第二节 乳糖操纵子与负控诱导系统
典型乳糖操纵子的诱导原理
▪ ----操纵基因(operator，O)：是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序 列。
▪ 阻遏物基因(inhibitor,I),产生阻遏物(repressor)。
乳糖操纵子的结构和功能
▪ 三个特异性序列： ▪ 操纵序列 O (operator): 阻遏蛋白结合位点。
▪ 启动子 P (promoter): 位于结构基因的上游。 ▪ CAP结合位点：环cAMP受体蛋白(分解代谢物激活蛋白)结合位点。
▪ 由于Plac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发 生去阻遏使lac操纵元转录开放，还不能使细 菌很好利用乳糖，必需同时有CAP来加强转 录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。
▪ 关键条件：lac操纵元的强诱导既需要有乳糖
的存在又需要没有葡萄糖可供利用。
Lac操纵子基因表达受阻遏蛋白和CAP 的双重调控
本底表达
▪ 在细胞中透性酶等总是以最低量存在着，足 以供给底物开始进入时的需要。也就是说， 操纵子有一个本底水平（basal level）的表 达，即使没有诱导物的存在，也保持此表达 水平（诱导水平的0.1%）；有的诱导物是通 过其他吸收系统进入细胞的。
小结
▪ Lac操纵子基因表达受阻遏蛋白和CAP的双 重调控。
复杂的动力学问题，因此人们常用安慰诱导物来进行各 种实验。 ▪ X-gal（5-溴-4-录-3-吲哚-β-半乳糖苷）也是一种人工化 学合成的半乳糖苷，可被β－半乳糖苷酶水解产生兰色化 合物，因此可以用作β －半乳糖苷酶活性的指示剂。 IPTG和X-gal都被广泛应用在分子生物学和基因工程的工 作中。
▪ 葡萄糖的降解物能抑制腺苷酸环化酶活性，并活化磷酸二脂酶，因而
降低 cAMP的浓度。
▪ 所以葡萄糖存在时，cAMP浓度低；仅在葡萄糖消耗完毕时, cAMP浓 度增高，CAP-cAMP 复合物形成（结合于lac operon CAP结合位点)， 才会促进转录。
乳糖操纵子与负控诱导系统
François Jacob
Jacques Monod
大肠杆菌乳糖操纵子包括4类基因：
①结构基因 ：lacZ、lacY、lacA。 LacZ合成β—半乳糖 苷酶，lacY合成β—半乳糖苷透过酶，lacA合成β—半乳糖 苷乙酰基转移酶。
②启动基因: (即启动子P)位于操纵基因的附近，它的作 用是发出信号，mRNA合成开始，该基因也不能转录成 mRNA。
3.阻遏物 lacI 基因产物及功能
Lac操纵子阻遏物m RNA是由弱启动子控制下组成型合成的 该阻遏蛋白有4个相同的亚基，每个亚基均含有347个氨基酸残基， 并能与1IPTG分子 未经分离分级的细胞提取物对结合能力大约为每个细胞集合20-40 个IPTG，因此推测每个细胞中有5-10个阻遏分子。
4.葡萄糖对lac操纵子的影响
乳糖操纵子与负控诱导系统
6.2.1 酶的诱导——lac体系受调控的证据 6.2.2 操纵子模型及其影响因子 6.2.3 lac操纵子DNA的调控区域——P、O区 6.2.4 lac操纵子中的其他问题
乳糖操纵子学说是关于原核生物基因结构及其表达调控 学说。由法国巴斯德研究所著名的科学家Jacob和 Monod在实验的基础上于1961年 首先提出的。
6.2.1 酶的诱导——lac体系受调控的证据
由于培养基中的乳糖会被诱导合成的β-半乳糖苷酶催化降 解，所以实际实验中研究诱导作用时很少使用乳糖。
实验室里常使用的乳糖类似物如下图
他们都是高效诱导物，他们都不是半乳糖苷酶的底物，所以称他们为安 慰性诱导（gratuitous inducer）
6.2.2 操纵子模型及其影响因子
在大肠杆菌中，cAMP的浓度受到葡萄糖代谢的调节。
1，如果细菌在缺碳源的培养基中，细胞内 cAMP浓度就高
乳糖操纵子的正负调控机制
1.乳糖操纵子地正负调控机制⑴乳糖操纵子（）是由调节基因（）、启动子（）、操纵基因（）和结构基因（、、）组成地. 编码阻遏蛋白，、、分别编码β半乳糖苷酶，β半乳糖苷透性酶和β半乳糖苷转乙酰基酶.⑵阻遏蛋白地负性调控：当培养基中没有乳糖时，阻遏蛋白结合到操纵子中地操纵基因上，阻止了结构基因地表达；当培养基中有乳糖时，乳糖（真正是异乳糖）分子和阻遏蛋白结合，引起阻遏蛋白构象改变，不能结合到操纵基因上，使聚合酶能正常催化转录操纵子上地结构基因，即操纵子被诱导表达.⑶是一个重要地正调节物质，可以与操纵上地启动子区结合，启动基因转录.培养基中葡萄糖含量下降，合成增加，与形成复合物并与启动子结合，促进乳糖操纵子地表达.⑷协调调节：乳糖操纵子调节基因编码地阻遏蛋白地负调控与地正调控两种机制，互相协调，互相制约.2.详述大肠杆菌色氨酸操纵子地调控机理.答：大肠杆菌色氨酸操纵子地转录受阻遏和衰减两种机制地控制，前者通过阻遏蛋白和操纵基因地作用控制转录地起始，后者通过前导序列形成特殊地空间结构控制转录起始后是否进行下去.⑴色氨酸操纵子地可阻遏系统：在阻遏系统中，起负调控地调节基因地产物是一个无活性地阻遏蛋白，色氨酸是辅阻遏物；当色氨酸不足时，阻遏蛋白无活性，不能和操纵基因结合，色氨酸操纵子能够转录；当色氨酸充足时，阻遏蛋白和它结合而被激活，从而结合到操纵基因上，而色氨酸操纵子地操纵基因位于启动基因内，因此，活性阻遏物地结合排斥了聚合酶地结合，从而抑制了结构基因地表达.⑵色氨酸操纵子地衰减调控在色氨酸操纵子地操纵基因和第一个结构基因之间有一段前导序列，在前导序列上游部分有一个核糖体结合位点，后面是以起始密码开头地个氨基酸地编码区，编码区有两个紧密相连地色氨酸密码子，后面是一个终止密码子，在开放阅读框下游有一个不依赖ρ因子地终止子，是一段富含地回文序列，可以形成发夹结构，因此可以在此处终止转录.另外前导序列包含个能进行碱基互补配对地片断区、区、区和区.它们能以、和、或、地方式进行配对，从而使前导序列形成二级结构地变化.在细菌中，翻译与转录偶连，一旦聚合酶转录出中地前导肽编码区，核糖体便立即结合上去翻译这一序列.当细胞中缺乏色氨酸时，地浓度很低，核糖体翻译前导肽至两个连续地色氨酸密码子处就陷入停顿，这时核糖体只占据区，由聚合酶转录地区和区便可配对，区游离在外，这样就不能形成终止子结构，聚合酶就可以一直转录下去，最后完成全部结构基因地转录，得到完整地分子.当细胞中存在色氨酸时，就有一定浓度地，核糖体便能顺利通过两个连续地色氨酸密码子而翻译出整个前导肽，直到前导肽序列后面地终止密码子处停止.此时，核糖体占据了区和区，结果区和区配对，形成转录终止子结构，使聚合酶终止转录.实现衰减调控地关键在于时间和空间上地巧妙安排.在空间上，两个色氨酸密码子地位置很重要，不可随意更改；在时间上，核糖体停顿于两个色氨酸密码子上时，序列应当还未转录出来.3.基因组文库与文库地区别：①材料不同.基因组文库以为材料，而文库以为材料.②基因结构不同.基因组文库中包含了所有地基因，而文库只包含需要表达地基因.对真核细胞来说，基因组文库中所含地是带有内含子和外显子地基因组基因，而文库中则是已剪接去除了内含子地.③文库内容不同.文库所包含地遗传信息远少于基因组文库，并且受细胞来源或发育时期地影响.④载体不同.构建基因组文库常用λ噬菌体和柯斯质粒等高容量克隆载体，而构建文库地载体选择要根据该文库地用途来确定.⑤使用范围不同.基因组文库常用于分离特定地基因片段、分析特定地基因结构以及研究基因表达调控等，而文库可用于某些病毒等地基因组结构研究及有关基因地克隆分离.。
乳糖操纵子简介
乳糖操纵子简介操纵子（operon)：很多功能相关的结构基因串联排列在染色体上，由一个共同的控制区来操纵这些基因的表达，包含这些结构基因和控制区的整个核苷酸序列就称为操纵子。
乳糖操纵子三个特异性序列：操纵序列O (operator): 阻遏蛋白结合位点。
启动子P (promoter): 位于结构基因的上游。
CAP结合位点：环cAMP受体蛋白(分解代谢物激活蛋白)结合位点。
一个调节基因●lac I：编码阻遏蛋白，能结合于操纵序列位点。
操纵子的组成：----结构基因(structural gene, SG) ：操纵元中被调控的编码蛋白质的基因----启动子(promoter，P)：是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。
----操纵基因(operator，O)：是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列。
阻遏物基因(inhibitor,I),产生阻遏物(repressor)。
结构基因Z编码β-半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。
Y编码β-半乳糖苷透过酶：使外界的β-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。
A编码β-半乳糖苷乙酰基转移酶：乙酰辅酶A上的乙酰基转到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。
当一个mRNA含有编码一个以上蛋白质的编码信息，而且这些蛋白质都是以独立的多肽被翻译时，这样的mRNA称之多顺反子mRNA。
多顺反子mRNA在细菌中是很普遍的。
多顺反子lac mRNA中的lacZ，lacY，lacA经翻译生成的产物分别生成代谢分解乳糖的三种酶始终存在着一定的比例关系( Z : Y : A = 5 : 2 : 1 )lacZ、Y、A基因的转录是由lacI基因指令合成的阻遏蛋白R所控制。
lacI一般和结构基因相毗连，但它本身具有自己的启动子和终止子，成为独立的转录单位。
由于lacI的产物是可溶性蛋白，按照理说是无需位于结构基因的附近。
它是能够分散到各处或结合到分散的DNA位点上。
典型乳糖操纵子的诱导原理
根据生物对内外环境刺激的反应，将基 因表达的方式分为：
组成型表达 诱导和阻遏表达
组成型表达 （constitutive gene expression）
在个体发育的任一阶段都能在 大多数细胞中持续进行的基因表达， 无论表达的水平高或低，它受环境因 素的影响较少、或变化很小。 且基
因表达产物通常是对生命过程必需的、 必不可少的，这类基因通常被称为持 家基因（housekeeping gene）。
诱导和阻遏表达
➢ 诱导（induction）：在特定的环境信号刺激下，相应基因被激活，从 而使基因的表达产物增加。这类基因称为可诱导基因。
➢ 可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导 (induction)。
乳糖 → 利用乳糖的三种酶表达
➢ 阻遏（repression）：在特定环境信号刺激下，相应基因被抑制，从而使基 因的表达产物减少。这类基因称为可阻遏基因。
乳糖操纵子的CAP正调控
（Positive Control of CAP）
当CAP与CAP结合位点这段序列结合时，可 激活RNA转录酶活性，使之提高50X
葡萄糖→ → → → →降解产物
ATP → →cAMP → →5’AMP
CRP（非活性状态） → →CAP（活性状态）
DNA
乳糖操纵子的CAP正调控
▪ 由于Plac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发 生去阻遏使lac操纵元转录开放，还不能使细 菌很好利用乳糖，必需同时有CAP来加强转 录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。
乳糖操纵子的诱导原理
间构象的变化,形成cAMP-CAP复合物（有活性）
乳糖操纵子的CAP正调控
（Positive Control of CAP）
当CAP与CAP结合位点这段序列结合时， 可激活RNA转录酶活性，使之提高50X
葡萄糖→ → → → →降解产物
ATP → →cAMP → →5’AMP
乳糖操纵子的结构和功能
操纵子模型的提出
1960-1961年，莫洛(Monod)和雅各布(Jacob)首次提出“操纵子” 学说。
获1965年诺贝尔生理学和医学奖 1940年， Monod发现：细菌在含葡萄糖和乳糖的培养基上生 长时，细菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源转 变期，细菌的生长会出现停顿。即产生“二次生长曲线”。
➢ 可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏 (repression）。
协调表达
(coordinate expression)
在一定机制控制下，功能上相关的一组 基因，无论其为何种表达方式，均需协调 一致、共同表达，使各表达产物的分子比 例适当，从而正常发挥功能。这种现象称 为协调表达 (coordinate expression)，这 种调节称为协调调节 (coordinate regulation)。
constitutive
Yeah…!
Repressor
CAP
Binding
PRroNmAoter
Operator
LacZ
CAP Pol.
cAMP
Repressor mRNA
X Repressor
Repressor
Repressor
This lactose has bent me
分子生物学-13-原核基因表达调控-2-lac and trp
腺甘酸环化酶
ATP
cAMP（环腺甘酸）
大肠杆菌中：无葡萄糖，cAMP浓度高； 有葡萄糖，cAMP浓度低
CAP的正调控
DNA
+ + + + 转录
cAMP
CAP P O Z Y A
CAP CAP CRP CRP 无葡萄糖，cAMP浓度高时 促进转录
CAP
有葡萄糖，cAMP浓度低时
够合成，最终取决于细胞中有没有葡萄糖。
-70 没有葡萄糖时，腺苷酸环化酶将ATP转变
成cAMP， cAMP 与CAP形成复合物，与
+21
启动子上的CAP位点结合，启动子上的进
入位点-35序列才能与RNA聚合酶结合；
-80
相反有葡萄糖时，腺苷酸环化酶不能将 ATP转变成cAMP， I、II位点就是空的，
这种现象以每个细胞周期1-2次的概率发生
第二个问题
• 另外一点需要说明的是，乳糖并不能直 接与阻遏蛋白结合，而是乳糖首先转变 为别乳糖，别乳糖与阻遏蛋白结合。
• 当乳糖被消耗完了以后，阻遏蛋白就可 以重新结合于操作子，lac操纵元的结构 基因又回到了关闭状态。
第三个问题
• 关于阻遏物LacI
• 阻遏物LacI基因本身是一种由弱启动子 控制的组成型表达，细胞中总是存在一 定量的阻遏蛋白
cAMP是一种全局性的调节信号
• CRP（cyclic AMP receptor protein） 是一种全局性的调节子，可以激活乳糖 操纵子、半乳糖操纵子和麦芽糖操纵子 的表达。当CRP与cAMP结合后， cAMP-CRP形成二聚体，结合至启动子 的上游识别位点，协作RNA聚合酶与启 动子结合
典型乳糖操纵子的诱导原理
典型乳糖操纵子的诱导原理乳糖操纵子是一种在分子生物学和遗传工程领域广泛应用的工具。
它是由乳糖操作子（lac operator）和乳糖调节因子（lac repressor）组成的。
乳糖操作子是原核生物中的一段DNA序列，它位于乳糖操纵子基因（lac operon）的上游。
乳糖操作子可以结合乳糖调节因子，从而调控乳糖操纵子基因的转录。
乳糖调节因子是一种DNA结合蛋白，它分为两个亚单位。
乳糖调节因子通过与乳糖操作子的结合，可以起到两种不同的作用。
首先，当乳糖调节因子与乳糖操作子结合时，它会阻止RNA聚合酶结合到乳糖操纵子基因的启动子区域。
这意味着乳糖操纵子基因的转录被抑制，表达水平较低。
其次，当乳糖存在于细胞内时，它可以与乳糖调节因子结合并改变其构象。
这种构象改变会导致乳糖调节因子与乳糖操作子的结合断裂，从而释放乳糖操纵子基因的启动子区域。
这使得RNA聚合酶能够结合到启动子区域上进行转录，从而使乳糖操纵子基因得以高效转录，表达水平增加。
总结起来，乳糖操纵子的诱导原理可以归纳为两个方面。
一方面，乳糖调节因子与乳糖操作子的结合可以抑制乳糖操纵子基因的转录，从而控制其表达水平。
另一方面，乳糖存在时，它与乳糖调节因子结合并改变其构象，使乳糖调节因子与乳糖操作子的结合断裂，从而释放启动子区域，促进乳糖操纵子基因的转录。
乳糖操纵子的诱导原理在实验室中被广泛应用于表达外源基因。
通过将目标基因与乳糖操纵子基因合并，将其导入细菌或其他原核生物中，可以实现对外源基因的可控表达。
当乳糖存在时，外源基因能够高效转录，并表达出目标蛋白。
而当乳糖缺失时，乳糖调节因子与乳糖操作子的结合会导致转录抑制，从而停止对外源基因的表达。
乳糖操纵子的诱导原理不仅在实验室中被广泛应用，也在工业生产中发挥重要作用。
例如，在生物制药中，乳糖操纵子可被用来调控特定基因的表达水平，从而生产大量的目标蛋白。
此外，乳糖操纵子也可以用于研究基因调控网络和药物研发等领域。
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lac I P
O
lac Z
lac Y
lac A
lac I repressor
the repressor tetramer binds to the operator and prevents RNA polymerase from binding to the promoter
lac I P
lac Z
六.lac操纵子中的其他问题 1.A基因及其生理功能 c基因产物数量上的比较
lac操纵子及各组分详图
组成 lac I
p o lac Z
lac Y
lac A
碱基数 1040 82 3510
780
825
功 能 阻遏物
β-半乳糖苷酶 β-半乳糖 苷透过酶
β-半乳糖苷乙酰 基转移酶
Regulation of the lactose operon - negative control
四. 乳糖操纵子结构基因表达的条件
1.CRP结合位点 : CRP与cAMP结合，使 RNA聚合酶识别-35和-10区；
2.启动子识别 :RNA聚合酶识别启动子序列； 3.操纵基因 :阻遏蛋白结合乳糖或类似物
五.结构基因转录的调控方式 1.负调控：阻遏蛋白对乳糖操纵子的负调控 2.正调控： cAMP-CRP是一个正调节因子
大肠杆菌乳糖操纵子结构
乳糖操纵子的调控机制
培
I
P
O
lacZ
养
基
中
mRNA
无
乳
糖 时
C
I
P
O
lacZ
培
RNAP
养
基 中
mRNA
有
乳
糖
C
时
乳糖
失活
lacY lacY
lacA
RNAP
lacA
三. 影响因子
1. lac 操纵子的本底水平表达 2.大肠杆菌对乳糖的反应 3. lac I基因产物及功能 4. 葡萄糖对lac操纵子的影响 5. cAMP与代谢物激活蛋白
lac Y
lac A
NO TRANSCRIPTION
RNA polymerase
RNA polymerase is blocked from the promoter
乳糖操纵子结构基因表达的条件2
（3）无cAMP，但有诱导物时
I
CRP位点 P
O
结构基因
mRNA
C 失活
乳糖
（4）有cAMP和诱导物时
乳糖操纵子及负控诱导系统
制 作：王 庆 容
一.结构 二.负控诱导模型 三. 影响因子 四.乳糖操纵子结构基因表达的条件 五. 结构基因转录的调控方式 六. lac操纵子中的其他问题 七.小结
调节基因 启动基因 操纵基因
I
P
O
lacZ
结构基因
lacY
lacA
P
O
lacZ
阻遏蛋白 结合部位
RNA聚合酶结合部位
I CRP位点 P
O
RNAP
mRNA
结构基因
C
失活
乳糖操纵子结构基因表达的条件1
（1）无cAMP和诱导物时
I CRP位点 P
O
mRNA
C P
O
mRNA
C
结构基因 结构基因