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土壤细菌的分离及纯化(1)
土壤细菌的分离及纯化(1)土壤中存在着丰富的微生物群落，其中细菌是占主导地位的一类微生物。
分离和纯化这些细菌有助于深入了解它们的特性并有利于相关应用的开发。
下文将从分离和纯化的流程、常用方法以及注意事项等方面进行详细阐述。
一、分离和纯化细菌的流程1. 采集土样首先，需要采集土样，并将其认真分层剖析，取相对均匀的土样。
避免受到环境中其他微生物的干扰，有时要在合适的温度、溶液中将其处理，以杀死其他未被分离出的细菌，确保最终分离到的细菌属于所期望的种类。
2. 筛选方法可以通过筛选的方式来分离目标细菌。
在将土样处理后，可以将土壤中的颗粒筛选出来，将其悬浮于适宜的培养基中。
通过培养基选择，可以筛选出自然界中对常规培养基营养要求不高的菌株。
3. 纯化法基于筛选法筛选出的细菌群，要进一步分离单菌株。
这时候，可以通过分泌落细菌的方式进行分离。
分泌落法是在无菌条件下，用匀染映到平板上，供菌落生长孵育，培养出纯净菌株。
二、常用分离和纯化方法1. 发酵罐法发酵罐法是在无菌环境下，将土壤样本与特定的培养基混合，形成发酵液，供细菌发酵并产生代谢产物。
根据代谢产物对目标微生物的要求特点，可以从代谢产物中充分筛选出目标菌株并进行单克隆的分离培养。
2. 过滤法将土样过滤后，混合在无固定菌相的培养基中，通过筛选培养环境中的单菌孵育，纯化出其中的某一菌株。
3. 土盘法所收集的土样经过处理后，均匀地坚着到培养皿的表面。
将培养皿置于恰当的条件下，等待细菌的生长，进行单克隆的分离。
三、注意事项1. 待分离土样尽量温和，避免对土壤环境造成较大影响，减少细菌数量的变化。
2. 培养到疑似有目标菌株生长为止，这就需要经验较丰富的实验人员进行分离纯化操作。
3. 需要从其他细菌中筛选出目标菌株，可以加入抗生素等各种筛选方法。
总之，提高细菌的分离和纯化技术，是深入探索土壤生物多样性、探索新型约束细菌等领域的很重要的手段。
溶液的分离与纯化的方法
溶液的分离与纯化的方法溶液的分离与纯化是化学实验中经常遇到的问题，它对于得到纯净的化合物或提取有用的物质具有重要意义。
在实验中，我们常常需要将目标物质从复杂的混合物中提取出来，或者通过分离技术将不同的成分分离开来。
本文将介绍常用的溶液分离与纯化方法。
一、挥发性物质的蒸馏分离法蒸馏是一种常用的分离和纯化方法，尤其适用于挥发性物质的分离。
蒸馏分为简单蒸馏和分馏蒸馏。
简单蒸馏适用于沸点差异大于30℃的物质的分离。
分馏蒸馏适用于沸点差异较小的物质分离。
对于高沸点的物质，可以使用真空蒸馏或气相色谱法。
二、晶体的结晶法晶体的结晶法适用于溶液中含有固体产物的情况。
通过控制溶液的温度和浓度，可以使溶质逐渐从溶液中结晶出来。
结晶的过程中，可以通过过滤和洗涤的方式，将结晶体与溶剂分离开来。
此外，还可以通过溶解度差异、溶剂振荡等方法，选择不同的结晶条件，获得纯度更高的晶体。
三、气溶胶的过滤法气溶胶是气体中悬浮微粒的一种形态，常见于大气、工业废气和烟雾等环境中。
气溶胶的过滤法主要是通过过滤膜、滤纸或滤芯等材料，将气体中的微粒捕获在过滤介质表面，实现气溶胶的分离。
四、离子交换法离子交换法是一种基于离子与固定相之间的相互作用的分离和纯化方法。
通过将溶液通入带有离子交换树脂的柱子，受固定相表面上活性位置的吸引，可以选择性地去除离子。
同时，在适当的条件下，可以通过改变溶液pH值或溶剂添加剂的浓度等方式，释放所需物质。
五、凝胶过滤法凝胶过滤法是一种常用的分离生物大分子的方法，如蛋白质、核酸等。
凝胶过滤方法利用凝胶颗粒中固定的孔径来选择性地分离不同尺寸的分子。
通过向凝胶中加入溶液，大分子将被阻塞在凝胶中，而小分子则能够通过凝胶孔洞而逃逸。
六、电泳法电泳法是一种基于物质在电场中的迁移速度差异来实现分离的方法。
著名的几种电泳方法包括凝胶电泳、毛细管电泳和等电聚焦等。
这些方法对于分离和纯化蛋白质、核酸等生物大分子具有广泛的应用。
总之，溶液的分离与纯化是化学实验中常见的任务。
实验3：细菌的分离与纯化
实验 3 微生物的纯种分离培养微生物广泛地分布在自然界的土样、水体、空气、动植物体表及人体、动物体的排泄物中。
它们以单个的菌体、无性孢子和芽孢的形式存在。
由于单一的自然界环境并不能完全满足微生物对水、空气、营养物质、温度、pH的综合要求，它们往往以散居”的状态出现，而不能形成人们肉眼可直接观察到菌落。
不同的自然环境中，微生物的种类和数量差异很大。
肥沃的土壤，富养化的水体，是许多微生物麇集、孳生的场所，在这里存活着能分解淀粉、蛋白质、脂肪、纤维素、木质素、果胶、农药、含磷有机物（卵磷脂、肌醇、核酸等）、石油以及溶解铜矿的细菌、放线菌、真菌等多种类的微生物，如何根据微生物的生理要求，按照人类的需求，将它们从自然界中分离出来，获得纯种，发挥微生物的特长为人类的生产和生活服务，是微生物研究中最基础的实验技术。
一、实验目的：1．学会将混杂的各种微生物分离成纯种，统计分析样品中微生物的种类和数量的方法。
2．学会从菌落及培养特征区分细菌、酵母菌、放线菌和霉菌。
3．学会好氧微生物平板及斜面培养的方法。
二、实验原理：在自然界中，微生物的种类很多，数量很大，为了获得单个菌体，首先必须把要分离的材料进行适当的释放，按其生长所需要的条件，使其在平板上，由一个菌体繁殖成单个菌落，这样，就能从中挑选出所需要的纯种，由于细菌、放线菌和霉菌所要求的营养条件不同，利用不同的培养基制成平板进行分离，然后从菌落形态上的差异，可以把细菌、放线菌和霉菌三大类群区分并可计算出其数量，分别接种到试管斜面上，然后，在平板上反复进行分离培养，最后可获得纯种。
三、实验材料和用具：1．材料（1）土壤样品（ 2 ）培养基：①牛肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏蛋白胨培养基（% ）牛肉膏0.3-0.5g 蛋白胨1.0g NaCl 0.5g 琼脂2.0g 蒸馏水100mL pH 7.2-7.4 ，0.1Mpa 压力，灭菌20-30分钟。
配制液体培养基时不加琼脂；半固体培养基加0.3-0.5%琼脂。
植物多糖的分离纯化
植物多糖的分离纯化一、植物多糖的提取1 溶剂提取法1．1 水提法水对植物组织的穿透力强，提取效率高，在生产上使用安全、经济。
用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提。
一般植物多糖提取采用热水浸提法，该法所得多糖提取液可直接或离心除去小溶物；或者利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，沉淀提纯多糖；但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离；还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离；其中，以乙醇沉淀最为普遍。
但以根茎为主的植物体,细胞壁多糖含量高,热水直接提取率不高。
此时为破坏细胞壁,增加多糖的溶出，有两种处理方法:一为酶解,二为弱碱溶解。
1．2酸碱提法有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。
但酸提法只在一些特定的植物多糖提取中占有优势，目前报道的并不多。
而且即使有优势，在操作上还应严格控制酸度，因为酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂。
有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。
采用的稀碱多位为0．1mol／L氢氧化钠、氢氧化钾，为防止多糖降解，常通以氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾。
同样，碱提优势也是因多糖类的不同而异。
与酸提类似，碱提中碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。
另外，稀酸、稀碱提取液应迅速中和或迅速透析，浓缩与醇析而获得多糖沉淀。
1．4 生物酶提取法酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，在多糖的提取过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提取。
此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等的产物，常用的酶有蛋白酶，纤维素酶，果胶酶等。
1．5 超声提取法超声波是一种高频率的机械波，其主要原理是利用超声波产生的“空化作用”对细胞膜的破坏，有利用植物有效成分的释放，而且超声波能形成强大的冲击波或高速射流，有效地减小、消除与水相之间的阻滞层，加大了传质效率，有助于溶质的扩散。
菌种的分离与纯化
接种、分离纯化和培养技术一、接种将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。
１、接种工具和方法在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。
由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。
有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。
在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。
（图３－３）图３－３接种和分离工具1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀常用的接种方法有以下几种：１）划线接种这是最常用的接种方法。
即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。
常用的接种工具有接种环，接种针等。
在斜面接种和平板划线中就常用此法。
２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。
此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。
除三点外，也有一点或多点进行接种的。
３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。
做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。
用的培养基一般是半固体培养基。
它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。
４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。
待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。
５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。
６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。
７）注射接种该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。
分离纯化及测定实验报告
一、实验目的1. 掌握分离纯化实验的基本原理和方法。
2. 学会使用分光光度计进行物质浓度的测定。
3. 熟悉实验操作步骤，提高实验技能。
二、实验原理1. 分离纯化：利用物质在不同溶剂中的溶解度差异，通过萃取、结晶、蒸馏等方法，将混合物中的目标物质分离出来。
2. 测定物质浓度：利用分光光度计，通过测量物质在一定波长下的吸光度，根据比尔定律计算出物质的浓度。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：某混合物、溶剂、萃取剂、结晶剂等。
2. 实验仪器：分光光度计、离心机、烧杯、试管、滴定管、移液管、锥形瓶、滤纸等。
四、实验步骤1. 分离纯化（1）称取一定量的混合物，加入适量的溶剂，搅拌均匀。
（2）加入萃取剂，搅拌萃取，静置分层。
（3）取下层萃取液，加入结晶剂，搅拌结晶。
（4）离心分离，取沉淀物。
2. 测定物质浓度（1）取一定量的沉淀物，加入适量的溶剂，搅拌均匀。
（2）用移液管取一定量的溶液，放入比色皿中。
（3）打开分光光度计，设定合适的波长。
（4）调整吸光度，记录数据。
五、实验结果与分析1. 分离纯化通过实验，成功分离出目标物质，其纯度达到90%以上。
2. 测定物质浓度根据比尔定律，计算得到目标物质的浓度为0.15mg/mL。
六、实验讨论1. 在分离纯化过程中，萃取剂的选择对实验结果有较大影响。
选择合适的萃取剂可以提高分离效果。
2. 在测定物质浓度时，要注意比色皿的清洁，避免吸光度误差。
3. 实验过程中，应注意安全操作，防止发生意外。
七、实验总结本次实验成功完成了分离纯化及测定物质浓度的任务。
通过实验，掌握了分离纯化实验的基本原理和方法，学会了使用分光光度计进行物质浓度的测定。
在实验过程中，积累了实践经验，提高了实验技能。
化学有机合成分离纯化
化学有机合成分离纯化化学有机合成是一项重要的技术手段，它可以将原料经过一系列的反应转化为目标化合物。
然而，在合成过程中，不可避免地会产生一些副反应产物、杂质或溶剂残留物，这些物质会降低目标化合物的纯度和产率。
为了得到高纯度的产物，分离纯化的步骤是必要的。
一、分离纯化的原则分离纯化的目的是将目标化合物与其他杂质物质分离开来，并最终得到高纯度的目标产物。
在进行分离纯化之前，需要根据目标化合物与其他杂质的性质差异，选择适当的分离纯化方法。
1. 溶剂萃取法溶剂萃取法是一种常用的分离纯化方法。
它基于不同物质在不同溶剂中的溶解度差异，通过溶剂的选择和萃取过程来实现目标化合物的分离纯化。
溶剂的选择要考虑目标化合物和其他杂质在不同溶剂中的溶解度，以及溶剂的毒性和成本等因素。
2. 蒸馏法蒸馏法是一种基于物质沸点差异的分离纯化方法。
根据物质的沸点差异，通过加热使液体沸腾，然后冷凝收集蒸馏出来的纯净目标化合物。
这种方法适用于沸点差异较大的物质。
3. 结晶法结晶法是一种将溶液中的目标化合物结晶出来的分离纯化方法。
通过控制溶液的温度和浓度，使目标化合物从溶液中析出形成结晶体。
通过过滤和洗涤等步骤，可以得到纯净的目标化合物。
4. 色谱法色谱法是一种基于物质在固定相和流动相之间相互作用差异的分离纯化方法。
根据物质在固定相上的吸附性质和流动相中的迁移性质，通过在色谱柱中进行分离纯化。
常用的色谱方法包括薄层色谱、柱色谱和高效液相色谱等。
二、实验操作在进行化学有机合成分离纯化实验时，需要注意以下操作事项：1. 实验室安全化学有机合成涉及到许多有毒或有害的化学物质，实验室安全是首要考虑的因素。
操作人员应穿戴好实验室衣物，佩戴防护眼镜和手套，并遵守实验室安全操作规程。
2. 反应监控在进行化学有机合成分离纯化的实验过程中，需要定期监测反应进程。
可以使用合适的分析仪器检测反应物转化率和产物纯度，确保反应达到预期目的。
3. 分离纯化方法选择根据目标化合物与其他杂质的性质差异，选择合适的分离纯化方法。
生物制药中的分离纯化技术
生物制药中的分离纯化技术生物制药是一种通过生物学过程生产的药物，利用微生物、植物和动物等生物系统生产出的生物制剂，在临床治疗中具有极高的价值。
但是，由于不同来源的生物制剂中含有大量的复杂成分，如蛋白质、核酸、多糖等，在生产的过程中需要通过分离纯化技术来提取所需的成分，从而达到纯化和提纯的目的。
一、生物制药的分离纯化技术概述生物制药的分离纯化技术是指通过化学、物理等方法对发酵产生的混合物进行处理，将所需的成分分离和纯化。
分离纯化技术主要包括：1. 溶液层析技术溶液层析是一种通过分子结构、大小、电荷等特性，通过静态或动态的方式，利用吸附剂将混合物中的不同化合物分离开的技术。
溶液层析广泛应用于蛋白质、核酸等大分子生物制品的分离和纯化中。
2. 凝胶过滤技术凝胶过滤是一种利用孔径大小分离分子的技术。
通过将混合物在凝胶柱中进行过滤，大分子会被阻挡在凝胶柱表面，而小分子则可以通过凝胶柱被洗脱。
凝胶过滤主要应用于分离纯化大分子的蛋白质、多肽和核酸等。
3. 离子交换层析技术离子交换层析是一种利用有机或无机离子交换体作为固定相，通过可控制的盐度梯度和pH值来分离混合物的不同成分的技术。
离子交换层析广泛应用于蛋白质、核酸等带电性物质的分离和纯化中。
4. 亲合层析技术亲合层析是一种通过将特定物质负载在固定相上，与混合物中的目标分子发生特异性结合，分离纯化目标分子的技术。
亲合层析一般应用于蛋白质、核酸等生物大分子结构的分离和纯化中。
以上四种分离纯化技术，在生物制药的分离纯化过程中经常使用。
不同的技术适用于不同的生物制品，生产过程会考虑到最终产品的纯度、产量以及经济成本等方面。
二、现代生物制药分离纯化技术的进展当前，随着现代生物技术的发展，生物制药的分离纯化技术也得到了不断的进步和完善。
新的技术和方法不断涌现，不仅可以提高生产效率，而且还可以提高产品的纯度和质量，降低产品的成本。
以下是一些新技术的介绍。
1. 前体蛋白纳米管系统前体蛋白纳米管系统是利用基因工程技术，将生物分子直接吸附在纳米管表面，从而实现分离的目的。
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mRNA的分离纯化【实验原理】真核生物的mRNA分子是单顺反子，是编码蛋白质的基因转录产物。
真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物，因此，高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。
哺乳动物平均每个细胞含有约1x10-5g RNA，理论上认为每克细胞可分离出5～10mg RNA。
其中rRNA为75％～85％，tRNA占10％～16％，而mRNA仅占1%～5％，并且mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，表达丰度也不一样。
真核生物mRNA有特征性的结构，即具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的poly(A)尾巴——绝大多数哺乳动物细胞的3’端存在20~300个腺苷酸组成的poly（A）尾，通常用poly（A+）表示，这种结构为真核mRNA分子的提取、纯化，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。
一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA 3’末端含有多poly(A)尾巴结构特性设计的。
当总RNA流经寡聚（dT）（即oligo(dT)）纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT)纤维素柱，即可得到较纯的mRNA。
目前常用的mRNA的纯化方法有：（1）寡聚（dT）－纤维素柱层析法，即分离mRNA的标准方法；（2）寡聚（dT）－纤维素液相离心法，即用寡聚（dT）－纤维素直接加入到总的RNA溶液中并使mRNA与寡聚（dT）－纤维素结合，离心收集寡聚（dT）－纤维素／mRNA 复合物，再用洗脱液分离mRNA，然后离心除去寡聚（dT）－纤维素；（3）其它一些方法：如寡聚（dT）－磁性球珠法等。
本实验应用方法（1）进行mRNA的分离纯化。
【试剂与器材】（一）试剂1．0.1mol/L NaOH ，每组200mL2．寡聚Oligo（dT）-纤维素3．加样/洗涤缓冲液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组250mL 或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。
4．洗涤缓冲液2：0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。
配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SDS至终浓度。
5．5 mol/L NaCl，每组10mL6．3 mol/L NaAc pH5.2，每组10mL7．无RNase双蒸水(DEPC水)，每组100mL8．70%乙醇，每组10mL注意：溶液5，6的配制都应该加0.1% DEPC处理过夜，溶液1，3，4，8则用经0.1% DEPC 处理过的无RNase双蒸水配制，Tris应选用无RNase的级别。
溶液配制后，最好能够按一次实验所需的分量分装成多瓶（如10ml或50ml/瓶）保存，每次实验只用一份，避免多次操作造成对溶液的污染。
（二）器材1．恒温水浴箱2．冷冻高速离心机3．紫外分光光度计4．巴斯德吸管5．玻璃棉6．5ml一次性注射器【操作方法】（一）oligo(dT)纤维素的预处理1．用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。
2．将悬浮液装入填有经DEPC水处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0mL，用3倍柱床体积的无RNase的灭菌双蒸水冲洗oligo(dT)纤维素。
3．用3-5倍柱床洗涤缓冲液I冲洗oligo(dT)纤维素，直到流出液的pH值小于8.0。
4．将处理好的oligo(dT)纤维素从巴斯德吸管倒出，用适当的柱床洗涤缓冲液I悬浮，浓度约为0.1g/mL，保存在4℃待用。
（二）总RNA浓度的调整1．把实验一所提的总RNA转到适合的离心管中，如果总RNA的浓度大于0.55mg/mL，则用无RNase的双蒸水稀释至0.55mg/mL，总RNA的浓度对除去rRNA是很重要的。
把RNA溶液置于65℃水浴加热5 分钟，然后迅速插在冰上冷却。
2．加入1/10体积5 mol/L NaCl使RNA溶液中盐的浓度调至0.5 mol/L。
（三）mRNA的分离1．mRNA与Oligo(dT)-纤维素结合：用移液器重新悬浮oligo(dT)-纤维素，按下表取适量的oligo(dT)-纤维素到RNA样品中，盖上盖子，颠倒数次将oligo(dT)-纤维素与RNA 混匀。
于37℃水浴保温并温和摇荡15分钟。
2．转移：取1个5ml的一次性注射器，取适量经过高温灭菌的玻璃棉塞紧前端，并把它固定在无RNase的支架上，再把oligo(dT)-纤维素/RNA悬浮液转移到注射器，推进塞子直至底部，把含有未结合上的RNA液体排到无RNase的离心管中（保留至确定获得足够的mRNA）。
3．洗涤：根据上表直接用注射器慢慢吸取适量的洗涤缓冲液1，温和振荡，充分重新悬浮mRNA-oligo(dT)-纤维素，推进塞子，用无RNase的离心管收集洗出液。
测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时准备洗脱。
4．洗脱：根据上表直接用注射器慢慢吸取适量（2-3倍柱床体积）的洗脱缓冲液2或无RNase双蒸水到注射器内充分重悬mRNA-oligo(dT)-纤维素，推进塞子以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。
5．测定每一管的OD260，合并含有RNA的洗脱液组分于4℃，2500g，离心2-3分钟，上清转移至新的离心管中，去掉残余的oligo(dT)-纤维素。
6．沉淀：洗脱液中加入1/10体积的3mol/L NaAc （pH5.2）, 再加入2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀后，-20℃30分钟或放置过夜。
7．离心收集：12000g, 4℃离心15分钟，小心弃去上清，mRNA沉淀此时往往看不见，用70%乙醇漂洗沉淀，12000g, 4℃离心5 分钟，小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。
将mRNA沉淀溶于适当体积的无RNase的双蒸水，立即用于cDNA 合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。
8．定量：测定OD260和OD280，计算产率以及OD260/OD280的比率（同上一实验）。
【注意事项与提示】1．整个操作过程必须严格遵守无RNase操作环境规则。
2．提取的总RNA必须完整，不能被降解，这是mRNA质量的先决条件。
3．总RNA与Oligo(dT)-纤维素的比例要适当，过量的总RNA，容易造成mRNA不纯。
4．RNA溶液与Oligo(dT)-纤维素结合前必须置于65℃加热5 分钟，这一步很重要，其作用（1）破坏mRNA的二级结构，特别是poly(A+)尾处的二级结构，使poly(A+)尾充分暴露，提高poly(A+)RNA回收率；（2）解离mRNA与rRNA的结合。
加热后应立即插入冰上，以免由于温度的缓慢下降使mRNA又恢复其二级结构。
5．应注意mRNA不能被DNA污染，即使是1 ppm DNA污染，也可严重影响实验结果。
6．mRNA制备后，可用变性琼脂糖凝胶电泳捡测其完整性和有无DNA污染。
提取的mRNA应该在0.5~8.0kb之间呈现弥散状，无明显区带，但大部分的mRNA应在1-2.0kb 范围内（如下图）。
一般来说，经过一次纯化分离的mRNA还会有微量的rRNA残留，但一般来说不会对后续实验造成很大的影响，如果样品充足，可将经过一次纯化分离的mRNA 再纯化一次，进一步提高其纯度。
图3.1 mRNA变性琼脂糖凝胶电泳示意图Lane 1, 0.24–7.5kb RNA分子量Maker;Lane 2, 老鼠肝脏总RNA;Lane 3, 老鼠肝脏mRNA7．为防止mRNA降解，应避免多次冻融，可将mRNA少量分装后保存。
另外，如果有低温冰箱,最好在-70℃～-80℃保存。
也可将mRNA在70%乙醇中-70℃保存一年以上。
8．寡聚(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。
每次用前需用NaOH、灭菌ddH2O、层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。
9．一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，约相当于上柱总RNA 量的1%-2%。
【实验安排】1．第一天：试剂的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase处理（0.1%DEPC 浸泡或高温干烤）。
2．第二天：进行（一）、（二）和（三）1-6。
3．第三天：进行（三）7和变性琼脂糖凝胶电泳捡测mRNA。
4．为了避免由于保存时间过长造成的RNA降解，最好能将总RNA提取、mRNA的分离纯化、RT-PCR和cDNA文库构建实验安排在连续的时间内进行。
其他：引物的设计一般遵循的原则：1）典型的引物20-24个核苷长。
引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
但是太长的引物可能会与错误配对序列杂交降低了特异性，同时因为比短序列杂交慢，从而降低了产量。
2）设计5'端和中间区为G或C，且GC含量为50％~60％的引物，以增加引物的稳定性及其与目的序列杂交的稳定性。
3）3'末端尽量不要富含GC。
设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。
但因为3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸，为了避免3'末端的错误配对，所以末端尽量避免为核苷A。
4）在引物对3'末端尽量避免互补序列以免形成引物二聚体，抑制扩增。
如果引物序列可能产生内部二级结构会破坏引物退火稳定性，也要尽量避免。
此外，目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。
有时候，仅有有限的序列信息可供用于引物设计。
比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计简并引物，同时使用较高的引物浓度（1μM到3μM），因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。
为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。
次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。
不要在引物的3'端使用简并碱基，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。