆品接触性皮肤炎诊断标准及处理原则 GB 17149.2-1997 化妆品痤疮诊断标准及处理原则 GB 17149.3-1997化妆品毛发损害诊断标准及处理原则 GB 17149.4-1997化妆品甲损害诊断标准及处理原则 GB 17149.5-1997化妆品光感性皮炎诊断标准及处理原则 GB 17149.6-1997 化妆品皮肤色素异常诊断标准及处理原则 GB 17149.7-1997。
化妆品微生物检验及安全技术规范比较
最终结果判断
增菌培养
供试液的制备
书写检验 记录单
分离纯化
无菌落或无特征菌落
配培养基和稀释液
革兰染色、镜检→ 氧化酶试验 绿脓菌素试验 生化试验 硝酸盐还原试验 42℃生长试验 明胶液化试验
人员培训能力掌握的检验重要指标。
有条件可做视具体样品测试结果。
在膏霜类化妆品中,微生物都是吸附或附着于颗粒状的原料中,检测时不易洗脱下来,因此,需要验证检测方法的有效性。
推荐了解：
接种阳性菌计算回收率
未检出2天，检出3-4天
耐热大肠菌群 Thermotolerant coliform bacteria系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，在44.5℃培养24h—48h能发酵乳糖产酸并产气。
方法比较
2007版化妆品卫生规范与2015版化妆品安全技术规范对比： 总则
总则重点
具有代表性。2.不少于2个包装单位的取样中共取10g或10mL。3.供检样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。4.应置于室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。4.宜先取出部分样品做微生物检验。5.严格上微生物无复测一说。（可能的因素多），因此对微生物检验人员要求严格。6.生物安全开始重视。
★铜绿假单胞菌检查流程图
SCDLP培养基
十六烷三甲基溴化铵琼脂
36±1℃
18~24h
36±1℃
18~24h
特征菌落
灰白色、扁平、周围有水溶性蓝绿色素
镜检
十六烷三甲基溴化铵平板 SCDLP培养基 黄绿色菌膜 灰白色湿润 氧化酶试验 粉红/紫红色
绿脓菌素试验 盐酸层呈粉紫色氯仿层呈蓝绿色 硝酸盐还原产气试验 N2 明胶液化试验 明胶培养基（高层） 明胶液化
化妆品微生物标准检验方法细菌总数测定 PDF
化妆品微生物标准检验方法细菌总数测定Standard methods of microbiological examination for determination of aerobic bacterial count 中华人民共和国国家标准化妆品微生物标准检验方法细菌总数测定UDC 668：576 .85.07GB7918.2－87Standard methods ofmicrobiological examination for cosmetics Standard plate countThe people's Republic of China National Standard for cosmeticsstandard methods of microbiological examination for UDC 668:576methods of microbiological examination for.85.07GB7918.287Standard cosmetics Standard plate count细菌总数系指1g或1ml化妆品中所含的活菌，数量。
测定细菌总数可用来判明化妆品被细菌污染的程度，以及生产单位所用的原料、工具设备、工艺流程、操作者的卫生状况，是对化妆品进行卫生学评价的综合依据。
本标准采用标准平板计数法。
1 方法提要化妆品中污染的细菌种类不同，每种细菌都有它一定的生理物质性，培养时对营养要求，培养温度、培养时间、pH值、需氧性质等均有所不同。
在实际工作中，不可能做到满足所有菌的要求，因此所测定的结果，只包括在本方法所使用的条件下（在卵磷脂、吐温80营养琼脂上，于37℃培养48h)生长的一群嗜中温的需氯及兼性厌氧的细菌总数。
2 培养基和试剂2.1 生理盐水：见GB 7918-87《化妆品微生物标准检验方法总则》。
2.2 卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基成分：蛋白胨 20g牛肉膏3g氯化钠 5g琼脂 15g卵磷脂 1g吐温80 7g蒸馏水 1000ml制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80将其他成分(除琼脂外)加到其余蒸馏水中，溶解。
化妆品霉菌与酵母菌检测方法
作业文件版次A/0 页码1/1化妆品霉菌与酵母菌检测方法生效日期1 适用范围适用于化妆品厂霉菌与酵母菌数量检测方法。
参照GB7918《化妆品微生物标准检验方法总则》。
2 实验用具2.1实验用具:霉菌培养箱（28±1°C）、干燥箱、恒温水浴锅、高压灭菌锅、酒精喷壶、酒精灯、打火机、去离子水、棉签、500ml锥形瓶（带硅胶塞）、直径9cm培养皿、移液枪、1ml吸头、150ml 锥形瓶、酒精棉、生理盐水、电子称、量筒、记号笔、银子、药匙。
2. 2培养基与生理盐水虎红（孟加拉红）培养基生理盐水：氯化钠8. 5克，蒸懾水1000毫升。
3 实验准备：3.1培养基的配制：配制方法：孟加拉红（虎红）培养基称取粉末31.6克，加入蒸憎水或去离子水1L,搅拌加热至完全溶解分装三角瓶。
（具体参照购买的培养基说明书进行配制）。
3.2用具和培养基灭菌：将上述实验用具及培养基于121°C高压灭菌20分钟，冷却后待用。
4 样品制备：（制备顺序需要严格按如下标准操作，不能前后颠倒）4.1液体样品：水溶性的液体样品，可量取10ML加到90ML灭菌生理盐水中，如样品少于10ML,仍按10 倍稀释法进行。
如为5ML则加到45ML灭菌生理盐水，混匀后制成1:10稀释液。
油性液体样品，取样品10ML,先加5ML灭菌液体石蜡混匀，再加10ML灭菌吐温80,加入灭菌生理盐水75ML,制成1:10稀释液。
4.2 W霜类半固体状样品亲水性样品，称取10克，加来灭菌带玻璃珠加有90ML生理盐水的锥形瓶中，充分混匀，用其上清液作为1:10的稀释液。
疏水性样品，称取10克，放到灭菌的研钵中，加10ML灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状，再加上10ML灭菌吐温，研磨待溶解后，加70ML灭菌生理盐水，制成1:10的稀释液。
4.3固体样品称取10克，加到灭菌生理盐水稀释瓶中，混匀，使其分散混悬后，取上清液作为1:10稀释液。
5 操作步骤：5.1用灭菌吸管吸取1:10稀释的检样2ML,分别注入到两个灭菌平皿内,每皿1ML。
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一、总则General Principle1 范围本规范规定了化妆品微生物学检验总则。
本规范适用于化妆品样品的采集、保存、供检样品制备。
2 仪器和设备天平。
高压灭菌器。
振荡器。
三角瓶。
玻璃珠。
玻璃棒。
刻度吸管。
研钵。
均质器。
恒温水浴箱。
采样用具：不锈钢勺，剪刀，开罐器等。
3 培养基和试剂生理盐水成分：氯化钠8.5g蒸馏水加至1000 mL溶解后，分装到加玻璃珠的三角瓶内，每瓶90mL，(15 lb)20min高压灭菌。
SCDLP液体培养基成分：酪蛋白胨17g大豆蛋白胨3g氯化钠5g磷酸氢二钾 2.5g葡萄糖 2.5g卵磷脂1g吐温80 7g蒸馏水1000mL制法：先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其它成分混合，加热溶解，调pH为～，分装，(15lb)20min高压灭菌。
注意振荡，使沉淀于底层的吐温80充分混合，冷却至25℃左右使用。
注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。
灭菌液体石蜡。
3.4灭菌吐温80。
4 样品的采集及注意事项所采集的样品，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。
检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g或10mL。
包装量小于20g的样品，采样量应适量增加，其总量应大于16g。
供检验样品，应严格保持原有的包装状态，进口产品应为市售包装。
容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。
接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。
如不能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。
若只有一份样品而同时需做多种分析，如微生物、毒理、化学等，应先做微生物检验，再将剩余样品做其它分析。
在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用采样用具、器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操作规定进行。
5 供检样品的制备液体样品5.1.1 水溶性的液体样品，量取10mL加到90mL灭菌生理盐水中，混匀后，制成1:10检液。
5.1.2 油性液体样品，取样品10mL，先加5mL灭菌液体石蜡混匀，再加10mL灭菌的吐温80，在40℃～44℃水浴中振荡混合10min，加入灭菌的生理盐水75mL(在40℃～44℃水浴中预温)，在40℃～44℃水浴中乳化，制成1:10的悬液。
膏、霜、乳剂半固体状样品5.2.1 亲水性的样品，称取10g，加到装有玻璃珠及90mL灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀，静置15min。
取其上清液作为1:10的检液。
5.2.2 疏水性样品，称取10g，放到灭菌的研钵中，加10mL灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状，再加入10mL灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70mL灭菌生理盐水，在40℃～44℃水浴中充分混合，制成1:10检液。
固体样品，称取10g，加到90mL灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液作为1:10的检液。
如有均质器，上述水溶性膏、霜、粉剂等，可称10g样品加入90mL灭菌生理盐水，均质1min～2min；疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称10g样品，加10mL灭菌液体石蜡，10mL灭菌吐温80，70mL灭菌生理盐水，均质3min～5min。
二、菌落总数Aerobic Bacterial Count1 范围本规范规定了化妆品中菌落总数的检验方法。
本规范适用于化妆品菌落总数的测定。
2 定义本规范采用下列定义菌落总数(aerobic bacterial count)是指化妆品检样经过处理，在一定条件下培养后(如培养基成分、培养温度、培养时间、pH值、需氧性质等)，1g(1mL)检样中所含菌落的总数。
所得结果只包括一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性菌落总数。
测定菌落总数便于判明样品被细菌污染的程度，是对样品进行卫生学总评价的综合依据。
3 仪器和设备三角瓶。
量筒。
pH计或精密pH试纸。
高压灭茵器。
试管。
平皿：直径9cm。
刻度吸管： 10mL、2mL、1mL。
酒精灯。
恒温培养箱。
放大镜。
4 培养基和试剂生理盐水：见总则中。
卵磷脂、吐温80—营养琼脂培养基4.2.1 成分：蛋白胨20g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15g卵磷脂1g吐温80 7g蒸馏水1000mL4.2.2 制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80，将其他成分(除琼脂外)加到其余的蒸馏水中，溶解。
加入已溶解的卵磷脂、吐温80，混匀，调pH值为～，加入琼脂，(15 lb)20min高压灭菌，储存于冷暗处备用。
%氯化三苯四氮唑(2,3,5-triphenyl terazolium chloride,TTC)成分： TTC 0.5g蒸馏水 100mL溶解后过滤，(15 lb)20min高压灭菌，装于棕色试剂瓶，置4℃冰箱备用。
5 操作步骤用灭菌吸管吸取1:10稀释的检液2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。
另取1mL注入到9mL灭菌生理盐水试管中(注意勿使吸管接触液面)，更换一支吸管，并充分混匀，制成1:100检液。
吸取2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。
如样品含菌量高，还可再稀释成1:1000，1:10000，……等，每种稀释度应换1支吸管。
将融化并冷至45℃～50℃的卵磷脂吐温80营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置37℃培养箱内培养48h。
另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约15mL卵磷脂吐温80营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置37℃培养箱内培养48h，为空白对照。
为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每100mL卵磷脂吐温80营养琼脂中加入%的TTC溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变化。
6 菌落计数方法先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5～10倍的放大镜检查，以防遗漏。
记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。
若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。
若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2，以代表全皿菌落数。
7 菌落计数及报告方法首先选取平均菌落数在30～300个之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。
当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数(见表1中例1)。
若有两个稀释度，其平均菌落数均在30～300个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于2，应报告其平均数，若大于2则报告其中稀释度较低的平皿的菌落数(见表1中例2及例3)。
若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1中例4)。
若所有稀释度的平均菌落数均小于30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1例5)。
若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1中例6)。
若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每g或每mL小于10CFU。
菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。
为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示(见表1报告方式栏)。
在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。
表1 菌落计数结果及报告方式＊CFU：菌落形成单位。
三、粪大肠菌群Fecal Coliforms1 范围本规范规定了化妆品中粪大肠菌群的检验方法。
本规范适用于化妆品中粪大肠菌群的检验。
2定义本规范采用下列定义粪大肠菌群(Fecal coliforms)系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，在44.5℃培养24h～48h能发酵乳糖产酸并产气。
该菌来自人和温血动物粪便，是重要的卫生指示菌。
3 仪器恒温水浴箱或隔水式恒温箱：44℃±0.5℃。
温度计。
显微镜。
载玻片。
接种环。
电炉。
三角瓶。
试管。
小倒管。
pH计或pH试纸。
高压灭茵器。
刻度吸管：10mL、2mL、1mL。
平皿。
4 培养基和试剂双倍乳糖胆盐培养基成分：蛋白胨40g猪胆盐10g乳糖10g%溴甲酚紫水溶液5mL蒸馏水1000mL制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶解于蒸馏水中，调pH到，加入%溴甲酚紫水溶液5mL，混匀，分装试管(每支试管中加一个小倒管)。
(10 lb)20min灭菌。
伊红美兰(EMB)琼脂成分：蛋白胨10g乳糖10g磷酸氢二钾2g琼脂20g2%伊红水溶液20mL%美蓝水溶液13mL蒸馏水1000mL制法：先将琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾、蛋白胨，混匀，使之溶解。
再以蒸馏水补足至1000mL。
校正pH值为～，分装于三角瓶内，(15 lb)15min高压灭菌备用。
临用时加入乳糖并加热融化琼脂。
冷至60℃左右无菌操作加入灭菌的伊红美蓝溶液，摇匀。
倾注平皿备用。
蛋白胨水(作靛基质试验用)成分：蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g氯化钠5g蒸馏水1000mL制法：将上述成分加热融化，调pH值为～，分装小试管，(15 lb)15min高压灭菌。
靛基质试剂柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25mL。
试验方法：接种细菌于蛋白胨水中，于44±0.5℃培养24h。
沿管壁加柯凡克试剂～，轻摇试管。
阳性者于试剂层显深玫瑰红色。
注：蛋白胨应含有丰富的色氨酸，每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。
革兰氏染色液：4.5.1 染液制备4.5.1.1 结晶紫染色液：结晶紫1g95%乙醇20mL1%草酸铵水溶液80mL将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
4.5.1.2 革兰氏碘液：碘1g碘化钾2g蒸馏水加至300mL将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。
4.5.1.3 脱色液：95%乙醇。
4.5.1.4 复染液：a. 沙黄复染液：沙黄0.25g95%乙醇10mL蒸馏水90mL将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
b. 稀石碳酸复红液：称取碱性复红10g，研细，加95%乙醇100mL，放置过夜，滤纸过滤。
取该液10mL，加5%石碳酸水溶液90mL混合，即为石碳酸复红液。
再取此液10mL加水90mL，即为稀石碳酸复红液。
4.5.2 染色法4.5.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。
4.5.2.2 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。
4.5.2.3 滴加95%乙醇脱色，约30s，或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s，水洗。