实验一尿蛋白的测定(双缩脲法)
【生物化学实验】双缩脲法测定血清蛋白质含量
实验开始！
3.0
标准管 2×2 3×2 4×2
0.4
0.6
0.8
—
—
—
0.6
0.4
0.2
3.0
3.0
3.0
5×2 1.0
— — 3.0
测定管 ×2
—
0.1 1.9 3.0
✓ 混匀各管，室温放置30分钟。以空白管调零，在波 长540 nm比色，读取各管光吸收值，并记录。
在座标纸上以各管蛋白质含量为横座标， 两管平均光吸收值为纵座标，绘制标准曲 线。
➢ 常用方法：
1. 比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线 不同，表明物质的化学结构不同。
2. 比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同； 化学结构相似的物质最大吸收波长相同，吸收系数不 同。
3. 比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（DNA A260/A280=1.8 纯度鉴定)
利用吸收光谱对物质进行定量分析
物理性质：紫外分光光度法。
化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法
染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。
实验目的 掌握双缩脲法测定蛋白质的原理 掌握分光光度计的使用 掌握标准曲线的制作 学习分光光度法测定的原理和方法
实验原理
双缩脲反应（Biuret reaction）
两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2NOC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接 的酰胺键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲 反应，生成紫红色络合物。
➢ 原理： Lambert-Beer定律
➢ 常用方法：
1. 标准曲线法
2. 配制一系列已知不同浓度的标准溶液，用选定的显 色剂显色。选用合适波长的入射光。测定时先以空白 溶液调节透光率100%，然后分别测定标准系列的吸光 度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图得到一条 通过原点的直线，叫做标准曲线（或称A-C曲线）。
双缩脲法测定实验报告
一、实验目的1. 学习双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。
2. 掌握双缩脲试剂的配制和使用。
3. 了解实验过程中可能出现的误差及解决办法。
二、实验原理双缩脲法是一种经典的蛋白质定量方法，其原理基于蛋白质分子中的肽键与铜离子（Cu2+）在碱性条件下发生反应，生成紫红色络合物。
该络合物在特定波长（如540nm）处的吸光度与蛋白质含量呈正比关系。
通过测量吸光度，可以计算出蛋白质的浓度。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质标准液（已知浓度）- 待测样品（含有未知蛋白质）- 双缩脲试剂A（含CuSO4）- 双缩脲试剂B（含NaOH）- 6mol/L NaOH溶液- 0.1mol/L HCl溶液- 10g/L NaCl溶液- 移液器- 容量瓶- 烧杯- 比色皿- 分光光度计2. 实验仪器：- 移液器- 容量瓶- 烧杯- 比色皿- 分光光度计四、实验步骤1. 配制双缩脲试剂：- 称取0.1g硫酸酮（CuSO4）溶于50mL去离子水中。
- 称取1.5g酒石酸钾钠溶于50mL去离子水中。
- 称取0.05g碘化钾溶于50mL去离子水中。
- 将三种溶液混合，搅拌均匀，备用。
2. 准备蛋白质标准液：- 将蛋白质标准液用去离子水稀释至一定浓度，备用。
3. 准备待测样品：- 称取一定量的待测样品，用去离子水稀释至一定浓度，备用。
4. 标准曲线的制作：- 取7支试管，分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL蛋白质标准液，然后依次加入1.5mL双缩脲试剂A和1.5mL双缩脲试剂B。
- 将试管放入水浴中加热10分钟，取出冷却至室温。
- 用移液器取0.5mL溶液于比色皿中，以空白试剂为参比，在540nm波长处测定吸光度。
- 以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
5. 待测样品的测定：- 按照标准曲线的制作步骤，对待测样品进行测定。
- 根据标准曲线，计算出待测样品中蛋白质的含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线的制作：- 在540nm波长处，蛋白质含量与吸光度呈良好的线性关系，相关系数R²=0.998。
实验46.双缩脲法定量测定蛋白质
实验46.双缩脲法定量测定蛋白质一、实验目的1、学会使用移液管，掌握双缩脲法测定尿蛋白的原理和操作方法。
2、掌握分光光度计的使用，初步了解比色法的基本原理。
二、实验原理蛋白质是含氮的有机高分子化合物，分子中含有多个与双缩脲分子相似的结构（肽键），碱性硫酸铜溶液中，蛋白质与硫酸铜的Cu2+离子等络合生成紫红色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用比色法测定。
经比色法求出尿中蛋白质的含量。
反应如下：三、实验试剂与材料仪器试剂1.标准酪蛋白溶液（10mg/ml）酪蛋白预先用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据纯度称量配成标准液10.0mg/ml，用0.05N氢氧化钠溶液配制。
2. 双缩肽试剂取硫酸铜（CuSO4·5H2O.AR）1.5G和酒石酸钾钠（KNaC4H2O·4H2O.AR）6.0g分别用蒸馏水250ml溶解后，一并转入1000ml容量瓶中混合，再加入10%的NAaOH溶液300ml，随加随摇匀。
最后用蒸馏水稀释到刻度，贮存于塑料瓶中，可长期保存，如有红色或黑色沉淀出现，需重新配制。
3.未知浓度酪蛋白溶液：称取上述实验中酪蛋白0.5g，放入100ml烧杯中，加25ml0.2NNaOH 溶液，摇匀隔水加热，将溶液转移到50ml容量瓶中。
用少量蒸馏水洗烧杯数次，洗液并入容量瓶中，最后加水至刻度，摇匀，置冰箱中保存。
仪器1.721分光光度计（使用光径为10mm的比色皿）2.刻度吸管1ml1支、2 ml2支、5ml1支3.试管（15mm×150mm）7支4.托盘天平5.分析天平6.量筒：500 ml、100 ml各1支7.容量瓶：50 ml、1000ml各1支8.恒温水浴（20-250C，如室温接近可不用）。
四、实验方法1. 标准曲线制定：取6支试管编号，按下表加入试剂上述试剂加完后，混匀，室温放置30分钟以内测完，比色（540nm ）。
记下各管光吸收度，做A 540-蛋白质浓度曲线。
双缩脲法试验一蛋白质含量测定
0 0 3 2
1 2 3 4 5 6 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 2.7 2.4 2.1 1.8 1.5 1.2 2 2 2 2 2 2
实验一 蛋方法
2．样液测定
取未知浓度的蛋白液 3.0ml 置试管内，加入双缩尿试剂 2.0ml ，混匀，测其 540nm 的值，对照标准曲线方程， 求得未知液蛋白浓度。 ( 注意：计算浓度时，不要把 2ml 双缩脲试剂计算在内，只
生化技术实验
生物实验中心 2009.10
实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法
一、 目的 学习掌握双缩脲法测定蛋白质含量。 了解其它一些蛋白质定量方法。
(BCA 法、 folin- 酚试剂法，即 lowry 法，紫外分光光度 法,280nm）
实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法
二、原理：
一.
实验目的
了解热水提取多糖的过程与注意事项。并了解 目的物质提取过程中的主要影响因子及其相互
关系。
掌握sevag试剂法除蛋白和乙醇沉降多糖的方法
与注意事项。
并学会使用旋转蒸发仪分离浓缩目的物质。
二 .实验原理
用热水提取真菌植物子实体中的多糖 , 利用 多糖类物质在热水中溶解度较高 , 将其提取 出来。 利用 sevag 试剂将游离蛋白变性成为不溶性 物质,经离心分离去除,可达到去除杂蛋白的 目的 接着利用多糖在乙醇中溶解度降低的原理将 多糖从溶液当中沉降出来。
三、 仪器
中低速离心机、循环真空泵、布式漏斗、 高速干粉粉碎机、恒温水浴锅、旋转蒸发 仪，可见分光光度计。250ml烧杯、试管、 移液管若干、1000mL的磨口锥形瓶1个/组。
实验一 双缩脲法测定血清蛋白质含量
实验一 双缩脲法测定血清蛋白质含量【实验名称】：双缩脲法测定血清蛋白质含量09救援一班 第三大组 李岚宇 2009222336室温：20°（一）实验目的： 1.掌握双缩脲法测定蛋白质的原理。
2.学习掌握分光光度计的使用。
3.掌握标准曲线的制作。
4.学习分光光度法测定的原理和方法。
（二）实验原理：血清中蛋白质的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。
此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲（H 2N-OC-NH-CO-NH 2）在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。
这种紫红色络合物在540nm 处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。
（三）实验材料与仪器：1.仪器和材料： 分光光度计、7支试管、1毫升刻度吸管3支、移液器、坐标纸。
2.试剂：6mol/L 的NaOH 、双缩脲试剂、9g/L 的NaCl 溶液、蛋白质标准液（10g/L)、待测血清样本。
（四）实验步骤和结论:1.取7支试管，编号，按照图1操作并记录。
表 12.在坐标纸上以各管蛋白质含量为横坐标，光吸收值（两管平均值）为纵坐标，绘制标准曲线。
表2 试剂 管号 空白管 标准管 测定管 1 2 3 4 5蛋白质标准液 - 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 - 待测血清样本 - - - - - - 1.0 氯化钠溶液 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 - - 双锁脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 λ光吸收值 0 0.085 0.181 0.261 0.354 0.438 0.317 各管浓度 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 1.43、由标准曲线查出待测的血清样本的蛋白质浓度，由表1得出测定管的蛋白质的λ光吸收值为0.317，由表2得出测定管的蛋白质的浓度为1.4g/L4、按照光吸收法计算公式计算，从标准管中选一管与测定管光吸收值接近者，按公式标测标测A A C C 计算待测血清样本的蛋白质浓度，从上可选测A = 0.317标C =0.354 ,标A =1.6 g/L ; 则得到：测C =1.432 g/L【注意事项】 ： 1.本实验是定量实验，要求所有玻璃仪器必须清洁，整齐、干燥。
双缩脲法测定蛋白质含量实验报告
1. 理解并掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理。
2. 学会使用双缩脲试剂进行蛋白质含量的测定。
3. 通过实验，了解实验误差的产生及其控制方法。
二、实验原理双缩脲法是一种基于蛋白质分子中肽键与铜离子反应产生紫色络合物的分析方法。
当蛋白质分子中的肽键在碱性条件下与铜离子作用时，会形成紫红色的络合物。
该络合物在540nm波长处的吸光度与蛋白质含量呈正比关系，因此可以通过测定吸光度来推算蛋白质的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质标准品- 待测蛋白质样品- 双缩脲试剂- 6mol/L的NaOH溶液- 0.1g/mL的硫酸铜溶液- 7支试管- 移液器- 分光光度计2. 实验仪器：- 磁力搅拌器- 电子天平- 移液管- 量筒1. 标准曲线的制作：- 取7支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的蛋白质标准品溶液，用水补足至1ml。
- 各管中加入4ml双缩脲试剂，充分摇匀。
- 在室温下反应30分钟。
- 使用分光光度计在540nm波长处测定吸光度。
- 以蛋白质标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品测定：- 取待测蛋白质样品1ml，加入4ml双缩脲试剂，充分摇匀。
- 在室温下反应30分钟。
- 使用分光光度计在540nm波长处测定吸光度。
- 从标准曲线上查找对应的蛋白质含量。
五、实验结果与分析根据实验步骤，绘制标准曲线，并在标准曲线上查找待测样品的蛋白质含量。
实验结果显示，待测样品的蛋白质含量为X mg/mL。
六、实验讨论1. 误差分析：- 误差主要来源于实验操作、试剂质量、仪器精度等因素。
- 为了减少误差，需要严格控制实验操作，使用高精度的仪器，并确保试剂质量。
2. 干扰因素：- 双缩脲法测定蛋白质含量时，一些物质可能会产生干扰，如三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等。
- 为了排除干扰，可以在实验前对样品进行预处理，如透析、凝胶过滤等。
3. 注意事项：- 在使用双缩脲试剂时，必须注意试剂的配制和储存条件。
运动生物化学(9.6.1)--尿蛋白的测定
b4
混合后放置 20-30 分钟
b5
540nm 比色 , 空白调零读取测定管光密度值
(OD 测 )
开关
调节 转速
1 、离心机的主要作用是分离 不同比重的各种物质成分。 使用前先检查电源开关必须 在关闭状态、调速旋钮和定 时器旋钮在零的位置上。
Байду номын сангаас
2 、揭开离心机盖子，按照 平衡对称的原则，将离心管 放置于离心机中。
尿蛋白的定量测定
（双缩脲法）
实验目的：
1. 加深对尿蛋白的认识及其测试的意义 2. 掌握双缩脲法测定尿蛋白的原理和操作 方法 3. 学习使用离心机，掌握分光光度计的使 用
相关知识
尿蛋白是指尿中所含的蛋白质，正常人的 尿蛋白质含量在 10mg% 以下，日排出总量 不超过 150mg 。
尿蛋白排出量随运动强度的增大 而 增 与加 采。 样 时 间 、 个 体 差 异 和 项 目 差 异 有 关 。
尿蛋白（ mg% ） = OD 测 /OD 标 χ50
其中 OD 标 = 0.131
注意事项
1 、如果尿液比较混浊，可能是尿液中 的无机盐含量过高造成，会影响测定 结果，可通过加热消除。
2 、在用玻棒搅拌助溶时，注意不或垂 直用力，否则容易造成离心管底破裂 而终止实验。
实验报告要求：
1. 写明姓名、班级、做实验的日期及时间； 2. 最近所从事的运动及运动量的大小，根据 自己的专项来说明自己的实验结果； 3. 用实验结果来评定自己的身体机能状态， 需要怎样去调整； 4. 若数值偏大或偏小，原因是什么，说出理 由。
3 、关闭离心机盖子，插
平衡
上电源插头，打开电源 开关，调节定时器于所
对称
蛋白质的定量测定一-双缩脲法
06
CATALOGUE
双缩脲法的改进和发展方向
改进方法
优化试剂配比
通过调整试剂浓度和比例，提高方法的灵敏度和 准确性，减少误差。
扩大应用范围
针对不同来源和性质的蛋白质样品，优化实验条 件，使其能够适用于更多样品的测定。
ABCD
简化操作步骤
减少实验步骤，降低操作难度，提高实验效率。
提高检测速度
采用快速显色反应或缩短反应时间的方法，缩短 实验周期，提高检测速度。
蛋白质结构研究
通过双缩脲法测定不同蛋白质的含量，有助于研究蛋白质的结构和 功能，进一步了解生物体的生命活动。
蛋白质合成与代谢研究
双缩脲法可以用于研究生物体内蛋白质的合成与代谢过程，探索相 关生理机制。
在医学研究中的应用
临床诊断
双缩脲法可以用于检测尿液、血 液等生物样本中的蛋白质含量， 辅助医生进行临床诊断。
药物研发
在药物研发过程中，双缩脲法可 用于检测药物对蛋白质的影响， 评估药物的疗效和安全性。
病理学研究
通过双缩脲法测定病变组织中蛋 白质的含量，有助于病理学研究 ，深入了解疾病的发生和发展机 制。
在食品工业中的应用
食品品质控制
01
双缩脲法可以用于检测食品中的蛋白质含量，确保食品品质符
合标准。
营养标签
03
CATALOGUE
双缩脲法的结果分析
实验结果记录
实验过程中，需要详细记录每个实验 步骤的操作和结果，包括加入试剂的 种类、浓度、体积，以及反应过程中 的现象和变化等。
实验结果记录应准确、详细，包括实 验数据和观察到的现象，以便后续分 析和处理。
结果计算与处理
根据实验记录的数据，进行相应的计 算和处理，以得出蛋白质的含量。
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实验一尿蛋白的测定（双缩脲法）
尿蛋白是指尿中蛋白质而言，尿蛋白的主要成分是白蛋白。
正常人尿内含有微量蛋白质，成年人每天约排出50-100mg，偶尔达150mg。
在体育运动或训练后，尿中蛋白质的排出量可能达到250mg以上，白天任意尿所含蛋白质可少于10mg/100ml，夜间混合尿可达20mg/100ml。
由于运动而出现尿中蛋白质增加的现象称为运动性蛋白尿。
研究证明，运动后尿蛋白数量的多少与运动量尤其运动强度有关；与运动员身体机能状态有关；与运动员的情绪有关；与不同体育项目有关……。
因此，测定运动员运动后尿中蛋白质的含量，可作为一个简易的生化指标来评定运动员的身体机能状态、运动强度和运动量等。
一、实验目的
1、学会使用移液管，掌握双缩脲法测定尿蛋白的原理和操作方法。
2、初步掌握分光光度计的使用，了解比色法的基本原理。
二、实验原理
蛋白质是含氮的有机高分子化合物，分子中含有多个与双缩脲分子相似的结构（肽键），碱性硫酸铜溶液中，蛋白质与硫酸铜的Cu2+离子等络合物生成紫色络合物。
经光电比色可求出尿中蛋白质的含量。
反应如下：
三、实验试剂及仪器
1、实验试剂
1）、0.15N硫酸
2）、0.15%钨酸钠溶液
3）、双缩脲试剂：称取硫酸铜(CuSO
4∙5H
2
O,A∙R或CP)1.5克、酒石酸钾钠
或（NaKC
4H
2
O,4H
2
O
6
A∙R或CP）6克，分别用蒸馏水约250ml溶解后，全部转移
入1升容量瓶中，混合。
再加入10%氢氧化钠溶液约300ml，随加随摇匀。
最后用蒸馏水稀释至1升。
保存于塑料试剂瓶中或内壁涂有一层纯净石蜡的普通试剂瓶中。
如无红色或和黑色沉淀出现，此试剂可长期使用。
4）、0.9%生理盐水
5）、标准蛋白溶液（500mg/100ml）
2、实验仪器
分光光度计、离心机、移液管、离心管、洗耳球
四、实验操作步骤
测定管（离心管）
5ml尿液 b1
0.15N硫酸2.5ml b2
1.5%钨酸钠
2.5ml b3
混匀后离心5分钟(3000转/分)
倾去上清液,加生理盐水1ml,搅拌 b4
加双缩脲试剂4ml b5
混合后放置20-30分钟
540nm比色,空白调零读取测定管光密度值(OD
测
)五、计算尿蛋白含量
计算公式：尿蛋白（mg%）=（ OD
测/OD
标
）χ50
其中测得OD
标
为0.131
六、注意事项
1、如果尿液比较混浊，可能是尿液中的无机盐含量过高造成，会影响测定结果，可通过加热消除。
2、在用玻棒搅拌助溶时，注意不或垂直用力，否则容易造成离心管底破裂而终止实验。