免疫酶技术
免疫酶技术的原理及应用
免疫酶技术的原理及应用免疫酶技术是一种通过使用特定的抗体与抗原相互作用，然后利用酶的活性来检测和分析目标分子的方法。
其原理主要涉及到两个关键步骤：抗原-抗体结合和酶的活性检测。
首先，免疫酶技术的第一步是抗原-抗体结合。
抗原是指引起机体免疫反应的分子，抗体则是由机体产生的对特定抗原具有高度特异性的蛋白质。
在免疫酶技术中，抗原和抗体通过它们之间的亲和性结合在一起。
这一步通常称为“抗原-抗体反应”。
通过特定的反应条件和各种试剂，可以使抗原和抗体结合形成抗原-抗体复合物。
接下来的关键步骤是酶的活性检测。
在免疫酶技术中，通常选择一种酶来标记或连接到抗体上。
当抗原-抗体复合物形成后，酶会与复合物结合。
最常用的酶包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
一旦复合物与酶结合，就可以加入特定的底物，使酶开始催化底物的转化。
这种底物通常是可以产生颜色变化或发光的物质。
通过对底物的催化反应，酶会产生可测量的信号。
这种信号包括吸光光度、荧光或发光强度等。
这种信号与目标分子的存在呈正相关关系。
因此，可以通过测量信号的强度来确定目标分子的存在和相对数量。
免疫酶技术具有广泛的应用。
其中包括：1. 疾病诊断：免疫酶技术可用于检测和诊断多种疾病，如感染性疾病、肿瘤标志物、自身免疫性疾病等。
通过测量特定标志物的存在和浓度，可以实现早期疾病检测和诊断。
2. 药物研发：免疫酶技术可用于筛选和评估新药物的活性和效果。
通过测量目标分子在药物处理后的变化，可以评估药物的疗效和毒副作用。
3. 环境监测：免疫酶技术可用于环境监测和污染物检测。
通过检测水体、土壤、空气中的污染物，可以评估环境污染的程度和影响。
4. 食品安全：免疫酶技术可用于食品安全监测和检测食品中的有害物质、过敏原等。
这对于确保食品质量和保护消费者的健康至关重要。
总之，免疫酶技术通过结合特异性抗体和酶活性，能够准确、快速地检测和分析目标分子。
它在医学、生物学、环境科学等领域具有广泛的应用价值。
免疫学--酶免疫技术
2. 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP) 特点： 分子量较大，不易透入细胞，敏感性较高。
3 . β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-Gal) 特点：
不易受内源性酶的影响，常用于均相免疫 测定。
(三)常用的底物 1. HRP的底物 (1) 常用的过氧化物为H2O2 (2) 常用的供氢体为:
Indirect ELISA
Indirect ELISA
Anti-Antibody Enzyme
Substrate
Anti-A
Product
A
（三）竞争法: 可用于测抗原或抗体
如测抗原:
测定管中加有被检Ag, 与Ag* 竞争结合固相Ab， Ag*与Ab结合减少。加酶底物显色后，阴性对照管 显色深；测定管则由于被检抗原量的多少而显色深 浅不同(成反比)。
一、技术原理
酶免疫技术是用酶作标记物标记抗原或抗体， 将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一 性结合在一起的一种免疫检测技术。
抗原抗体反应完成后，加入酶相应的底物， 通过酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、 定性或定量分析。
特点
❖ 敏感性高 ❖ 操作简单 ❖ 安全环保 ❖ 对抗体（抗原）分子天然结构和一定影响
EIHCT
酶免疫技术
均相EIA
EIA 异相EIA
固相EIA 液相EIA
抗原抗体反应完毕后,检测酶活性时是否需 要将游离的和结合的酶标记物进行分离,将酶 免疫测定技术分为均相EIA和异相EIA.
第二节 酶标记物的制备
一、酶及底物
(一) 酶的选择要求 ？
1. 酶活性高 2. 稳定：
标记后不影响酶活性及抗原、抗体的免疫反应性。
酶免疫技术的实验报告
酶免疫技术的实验报告实验目的：本实验旨在通过酶免疫技术（Enzyme Immunoassay, EIA）来检测特定抗原或抗体的存在，了解其原理和应用，提高实验操作技能。
实验原理：酶免疫技术是一种利用酶标记的抗体或抗原进行检测的方法。
它结合了酶的催化活性和免疫反应的特异性，通过酶的催化作用放大信号，提高检测的灵敏度。
常用的酶免疫技术包括酶联免疫吸附测定（ELISA）等。
实验材料：1. 待测样本：含有目标抗原或抗体的生物样本。
2. 酶标记的抗体或抗原：用于与待测样本特异性结合。
3. 酶底物：与酶反应产生可检测的信号。
4. 标准品：用于建立标准曲线，定量分析。
5. 洗涤液：用于去除未结合的酶标记物。
6. 酶标仪：用于测定吸光度或荧光强度。
实验步骤：1. 准备实验所需的试剂和材料，包括待测样本、酶标记物、酶底物、标准品等。
2. 根据实验设计，选择合适的ELISA方法（直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA等）。
3. 将待测样本和标准品按照一定比例稀释，并加入到预先包被的酶标板中。
4. 孵育一定时间后，用洗涤液清洗酶标板，去除未结合的样本和酶标记物。
5. 加入酶底物，使酶催化底物产生可检测的信号。
6. 在酶标仪上测定吸光度或荧光强度，记录数据。
7. 根据标准品的吸光度或荧光强度，建立标准曲线，计算待测样本中目标抗原或抗体的浓度。
实验结果：通过实验操作，我们得到了以下结果：- 标准曲线的建立：根据标准品的吸光度或荧光强度，绘制出标准曲线，其线性关系良好。
- 待测样本的定量分析：根据标准曲线，计算出待测样本中目标抗原或抗体的浓度。
实验讨论：在本实验中，我们成功地应用了酶免疫技术来检测特定抗原或抗体的存在。
实验结果表明，酶免疫技术具有较高的灵敏度和特异性，适用于生物医学研究和临床诊断。
然而，实验过程中也存在一些局限性，如酶标记物的稳定性、非特异性结合等问题，需要进一步优化实验条件。
实验结论：通过本次实验，我们掌握了酶免疫技术的原理和操作流程，能够利用该技术进行生物样本中特定抗原或抗体的检测。
免疫酶技术的原理及应用
免疫酶技术的原理及应用1. 什么是免疫酶技术？免疫酶技术是一种利用抗体-抗原相互作用进行生物分析的方法。
它通过利用抗体与特定抗原结合的高度特异性，将酶标记的抗体用于检测和定量目标分子，广泛应用于医学、生物学和生物化学等领域。
2. 免疫酶技术的原理免疫酶技术的原理是基于抗原与抗体之间的高度特异性结合。
一般来说，免疫酶技术包括以下几个步骤：2.1 抗原的制备首先，需要获得目标分子的抗原。
抗原可以是蛋白质、多肽、病毒、细胞表面蛋白等。
通常，抗原会被纯化并加工成适合免疫动物生产抗体的形式。
2.2 抗体的制备接下来，需要制备与目标分子结合的特异性抗体。
通常，抗原会被免疫动物（如兔子、小鼠等）注射，形成抗体。
2.3 酶标记的抗体制备为了便于检测和定量目标分子，可以将酶标记与抗体结合，形成酶标记的抗体。
常用的酶标记包括辣根过氧化酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。
2.4 抗原-抗体结合反应将样品中的目标分子与酶标记的抗体一起孵育，使抗原与抗体发生特异性结合。
这样，目标分子就被标记上了酶，成为可检测的复合物。
2.5 酶的作用和检测添加适当的底物和辅助试剂后，酶会催化底物的反应，产生可测量的信号。
常见的底物有TMB（3，3′，5，5′-四甲基苯基二氨基甲烷）、BCIP（溴硝基硼邻萘酚磷酸盐）等。
3. 免疫酶技术的应用免疫酶技术在医学、生物学和生物化学等领域有广泛的应用。
以下是免疫酶技术的一些常见应用：3.1 免疫诊断免疫酶技术在临床诊断中被广泛应用。
例如，ELISA（酶联免疫吸附测定法）通过检测血清中特定抗原或抗体的浓度，可以用于诊断疾病，如各类感染病、自身免疫性疾病等。
3.2 蛋白质检测和定量免疫酶技术可以用于检测和定量蛋白质。
例如，Western blotting可以检测特定蛋白质在混合蛋白中的表达情况，通过与标准曲线比较，可以定量目标蛋白的含量。
3.3 免疫组织化学免疫组织化学是一种在组织切片上检测特定蛋白质表达的方法。
酶免疫技术
酶免疫技术（Enzyme Immunoassay，EIA）了解：1.酶免疫技术中相关技术环节2.酶免疫测定的应用理解：1.酶免疫技术的分类、测定原理及主要类型2.酶免疫技术的特点掌握：ELISA的基本原理、主要类型、方法、步骤、结果判断一、酶免疫技术概述（一）基本原理：利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原-抗体反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。
EIA：抗原抗体反应的特异性、酶高效催化的专一性（二）基本特点：1.①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性2.②酶促反应专一性，保证特异性3.③底物反应放大作用，提高敏感性4.④酶标试剂保存稳定5.⑤操作简便，安全易行（三）主要试剂的制备与要求：1.酶与酶作用底物(1)用于标记酶的要求：①酶活性高②标记后酶活性稳定,不影响抗原抗体的免疫反应性③酶催化底物后信号易判定或测定④酶活性不受样品中其他成分的影响⑤酶、辅因子及底物理化性质稳定,安全无害、价廉2.酶标记抗体或抗原(1)通过化学反应或者免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成结合物，也称酶标志物或酶结合物。
(2)酶结合物（conjugate）：①酶免疫技术的核心组成部分②直接影响酶免疫技术的应用效果③它的制备是酶免疫技术中非常关键的一个环节①戊二醛交联法②改良过碘酸钠法（直接法）3.固相载体目的：分离游离和结合的酶标志物(1)基本要求①结合容量高，结合稳定②可与抗原抗体复合物等大分子蛋白结合③生物大分子固化后仍保持活性④固化方法简便易行、快捷经济(2)固相载体的种类与选择1)塑料制品（聚苯乙烯）：材料经济，操作简便，易于自动化，最常用2)微颗粒（免疫磁珠）：结合容量大，反应迅速，普遍用于自动化分析3)膜载体（western-blot）：硝酸纤维素膜（NC）、尼龙膜等微孔滤膜，广泛应用于定性或半定量的斑点ELISA (3)包被与封闭1)包被（coating）：将抗原或抗体结合在固相载体上的过程，一般采用偏碱（pH 9.6）的碳酸盐溶液2)封闭（blocking）：1％-5％牛血清白蛋白或5％-20％小牛血清，再包被以消除固相载体未覆盖位点产生的非特异干扰二、酶免疫技术的分类（一）均相酶免疫测定基本原理利用酶标抗体结合抗原形成复合物后，标记酶的活性发生改变的原理，在不将复合物与游离酶标抗体分离的情况下，直接测定系统中总的标记酶活性的改变，进而推算出待检样品中的抗原量。
酶免疫技术原理
酶免疫技术原理酶免疫技术是一种常用的实验技术，其原理是将酶标记的抗体与待检测物相互作用，通过检测酶标记的反应产物来间接检测待检测物的存在或浓度。
酶免疫技术可以用于检测抗体、蛋白质、核酸等生物分子，也可以用于定量或半定量分析。
酶免疫技术的步骤通常包括以下几个步骤：1.抗原或抗体的加样和固定将待检测物加入到试剂盒中的孔洞中，然后使其在盒子表面固定。
2.疫苗抗体的反应将已知的疫苗抗体加入到试剂盒孔洞中，使其与待检测物结合。
3.标记酶的加入将用于标记酶的物质加入到试剂盒孔洞中，使其可以与疫苗抗体结合。
4.洗涤用冷凝水或其他方式，将未结合的物质从孔洞中提取出来，以保证准确性。
5.色素反应加入染料或颜料，使得待检测物和标记酶协同反应，产生色素反应。
6.结果的读取和分析根据产生的颜色和染料的浓度，来分析待检测物的浓度和质量。
酶免疫技术通常有两种形式：1.间接ELISA间接ELISA是酶免疫技术中最常用的一种方法。
它利用酶标记的二抗与待检测物的一抗结合，通过检测酶标记反应产物来间接检测待检测物的存在或浓度。
间接ELISA具有灵敏度高、特异性好、反应快、操作简便等特点。
2.竞争ELISA竞争ELISA是利用酶标记的抗体与水相抗原或待测物相竞争结合的一种方法。
当待测物或水相抗原与标记抗体竞争时，标记抗体附着在固定物上的数量姗姗而后，细胞内的信号会变弱或消失。
通过测定标记抗体的数量，可以计算出被测物质的含量。
酶免疫技术是一种有效的生物分析技术，其通过简单的实验流程和基于酶反应的原理，可以快速准确地检测分析生物分子的存在和浓度。
酶免疫技术在生物医学、环境科学、食品质量检测等领域有广泛的应用。
1.免疫学研究酶免疫技术在免疫学研究中有着重要的作用。
利用酶免疫技术，可以检测和定量各种免疫球蛋白、细胞因子和细胞表面标志物，研究它们在疾病状态和治疗方案中的作用。
2.临床诊断酶免疫技术在临床诊断中也有很重要的应用。
可以用于检测肿瘤标志物、气道标志物和血液蛋白等，帮助诊断癌症、哮喘和重症肌无力等疾病。
第八章酶免疫技术
酶放大免疫分析技术 示意图
克隆酶供体免疫分析示意图
克隆β-D半乳糖苷酶的两种片段： 酶受体（EA）和酶供体（ED）
二、异相酶免疫测定
与均相不同 之处
需分离游离与结合的酶标记物
分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
Ag+Ab-E
AgAb-E+Ab-E
物、激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
1、已知抗体包 被于载体表面
+
竞争法测抗原
-
E
E
E
3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱
E
E
E
2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合
2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合
E
E
3、加酶作用 的底物显色
ELISA检测抗体的方法
间接法
方法
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗 抗体或二抗）加底物显色。
底物显色
1、固相化抗人 IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合
E E E
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
+
E
E
4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
原理
酶标记物与相应的抗原或抗体结合后， 标记酶的活性会发生改变，不用分离结合 和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性 的改变，而确定抗原或抗体的含量。
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
免疫酶技术的优点
免疫酶技术与免疫荧光技术的对比一：免疫酶技术就是用酶(如辣根过氧化物酶)标记已知抗体(或抗原)，然后与组织标本在一定条件下反应，如果组织中含有相应抗原(或抗体)，抗原抗体相互结合形成的复合物中所带酶分子遇到底物时，能催化底物水解、氧化或还原，产生显色反应，这样就可以识别出标本抗原(抗体)分布的位置和性质，通过图像分析并可达到定量的目的。
二：免疫荧光技术虽已广泛应用于免疫学的研究与诊断，但是荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清，免疫酶技术则能克服上述不足，标记免疫酶技术的敏感性更优于免疫荧光法，对石蜡切片标本尤为适用，为免疫病理研究开辟了一条新途径，酶显色产物具有较高的电子密度，经过适当处理还可以进行免疫电镜观察，免疫酶组化技术分为酶标记法与非标记抗体技术，前者是将酶通过交联剂结合在抗体分子上，形成酶标记抗体。
后者是将酶作为抗原与相应的特异性抗体连接进行的免疫反应，称为非标记抗体酶技术。
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2．涂片的要求 无论采用何种酶标记法，若 用涂片法则需要将涂片完全干燥以后方能检 测。若不干燥，在操作过程中易发生脱膜现 象。虽然在前处理时有固定这一步，但为了 使细胞表面的分化抗原少受因固定带来的损 失，往往选择的固定剂和固定时间均不十分 满意。若较薄的涂片标本干燥72小时，可省 略固定这一步，能提高部分细胞分化抗原的 阳性表达。但必须控制好试验的渗透压，以 免细胞破坏。
7．结果观察 结果观察要及时，酶标法虽然可 保存较长时间不褪色，但不如新鲜时颜色鲜艳， 易观察。如对结果有疑问，可重复操作，加以证 实。
8．阳性反应的了解 在检测前应明确被检细胞 的分化抗原所在的部位，即在细胞膜表面和细胞 浆中及细胞核内，以利标本的前处理和阳性结果 的准确判断，以免造成假阴性或阳性结果的误判、 漏判。
湿盒
吸水纸 移液器
镊子
DAKO笔
载玻片
试剂可选即用型试剂 盒(小于100名/年)或 购买原液自行配置 (大于100名/年)
选取厚薄适宜、髓(血)膜较长的骨髓或血涂片一张
用利器将骨髓膜划分成数个小块
划分前
3 10 19 DR
13 68 MPO
金会利 04102
划分后 用铅笔在磨砂玻面处写上与小块骨髓 膜所相应的标记号并写上姓名、检测编号。
目前可选用的标记酶有辣根过氧化物酶 （HRP）、 碱性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化 酶（GOD）、β－D半乳糖苷酶（β－D－Gal） 等。以上这些酶因其纯度和活性及产品性质 相对较稳定且价格适中，广泛地被临床和实 验室所应用
Ab-1（Mo）来自细胞Ab-2（Ho）Ab-3（Mo）
APAAP法染色原理
卵白素
（Avidin）
生物素化Biotion （HRP/AP）
ABC复合物
生物素化二抗
Ab-1
ABC法染色
细胞
原理图
多聚螯合物法(ELPS)
多聚螯合物法的特点
多聚螯合物法应用了一种突破性的技术即多聚物技术， 其在一条多聚肽链上螯合了相对应的第二抗和酶标志物。 此法是近几年来发展较快的一种新的免疫组化技术，更 由于酶连接方式较为直接，可进一步降低操作时一抗的 工作液浓度，可使反应更灵敏、整个背景染色更低、染 色时间短等特点。目前在临床上，特别是临床病理被广 泛应用。
5 非特异性结合的防止 抗体和组织 成分的非特异性结合（Fc受体），也 可引起非特异性染色。另外，由于电 荷性关系，抗体的阴电荷与组织中带 阳电荷的蛋白质发生非特异性粘附， 此时可加入与二抗同一种属源性的血 清加以封闭。
6．抗体孵育操作不当 可造成的背景 吸附及阳性细胞呈局限状产生，使结果 产生假阳性和假阴性。所以在整个操作 过程中均需在湿盒内进行，并注意加抗 体时勿使涂片干枯以免造成抗体分布不 均。
标本种类
可选择：① 新鲜血涂片或骨髓涂片。 ② 体液标本可离心后取沉淀物涂片。 ③ 实体肿瘤标本可采用 a 印片法、 b 穿刺涂片法、c 匀浆法等。
总之，一切有细胞的标本经过处理制成涂片 后均可检测。特别适合对细胞的定性。
选择较薄、长之涂片
1
将骨髓（血）分割成若干小块，间隙 用DAKO笔区分。并作相应记号。
该法也可分为一步法和二步法。一步法是将多聚物酶 分子直接结合在特异性一抗上，而二步法是将多聚物酶 分子连接在第二抗体上。
聚合物支架
Ab-2
Ab-1
酶基团（HRP/AP）
细胞 ELPS法染色原理(二步法)
免疫酶细胞化学技术
1．标本选择的特点 免疫酶标法可选择骨髓涂 片或抽取一定量骨髓液用淋巴细胞分离液提取 出单个核细胞。采用涂片机涂片，无论选用何 种方法，均要求标本新鲜。虽然本法是抗原-抗 体结合反应，但标本采集过久，会造成细胞表 面抗原的丢失。特别是淋巴细胞相关抗原。通 常标本采集一周后，其阳性率可明显下降。
3．标本的保管 标本采集后至结果观察完 毕以前，应尽可能避免接触与实验无关的化学 物品。特别是苯、二甲苯、醚、乙醇、双氧水、 醛等实验室常用试剂。因这些试剂具有强烈的 凝固或氧化蛋白质的作用。使细胞表面的分化 抗原减少，甚至失去，造成假阴性。
❖ 4．试剂的准备 各种试剂购进后，特别 是单克隆抗体，除参考产品说明书，尚 需结合各自的实验室条件，选定最佳稀 释速，即调整一抗、二抗、三抗等之间 的浓度，以求获得最佳特异性染色效果 和最低的非特异性背景干扰。同时每次 检测均需设置阳性细胞和阴性细胞的对 照，以检查方法的可靠性。
免疫酶细胞化学技术
免疫酶细胞化学技术是将抗原－抗体反应的 特异性与酶的高效，快速催化作用彼此结合， 由此形成一种既具有免疫荧光、放射免疫的优 点，又避免了他们的缺点。这项技术的原理和 操作与荧光法有许多相似之处，所不同的是用 酶来替代荧光素作为标志物，并采用底物被酶 分解后的显色反应来显示抗原抗体的结合与否。
9．结果的比较 结果观察的同时，必 须对同一标本的普通染色片（瑞氏染 色或H-E染色）和细胞化学染色结果进 行观察和比较，进一步确定具有临床 意义的病理性细胞和其免疫标记的阳 性情况，尽可能减少误诊和漏诊。
10．阳性标准的确定 结果判断由于受 检测方法、试剂盒的特异性及敏感性， 以及操作技术熟练程度等因素的影响， 其结果判断的标准化问题尚难统一。但 必须掌握阳性细胞定位明确，间质清晰， 无背景染色，病理性细胞阳性表达在5% 以上，才可视为阳性。
2
2357
10 19 20 22
13 14 33 34
68 M D 41
洗涤后，加二抗室温30分钟。
4
洗涤后，加显色液室温3-4 分钟。水洗，复染，待干。
5
固定后，各小块加相应一抗， 切勿混淆。室温30分钟。
3
甘油—明胶封片，镜检。
6
涂片法免疫标记检测流程图
整个操作仅需下列器材 及一台普通光学显微镜 即可。
3 10 19 DR 13 68 MPO 金会利 04102
用DAKO笔在小块骨髓膜之间划上一条蜡膜， 以阻止各小块上所加液体混淆。
13 O
04102
会 利
置入纯丙酮(AR) 固定5-10分钟。
13 M PO
04102
金 会 利
从固定液中取出立 即置入缓冲洗涤液 内浸洗，3×3分钟。
洗涤后取出，轻轻吸干 小块骨髓膜之间的水珠。 然后依次小心滴加单克 隆抗体，绝对不能混淆 和加错。