微生物限度检查方法适用性试验方案模板2015版药典
验证文件
类别：
编号：
部门：
XXXX微生
物限度检查方法适用性试验方案
XXXXX公司
2016年
XXXX微生物限度检查方法适用性试验方案审批
目录
1、适用范围
2、目的
3、概述
4、适用性所需要的仪器设备及文件
5、可接受的限度范围标准
6、测试方法
7、异常情况处理
8、测试结果
9、结论
10、再适用性周期
11、附表
1、适用范围
本适用性方案适用于XXXX微生物限度检查的方法适用性试验。
2、目的
因《中华人民共和国药典》（2015年版）颁布实施，为确保该产品的微生物限度检查方法的可靠性和可操作性，故对其检验方法进行适用性试验，以符合《中华人民共和国药典》规定。
3、概述
3.1根据《中华人民共和国药典》2015年版四部通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法，对XXXX进行需氧菌、霉菌和酵母菌、大肠埃希菌检查方法的适用性试验，以确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性。
3.2适用性试验时间及批号：年月日开始分别对、、三
批XXXX进行独立的方法适用性试验。
3.3验证小组
4、仪器设备及文件
4.1需用仪器设备
5、可接受的限度范围标准
5.1XXXX微生物限度检查质量标准
5.2需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法采用《中华人民共和国药典》2015版四部通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法中叙述的平皿法中的倾注法。
控制菌检查方法采用1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法中大肠埃希菌检查方法
6、测试方法
6.1供试品 XXXX 批号：
6.2培养基及菌种
6.2.1采用符合中国药典规定的干燥培养基，并经过培养基适用性检查。
胰酪大豆胨琼脂培养基批号：胰酪大豆胨液体培养基批号：
沙氏葡萄糖琼脂培养基批号：沙氏葡萄糖液体培养基批号：
麦康凯琼脂培养基批号：麦康凯液体培养基批号：
MUG培养基批号：
6.2.2菌种均购于：
6.3菌液制备
6.3.1需氧菌、霉菌和酵母菌的检查菌液制备
6.3.1.1接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌适量至胰酪大豆胨液体培养基中， 30～35℃培养18～24小时，取上述培养物一定量用PH
7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成制成适宜浓度的菌悬液，备用。
6.3.1.2接种白色念珠菌适量至沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3天，取上述培养物一定量用PH
7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。
6.3.1.3接种黑曲霉适量至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养5～7天，加入3～5ml 的含 0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的PH
7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含 0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液，备用。
菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在适用性过程的贮存期内使用。
6.3.2控制菌的检查菌液的制备
接种大肠埃希菌适量至胰酪大豆胨液体培养基中， 30～35℃培养18～24小时，取上述培养物用PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成制成适宜浓度的菌悬液，备用。
菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃可在24小时内使用。
菌落数确认
6.4需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数计数方法适用性试验
6.4.1供试液的制备
取供试品10g ，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml ，制成1：10的供试液。
6.4.2实验步骤 6.4.2.1试验组
分别取5份1：10的供试液各10ml 分别加入0.1ml 试验菌液（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉）混匀，使每1ml 供试液中含菌量不大于100cfu 。
取1ml 含试验菌液的供试液分别注入无菌平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿。
另取1ml 含白色念珠菌和黑曲霉的供试液分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿。
按平皿法测定其菌落数，胰酪大豆胨琼脂培养基用于需氧菌总数计数，沙氏葡萄糖琼脂培养基用于霉菌、酵母菌总数计数。
6.4.2.2供试品对照组
取制备好的供试液，以稀释液替代菌液同试验组操作。
6.4.2.3菌液组
取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。
6.4.2.4阴性对照
取相应稀释液代替供试液和菌液同试验组操作。
6.4.3培养和计数：
胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30～35℃培养3～5天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20～25℃培养5天，观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。
菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。
点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。
若同稀释级别两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。
6.4.4计算公式
数
菌液对照组的平均菌落数
供试品对照组平均菌落试验组平均菌落数试验组的菌回收率-=
6.4.5结果判断
试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内，可用所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。
若还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求，那么选择回收最接近要求的方法和
试验条件进行供试品的检査。
6.5控制菌大肠埃希菌
6.5.1供试液制备
取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10的供试液
6.5.2试验分组
6.5.2.1试验组
取制备好的1:10的供试液10ml，加入0.1ml含菌数50～100cfu的大肠埃希菌菌悬液，置100ml灭菌胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置30～35℃培养18～24h。
6.5.2.2供试品组
取制备好的1:10的供试液10ml，置100ml灭菌胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置30～35℃培养18～24h。
6.5.2.3阴性对照组
取制备好的PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml，置100ml灭菌胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置30～35℃培养18～24h。
6.5.2.4阳性对照组
取稀释液10ml代替供试液，加入0.1ml 50～100cfu的大肠埃希菌菌悬液，置100ml灭菌胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置30～35℃培养18～24h。
6.5.3取上述培养物1ml，接种至100ml的麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时。
取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。
若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。
大肠埃希菌的鉴定应显MUG与靛基质阳性。
6.5.4结果判断
若试验组检出试验菌，可按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法适用性试验。
7、异常情况处理
严格按照微生物限度检查法操作，如在检测中出现不符合要求的情况出现，分析问题原因后，决定是否需对本方案中设定的XXXX的微生物限度检查方法进行修改，并重新进行方法适用性试验。
8测试结果
8.1需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验结果见附表1至3。
8.2大肠埃希菌检查方法适用性试验结果见附表4-6。
9结论
10再适用性周期
10.1XXXX因其它因素变更导致XXXX的物料性质改变时，需要对本方案进行调整后作方法学再适用性试验。
10.2国家相关微生物限度检查标准修改后需要对本方法重新进行方法再适用性试验。
2015版中国药典微生物限度解析
（MPN法） 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用
性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、计数方法适用性试验。 1.4 供试品检查：检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基
1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检 验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
30～35 ℃ 不超过3天
20～25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量50~100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
• 供试品微生物计数中所使用的培养基应进 行适用性检查。
• 供试品的微生物计数方法应进行方法适用 性试验【10版：方法验证】， 以确认所 采用的方法适合于该产品的微生物计数。
• 若检验程序或产品发生变化可能影响检验 结果时， 计数方法应重新进行适用性试 验。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
微生物限度检查方法适用性验证方案
目录1.概述 (2)1.1验证目的 (2)1.2验证频次 (2)1.3适用范围 (2)1.4参照标准 (2)1.5验证小组人员及职责 (2)2.试验前准备 (3)2.1验证所需的文件资料 (3)2.2验证条件 (3)2.3回收试验 (5)2.4结果判断 (7)1.概述1.1验证目的进行产品的微生物计数检查时，应进行方法适用性试验（即微生物回收试验），以确认所采用的方法适合于微生物限度检查。
本次验证的目的就是确认本法适合生产原料、初包装材料、一次性妇用（壳聚糖）生物高分子止血吸附栓的微生物限度检查。
1.2验证频次1.2.1建立生产原料、初包装材料一次性妇用（壳聚糖）生物高分子止血吸附栓的微生物限度检查法时。
1.2.2检验方法更改时。
1.2.3原料、初包装材料、产品发生变化或检验程序发生改变时。
1.3适用范围生产原料、初包装材料、一次性妇用（壳聚糖）生物高分子止血吸附栓的微生物限度检查。
1.4参照标准2015版《中国药典》第四部通则。
2.验证前准备2.1验证所需的文件资料2.2验证条件2.2.1环境要求微生物计数检查在万级洁净区内的百级单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。
单向流空气区与工作台面必须进行洁净度验证。
2.2.3验证用培养基所有培养基均采用即用型培养基，临用时按使用说明使用。
2.2.4验证用菌株：菌种来源（）2.2.5菌液制备-表3-接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30〜35℃培养18〜24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20〜25℃培养24〜48小时，上述培养物用PH7.0无菌氣化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氣化钠溶液制成每lml含菌数小于l00cfu(菌落形成单位）的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20〜25℃培养5〜7天，加入3〜5ml含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的pH7无菌氣化钠-蛋白胨缓冲液或0.9% 无菌氣化钠溶液，将孢子洗脱。
2015版中国药典纯化水微生物限度检测方法验证方案
2015版中国药典纯化⽔微⽣物限度检测⽅法验证⽅案1. 审批起草⼈签名：审核⼈签名：批准⼈签名：2. ⽬录1.审批 (1)2.⽬录 (2)3.⽬的 (3)4.范围 (3)5.职责 (3)6.执⾏程序 (4)7.描述 (4)8.⽅法验证 (4)8.1.⼈员培训 (4)8.2.⽂件确认 (5)8.3.仪器确认 (5)8.4.供试品确认 (6)8.5.培养基及缓冲液确认 (6)8.6.菌种确认 (7)8.7.培养基 (7)8.8.菌种：枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌。
(7)8.9.供试品制备 (8)8.10.试验结果 (9)8.11.验证结果分析与评价 (10)9.偏差处理 (10)10.变更控制 (10)11.附件⽇志 (11)12.再验证 (11)13.参考书⽬ (11)14.修订历史 (12)3. ⽬的纯化⽔微⽣物限度检查采⽤薄膜过滤法，验证该⽅法适⽤于纯化⽔中需氧菌总数的测定。
4. 范围本验证⽅案适⽤于上海XXXX有限公司QC实验室，对纯化⽔微⽣物限度检查⽅法（薄膜过滤法）适⽤性的验证。
5. 职责5.1. 验证⼩组组成：5.2. 验证⼩组组长负责5.2.1. 组织起草或审核验证⽅案及变更申请；5.2.2. 对验证⼩组成员进⾏培训；5.2.3. 验证⽅案的组织实施；5.2.4. 对验证过程中的记录审核，保证其真实性、可靠性和完整性；5.2.5. 组织验证报告的起草、汇总并参与对其进⾏审核及验证周期的拟定。
5.3. QA参与⼈员负责5.3.1. 审核验证⽅案、报告及报告中出现的偏差、变更；5.3.2. 参与验证⽅案的实施及评价；5.3.3. 对验证⽅案及报告进⾏编号并纳⼊验证⽂件系统且归档。
5.4. QC参与⼈员负责5.4.1. 起草验证⽅案；5.4.2. 已经批准的验证⽅案的具体实施；5.4.3. 收集测试数据，应评估数据并对测试数据做出评论；5.4.4. 参与偏差调查、变更申请等；5.4.5. 起草验证报告。
2015版中国药典纯化水微生物限度检测方法验证方案
2015版中国药典纯化水微生物限度检测方法验证方案1. 审批起草人签名：审核人签名：批准人签名：2. 目录1. 审批............................................................................................................... . (1)2. 目录............................................................................................................... . (2)3. 目的............................................................................................................... . (3)4. 范围............................................................................................................... . (3)5. 职责............................................................................................................... . (3)6. 执行程序............................................................................................................... .. (4)7. 描述............................................................................................................... . (4)8. 方法验证............................................................................................................... .. (4)8.1.8.2.8.3.8.4.8.5.8.6.8.7.8.8.8.9.8.10.8.11. 人员培训............................................................................................................... ...................................4 文件确认............................................................................................................... ...................................5 仪器确认............................................................................................................... ...................................5 供试品确认............................................................................................................... ...............................6 培养基及缓冲液确认............................................................................................................... ...............6 菌种确认............................................................................................................... ...................................7 培养基............................................................................................................... .......................................7 菌种：枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌。
2015版中国药典微生物限度解析
《中国药典》2015年版修订后将分为三个附录： – 1、非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法 – 2、非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法 – 3、非无菌药品微生物限度标准
1.非无菌产品微生物限度检查： ----微生物计数法
1.1 总则：环境、要求 1.2 计数方法：平皿法、薄膜过滤法、最可能数法
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– 根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适 宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温 时,应均匀加热,且温度不应超过 45℃。供试 液从制备至加入检验用培养基,不得超过 1小 时。
– 常用的供试液制备方法如下。如果下列供试 液制备方法经确认均不适用，应建立其他适 宜的方法。
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量不大于100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平 均数的比值应在0.5-2 范围内，且菌落形态大小应与对 照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培 养基管比较，试验菌应生长良好。
• 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动 检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定 的检查方法。
不适用于活菌制剂的检查
1.1 总则：
• 环境： – 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要 求。(在不低于GMP 现行版要求的D 级洁净环境 、局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进 行)【10版：在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内】【 20版：不低于 D级背景下的生物安全柜或B级洁净区域内进行】 – 检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染 ，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检 出。 – 单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监 测。
微生物限度检查方法适用性试验方案模板2015版药典
微生物限度检查方法适用性试验方案模板2015版药典验证文件类别：编号：部门：XXXX微生物限度检查方法适用性试验方案XXXXX公司2016年XXXX微生物限度检查方法适用性试验方案审批目录1、适用范围2、目的3、概述4、适用性所需要的仪器设备及文件5、可接受的限度范围标准6、测试方法7、异常情况处理8、测试结果9、结论10、再适用性周期11、附表1、适用范围本适用性方案适用于XXXX微生物限度检查的方法适用性试验。
2、目的因《中华人民共和国药典》（2015年版）颁布实施，为确保该产品的微生物限度检查方法的可靠性和可操作性，故对其检验方法进行适用性试验，以符合《中华人民共和国药典》规定。
3、概述3.1根据《中华人民共和国药典》2015年版四部通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法，对XXXX进行需氧菌、霉菌和酵母菌、大肠埃希菌检查方法的适用性试验，以确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性。
3.2适用性试验时间及批号：年月日开始分别对、、三批XXXX进行独立的方法适用性试验。
3.3验证小组4、仪器设备及文件4.1需用仪器设备5、可接受的限度范围标准5.1XXXX微生物限度检查质量标准5.2需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法采用《中华人民共和国药典》2015版四部通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法中叙述的平皿法中的倾注法。
控制菌检查方法采用1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法中大肠埃希菌检查方法6、测试方法6.1供试品 XXXX 批号：6.2培养基及菌种6.2.1采用符合中国药典规定的干燥培养基，并经过培养基适用性检查。
胰酪大豆胨琼脂培养基批号：胰酪大豆胨液体培养基批号：沙氏葡萄糖琼脂培养基批号：沙氏葡萄糖液体培养基批号：麦康凯琼脂培养基批号：麦康凯液体培养基批号：MUG培养基批号：6.2.2菌种均购于：6.3菌液制备6.3.1需氧菌、霉菌和酵母菌的检查菌液制备6.3.1.1接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌适量至胰酪大豆胨液体培养基中， 30～35℃培养18～24小时，取上述培养物一定量用PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成制成适宜浓度的菌悬液，备用。
2015年版中国药典微生物限度检查技术方法意见稿
附录×××非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。
微生物计数试验应在受控洁净环境环境洁净度10 000 级下的局部洁净度不低于B100 级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行监测。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-NumberMethod，简称MPN 法）。
MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN 法可能是更适合的方法。
供试品检查时, 应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，同时所选的方法的供试品用量必须具备检测充足样品量的能力，能够以保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。
表 1 试验菌液的制备和使用试验菌株试验菌液的制备计数培养基适用性检查计数方法适用性试验需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数计数需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数计数金黄色葡萄球菌〔CMCC(B)26 003)〕胰酪大豆胨琼脂或胰酪大豆胨肉汤，培养温度30 ～35℃，培养时间18～24小时胰酪大豆胨琼脂和胰酪大豆胨肉汤，培养温度30 ～35℃，培养时间不超过3 天，接种量不大于100cfu胰酪大豆胨琼脂/ 胰酪大豆胨肉汤（MPN 法），培养温度30～35℃，培养时间不超过 3 天，接种量不大于100cfu铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）〔CMCC（B）10 104〕胰酪大豆胨琼脂或胰酪大豆胨肉汤，培养温度30 ～35℃，培养时间18～24小时胰酪大豆胨琼脂和胰酪大豆胨肉35℃，培养时间不超过3 天，接种量不大于100cfu胰酪大豆胨琼脂/ 胰酪大豆胨肉汤（MPN 法），培养温度30～35℃，培养时间不超过 3 天，接种量不大于100cfu枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)〔CMCC(B) 63 501〕胰酪大豆胨琼脂或胰酪大豆胨肉汤，培养温度30 ～胰酪大豆胨琼脂和胰酪大豆胨肉汤，培养温度30 ～胰酪大豆胨琼脂/ 胰酪大豆胨肉汤（MPN 法），培养温度注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基灵敏度检查，检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基。
微生物限度检查方法适用性试验方案
微生物限度检查方法适用性试验方案验证方案组织与实施微生物限度检查方法适用性试验工作应由质量管理部门负责组织，质量管理部门有关人员组成验证小组，参与实施。
方案起草方案审核方案批准目录一、概述二、验证目的和风险评估三、验证内容四、方法判定五、再验证周期六、参考文献七、结果评价及结论1、概述：微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括需氧菌数、霉菌数和酵母菌数及控制菌检查。
当建立产品的微生物限度检查法时，应进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法的适用性试验和控制菌检查方法的适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌、霉菌和酵母菌数的测定和控制菌检查。
由于依照中国药典2010版的检查方法验证,需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌均采用平皿法。
故现升级为中国药典2015版，需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌均采用平皿法进行方法适用性试验。
2、试验目的和风险评估：验证目的：确认所采用的需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法及控制菌检查方法适合我公司所生产产品的微生物限度检查。
风险评估：3、验证内容：3.1、培养基来源：确认人：确认日期：3.2、检查用培养基配制方法：确认人：确认日期：3.3、使用仪器确认人: 确认日期：3.4、验证试验用菌种：确认人：确认日期：3.5试验方法：取供试品 10 g加PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml→1:10供试液。
需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌采用常规法。
3.6菌液的制备：3.6.1取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨琼脂斜面培物一铂金饵，加入胰酪大豆胨液体培养基中置30～35℃培养箱中培养18～24h，取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体培养物1ml加入9ml0.9％无菌氯化钠溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀释至10～7，分取各菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。
2015版微生物限度检查方法验证方案
验证文件扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司目录一、验证概述 (2)1.验证对象 (2)2.验证原因 (2)3.验证目的 (2)4.验证要求 (2)二、验证组织机构和职责 (3)1.职责 (3)2.组织机构 (4)三、验证风险评估及范围 (6)1.严重性（S） (6)2.可能性（O） (7)3.可检测性（D） (8)4.风险优先数量等级判定（RPN） (9)四、验证实施计划 (35)五、验证准备 (36)1.验证依据 (36)2.验证条件 (36)六、验证内容 ......................................... 错误!未定义书签。
七、验证异常情况处理 (54)八、验证结论 (55)九、再验证周期 (56)十、附件 (56)一、验证概述1.验证对象本次验证的对象为阿戈美拉汀片（25mg）微生物限度检查法。
2.验证原因对阿戈美拉汀片（25mg）微生物限度检查法进行适用性验证。
3.验证目的确认阿戈美拉汀片（25mg)微生物限度检查法的可靠性。
4.验证要求验证过程需严格按方案中规定的步骤进行。
对于验证过程中出现的所有偏差，应查明原因并得到有效处理后，验证方可进入下一步骤。
二、验证组织机构和职责1.职责1.1.质量受权人—验证文件的批准。
—组织验证工作的实施及各部门的协调，保证验证工作有序的进行。
1.2.质量管理部—现场监督保证整个操作过程按照验证计划进行。
—负责验证方案的审核，及操作过程中对验证文件修订的审核工作。
—验证文件的归档工作。
—按照验证方案要求对操作过程中的样品抽样检测。
—涉及到的仪器仪表的校验，以及一些相关的化验工作。
1.3.质量控制实验室—负责验证文件的起草工作。
—负责验证文件的审核工作。
—验证方案起草人员现场对操作过程进行指导。
—对验证实施过程中资料和数据进行汇总并完成验证报告。
—需要时与相关部门的协调工作。
1.4.供应部按照验证物资采购计划进行物资采购。
2.组织机构2.1验证领导小组2.2.验证实施小组三、验证风险评估及范围根据SOP6-00001《验证管理规程》对验证的相关要求，对检测过程中可能影响检测结果的因素进行风险分析。
2015版中国药典微生物限度
性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、计数方法适用性试验。 1.4 供试品检查：检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基
1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检 验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
30～35 ℃ 不超过3天
20～25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量50~100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
3. MPN 法
– 取规定量供试品，按方法适用性试验确认的 方法进行供试液制备和供试品接种，所有试 验管在30～35℃培养3～5 天，如果需要确 认是否有微生物生长，按方法适应性试验确 定的方法进行。记录每一稀释级微生物生长 的管数，从表3查对每1g 或1ml 供试品中需 氧菌总数的最可能数。
1.5结果判断
菌数报告规则
– 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜 选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为 菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最 高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm² 供 试品中所含的微生物数。
– 如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低 稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小 于1 时，以﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。