贴壁细胞培养
第二节细胞培养方法及应用实例
配比
分包
疫苗产品
①原始种子——基因重组病毒株 当两种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细
胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于
亲代的可遗传的子代，称为基因重组。
基因重组病毒有“活病毒基因重组”、“灭活
病毒基因重组”及“死活病毒基因重组”。重组病
毒株原始种子属于死活病毒间的重组。
世卫组织提供的6支甲 型H1N1流感原始毒株
⑷包埋法 包埋就是将细胞包裹在有限空间内，制成固定化细胞。包埋后的细胞
不会扩散到周围介质中去，而底物和产物却能自由扩散。 包埋法仅只是将细胞包埋起来，不与载体发生反应，故包埋法细胞的
活性损失较小。包埋法根据其包埋的形式不同，又可将其分为格子型和微 胶囊型两种。
二、植物细胞培养方法
常见的植物组织细胞培养有愈伤组织培养、原生质体培养、花粉培养
一、动物细胞培养方法
根据动物细胞的生长特点，常见的细胞培养方法有贴壁培养、悬浮培 养及固定化培养等三种方法。
1.贴壁培养
所谓贴壁培养是指细胞贴附在 一定的固相表面（如：培养皿、培 养瓶等）进行的培养。 ⑴生长特性
贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴 壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后 就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。
HGPRT 骨髓瘤细胞
使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞 二者合二为一，得到杂种的骨髓 瘤细胞。这种杂种细胞继承两种
融合
(HAT)培养基
亲代细胞的特性，既具有 B淋巴 细胞合成专一抗体的特性，又有
由于挡板的存在，可有效地减小反应器内液面上的 旋涡。
2.贴壁培养反应器——中空纤维反应器
常见的贴壁培养反应器如：中空纤维反 应器、玻璃珠床反应器、陶质矩形通道蜂窝 状反应器等类型。
贴壁细胞传代培养步骤
贴壁细胞传代培养步骤
一、必要预备材料：
1.黏贴培养基；
2.细胞品系；
3.无菌棉签；
4.注射器；
5.脱硫酸盐卤素灯；
6.无菌细胞刀；
7.培养皿；
二、准备培养基:
1. 将黏贴培养基进行解冻，准备好用于细胞传代培养；
2. 用无菌棉签从瓶口处取出50 µl 培养基，用注射器注入培养皿中；
3. 使用脱硫酸盐卤素灯查看培养皿内的培养基，待培养基稳定后，将其置入培养箱中培养。
三、传代培养：
1. 进行一代细胞培养：将100 μl 细胞品系加入培养基，置入培养箱中培养；
2. 收集细胞：在品系培养至90%~100%阶段时，用无菌细胞刀将培养基连同其中的细胞一起取出；
3. 再生细胞：将细胞回收液均匀分散于新培养皿中，培养至细胞分裂
成熟；
4. 用冷冻融解法进行传代：将细胞悬液的容量加入超净水稀释，冷冻至-80℃后融解，充分混匀均匀后加入培养基中，开始进行传代培养。
四、最终传代注意事项：
1. 使用消毒过的相关器具，保证细胞不受污染；
2. 使用玻璃制品，避免细胞停滞或污染；
3. 确保培养箱的清洁，以免细胞污染；
4. 要保证培养条件的稳定,合理检查、温度、湿度及其他有效细胞培养条件；
5. 按时调整培养液、细胞活力，确保细胞传代培养质量。
贴壁细胞传代培养步骤
贴壁细胞传代培养步骤贴壁细胞传代培养是一项细胞学技术，用于繁殖选定细胞，其目的是在同一种细胞中完成繁殖。
此技术对于基础研究、比较生物学和临床诊断都具有重要意义。
在贴壁细胞传代培养过程中，可以形成一系列细胞系供后续的研究使用，因此这一技术在细胞学研究中扮演着至关重要的角色。
贴壁细胞传代培养具体步骤如下：第一步：首先，将细胞从初始培养基中分离出来，用活细胞物镜观察，查看细胞形态是否正常，结果显示细胞有正常分裂。
第二步：将第一步中分离出的细胞悬浮液转移到饱和细胞悬浮液中，一般采用0.25%的胨酶，将细胞细胞壁分裂，使细胞形成悬浮状态，这一步称为“贴壁”。
第三步：将贴壁后的细胞悬浮液转移到新培养皿中，一般采用Trypsin EDTA抑制剂，使悬浮的细胞不能再分裂，形成不可见的“细胞溶液”，这一步称为“传代”。
第四步：缓慢地用微量移液器将细胞溶液倒入新培养皿中，当液体分散成一液一固时，加入培养基，使细胞随培养基逐渐沉淀，这一步称为“培养”。
第五步：此时，细胞受到培养环境的刺激，开始新一轮的分裂，细胞学习到细胞性质的分化，然后细胞会沉淀在培养皿底部，细胞分裂结束后，就形成了新一代的细胞，从而完成了一次贴壁细胞传代培养实验。
以上就是贴壁细胞传代培养的具体操作步骤，要想做好这项实验，必须按照上述步骤进行操作，只有这样，才能确保实验数据的准确性。
同时，必须注意实验中的环境条件，确保培养基的新鲜，避免菌类污染，进而确保实验的准确性和稳定性。
贴壁细胞传代培养技术正逐步得到应用，目前，它已经运用于很多细胞学领域，尤其是在细胞分化和细胞系的建立中发挥了重要作用。
贴壁细胞传代培养技术更加方便、成本更低，并且能够解决传统细胞培养技术中遗传变异现象导致的假阳性，新增细胞不能够稳定传代等问题，所以受到越来越多的关注。
最后，应该提醒大家，在实验中一定要遵守实验安全规范，做好实验前预防措施，以保障实验安全、获得准确有效的实验结果。
总之，贴壁细胞传代培养技术由于其便捷性、稳定性、节约开销等优点，在细胞学领域具有重要的应用价值，未来将会发挥更大的作用。
贴壁细胞传代培养操作步骤
贴壁细胞传代培养操作步骤作文一：给初学者的贴壁细胞传代培养操作指南亲爱的小伙伴们，今天咱们来聊聊贴壁细胞传代培养那些事儿。
想象一下，细胞就像一个个小小的居民，住在培养皿这个“小区”里。
时间长了，“小区”变得拥挤，它们就需要搬家啦，这就是传代培养。
咱们得准备好工具，就像搬家要准备好箱子一样。
要有干净的培养皿、移液器、胰酶等等。
然后，把培养皿从培养箱里拿出来，在超净台里操作，可不能让细菌和灰尘这些“小捣蛋鬼”跑进去。
再加入胰酶，让细胞和培养皿分开，就像把粘在墙上的贴纸轻轻撕下来。
等细胞变圆了，赶紧加新的培养液终止胰酶的作用，不然细胞会受伤的哦。
用移液器把细胞吸出来，平均分到新的培养皿里，给它们新的“家”。
怎么样，是不是没有那么难？多练习几次，你就能熟练掌握啦！作文二：贴壁细胞传代培养，其实很简单朋友们，今天来和大家分享贴壁细胞传代培养的步骤，别害怕，一点都不难！比如说，我之前在实验室第一次做这个的时候，心里也直打鼓。
但做着做着就发现，真的没那么复杂。
咱们开始吧！先把要用的东西都准备好，像培养皿、移液器、胰酶，一个都不能少，这就好比做饭前要把食材和工具都摆好。
接着，把培养皿轻轻拿出来，动作要轻，不然细胞会被吓到的。
然后把里面的培养液吸掉，这就像给花浇水后把多余的水倒掉。
之后加入胰酶，等一会儿，你会看到细胞慢慢变圆，就好像它们在伸懒腰准备搬家。
这时，加新的培养液停止胰酶的作用，再把细胞吸出来，分到新的培养皿里，就大功告成啦！多试几次，你会发现自己越来越熟练，细胞在你的照顾下也会茁壮成长的！作文三：贴壁细胞传代培养，轻松上手小伙伴们，细胞传代培养听起来是不是很高深？其实很简单，跟我来！假设细胞是一群可爱的小朋友，在一个小小的教室里待久了，就得换个大点儿的教室，这就是传代培养。
第一步，把所有的“装备”都准备齐全，像新的培养皿、移液器，还有胰酶，这就像给小朋友们准备新的书包和文具。
第二步，把装着细胞的培养皿从“小房子”（培养箱）里拿出来，放在干净的“桌子”（超净台）上。
贴壁细胞培养步骤及注意事项
贴壁细胞培养步骤一、复苏1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。
液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。
2.把上述细胞悬液吸到装有10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。
3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。
吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。
4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。
5.3天换一次培养基（具体看细胞生长状态及培养液情况）。
二、传代1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。
2.把原有培养基吸掉。
3.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS4.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。
5.当看到细胞开始脱离培养皿时倒掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终止消化。
6.用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。
7.把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
8.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。
9.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。
一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个，继续培养。
10.若是只培养一皿，只需吹散后倒剩1/4左右，重新加入培养液继续培养。
三、冻存1.把原有培养基吸掉。
2.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS3.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。
4.去掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终止消化。
5.吹落后把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
6.加入1毫升冻存液悬浮细胞，装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。
7.4℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。
配制溶液一、培养基配制（1）（DEME培养基）89%基础培养基+10%血清（FBS）+1%双抗45毫升培养基+5毫升血清+0.5毫升双抗（2）（1640培养基）89%基础1640培养基+10%血清（FBS）+1%双抗45毫升培养基+5毫升血清+0.5毫升双抗二、冻存液90%血清+10%DMSO；DMSO要慢慢滴加，边滴边摇三、消毒液75%的酒精注意事项（1）进入细胞间必须严格按照下列步骤操作①确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。
细胞贴壁原理
细胞贴壁原理细胞贴壁原理是指细胞在培养基表面附着生长的现象和规律。
细胞贴壁原理是细胞培养中一个非常重要的概念，对于细胞的培养、观察、实验等都有着重要的意义。
本文将从细胞贴壁原理的定义、影响因素、意义以及相关应用等方面进行介绍。
首先，细胞贴壁原理的定义是指细胞在培养基表面附着生长的现象。
这种附着生长是细胞与培养基表面之间的物理和化学相互作用的结果。
细胞贴壁的程度与培养基的成分、表面性质、细胞类型等因素密切相关。
其次，影响细胞贴壁的因素有很多，主要包括培养基的成分、pH值、温度、涂层物质、细胞的种类和状态等。
培养基的成分对细胞贴壁有着直接的影响，例如一些培养基中添加的胶原蛋白、明胶等物质可以增加细胞的附着性。
此外，pH值和温度也会对细胞的附着生长产生影响，一般来说，细胞在适宜的pH值和温度下更容易贴壁生长。
涂层物质的选择也是影响细胞贴壁的重要因素，例如将培养皿表面涂覆明胶、胶原蛋白等蛋白质可以增加细胞的附着性。
另外，细胞的种类和状态也会对贴壁产生影响，一般来说，成纤维细胞、上皮细胞等贴壁能力较强的细胞种类，而白血球、淋巴细胞等则贴壁能力较弱。
细胞贴壁原理在细胞培养、细胞实验等方面具有重要的意义。
首先，细胞贴壁是进行细胞培养的前提和基础，只有细胞贴壁生长，才能进行后续的实验和观察。
其次，细胞贴壁的程度也影响着细胞的生长状态和功能表达，因此在细胞实验中需要注意细胞的贴壁状态。
另外，细胞贴壁原理也在细胞移植、组织工程等领域有着重要的应用。
细胞贴壁原理是细胞培养中一个基础而重要的概念，了解和掌握细胞贴壁原理对于细胞培养和实验有着重要的意义。
在实际操作中，我们需要根据具体的细胞类型和实验要求，合理选择培养基的成分、涂层物质等，以促进细胞的贴壁生长。
同时，也需要在细胞实验中注意细胞的贴壁状态，确保实验结果的准确性和可靠性。
综上所述，细胞贴壁原理是细胞培养中一个基础且重要的概念，对于细胞培养和实验有着重要的意义。
贴壁细胞培养
北京索莱宝科技有限公司
贴壁细胞培养
细胞名称：293T，人胎肾细胞
生长特性：贴壁生长
培养条件：DMEM-H(4.5g/L Glucose）+10%FBS
传代方法：1:3～1:4传代，一周2~3次
冻存条件：细胞冻存液
细胞处理方法：
1.细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超
净台中操作。
2.如细胞生长至70%-80%，将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用，保留5-8mL培养基在37℃、5%
的CO2的温箱中继续培养。
细胞培养至90%-100%后，按要求消化传代。
3.弃去培养基，用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待细胞
完全脱壁且细胞连接松散时再吹打，将细胞分离成单个后，加培养基混匀，分瓶培养。
特别注意：（如使用公共实验室或初次接触细胞培养，建议添加双抗培养）
1.我们使用自产培养基及进口血清培养细胞，在您拿回细胞后，如想更换其它品牌培养基，请依照逐次替换的原则，先保留培养瓶中的培养基，多日多次代逐步更换，以减轻对细胞的刺激。
2.如签收时出现培养瓶壁破裂，漏液等情况请及时拍照并联系售后。
3.细胞任何售后问题，均需拍照存档并在2周之内及时联系客服。
第1页，共1页。
贴壁细胞培养步骤及注意事项
贴壁细胞培养步骤及注意事项第一步：准备工作1.1清洁实验台面和培养器具在开始培养之前，应先清洁培养器具和实验台面，以确保无菌环境。
1.2准备培养基根据不同实验的要求，准备需要的培养基，并确保其无菌。
1.3预热培养基和器械将培养基和器械置于37℃的培养箱中，使其达到需要的温度。
第二步：细胞分离2.1收集细胞使用无菌技术，收集需要培养的细胞，最好使用处于快速生长期的细胞。
2.2细胞计数使用显微镜和计数板计数细胞数目，以便确定接种的细胞数量。
2.3离心细胞将细胞离心，去除上清液。
第三步：贴壁培养3.1接种细胞将细胞重新悬浮在预热的培养基中，并根据需要的细胞浓度接种到培养器皿中（例如培养皿、培养瓶等）。
3.2倾斜培养器具倾斜培养器具，以确保细胞均匀分布并黏附于底部。
3.3培养器出现倒置的小液滴密封培养器，以防止培养基蒸发和外界污染。
第四步：培养条件4.1恒温条件将培养器放在恒温箱中，维持适当温度（通常为37℃）和湿度。
4.2CO2条件对于一些细胞，需要提供CO2环境以保持合适的pH值。
可以通过加入CO2气体或培养箱添加CO2控制器来实现。
4.3培养时间根据细胞类型和所需实验目的，确定合适的培养时间。
第五步：观察和维护细胞5.1细胞观察使用显微镜定期观察细胞的形态和增长情况。
注意检查细胞的黏附性和细胞层的均一性。
5.2细胞维护根据需要，定期更换培养基，以保持细胞的正常生长和功能。
5.3细胞传代根据细胞生长状态，当细胞层达到一定的密度时，可进行细胞的传代，以保持细胞的活性和健康。
注意事项：1.确保所有用于细胞培养的器具和培养基都是无菌的，以防止细胞受到外界污染。
2.严格遵循无菌技术，避免任何可能导致细菌和真菌污染的操作。
3.细胞培养过程中，保持实验室卫生，定期清洗工作台和设备。
4.在细胞培养中，要注意避免细胞的过度处理和操作。
5.对于一些特殊类型的细胞，如原代细胞，可能需要特殊的培养条件和技术，需要进行额外的注意和维护。
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贴壁细胞培养 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998
贴壁细胞培养
一、克隆形成抑制试验
原理：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在-1.0 mm之间。
通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。
这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。
常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。
本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。
材料与方法
（一）用品：
含15%新生牛血清的RPMI-1640培养液、含10%新生牛血清的RPMI-
1640、培养液PBS、%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔
板、EP管。
5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。
（二）操作：
①.制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，用%胰酶消化并吹打成单个细胞，含10%血清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密度为3×102个/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。
PBS过一遍，加1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP 管混合，取10μl细胞计数
倍比稀释（吸出1ml，加2ml培养液。
Mix。
）
吸出1ml，弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液。
重复。
直到需要的细胞数。
12600个细胞/3ml，或8400个细胞/2ml。
种板：12孔板，加培液，加1ml细胞，不用摇。
②.待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000 μL，设6组0，，，，，
μg/ml药物组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO2，饱和湿度条件培养箱内孵育7天。
计数：
满体积2000ul 其中药物浓度100ug/ml 100ul
NS: 0 100 N=2
μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X = + NS N=2
μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X = + NS ul N=2
μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X = + NS N=2
μg/ml *2000ul = 100ug/ml * X X = + NS ul N=2
μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X = ul + NS ul N=1
4.66μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X = ul + NS ul N=1
eg:5-FU * 3 + NS * 3 mix 在EP管中。
等待加药。
N=2
③.吸去培养液，加入PBS洗涤后，染色,干燥：
刘氏染色法
加Liu A Solution ml染色30 s。
滴加Liu B Solution 1ml于A液上面,轻吹使其充分混合,染色1 min。
水洗, 干燥、拍照
二、细胞传代
原理：培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。
为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。
材料与方法
（一）用品：
含10%新生牛血清的RPMI-1640、培养液PBS、%胰酶、EP管，细胞培
养瓶。
（二）操作：
①制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，PBS过一遍，加%胰酶消化并吹打成单个细胞，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出至另
一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP管混合，取10μl细胞计数用。
②细胞传代：在之前制备的细胞悬液中，用滴管吸取1/3滴管至细胞培养瓶，后用滴管吸取3滴管含10%新生牛血清的RPMI-1640至细胞培养瓶，关紧瓶盖用酒精棉球搽拭后，放入37℃5%CO
培养箱中孵育。
2
三、MTT比色法
原理：MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。
实验所用的显色剂是一种能接受氢原子的染料。
化学名3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐。
商品名噻唑蓝，MTT。
活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT 还原为难溶性的兰紫色结晶物，并沉积在细胞中。
而死细胞无此功能。
二甲基亚砜DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其吸光值，可间接反应活细胞数量，在一定的范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。
与其他检测方法如细胞计数法，3H掺入法，LDH法有良好的相关性。
材料与方法
（一）用品：
1 MTT液：称取250mgMTT，放入小烧杯内，加50ml PBS（0.01M，）在电磁
力搅拌仪上搅拌30min。
用 um的微孔滤器除菌，分装4度保存，2周内有效。
2. 10%新生牛血清的RPMI-1640， %胰酶，DMSO（分析纯）
3. 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），
用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。
（二）步骤
1. 接种细胞，用%的胰酶消化细胞，1min,弃胰酶。
2. 用10%小牛血清的1640培养液配成单个细胞，取100μl到EP管中，吹打，
计数。
3. 配5000个细胞/120ul。
用96孔板，设0， 2， 4， 8， 16， 24 μg/ml组每空
加入120μl细胞。
培养。
4. 第二天，加入药物40μl。
5，培养48h。
每孔加入MTT（5mg/ml）20μl，继续培养4h。
小心吸弃孔内的上清液。
6. 每孔加入150μl的DMSO，震荡10min，570nm 测吸光值。
满体积160ul 其中药物40μl 药物浓度100ug/ml(对照组加40μlNS)
2μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X = ul + NS ul
4μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X = + NS ul
8μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X = + NS ul
16μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X = ul + NS ul
24μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X = ul + NS ul
5-FU * 4 + NS * 4 mix 在EP管中。
等待加药。
CCK-8法步骤
1. 接种细胞，用%的胰酶消化细胞，1min,弃胰酶。
2. 用10%小牛血清的1640培养液配成单个细胞，取100μl到EP管中，吹打，
计数。
3. 配5000个细胞/120ul。
用96孔板，设0， 2， 4， 8， 16， 24 μg/ml组每空
加入120μl细胞。
培养。
4. 第二天，加入药物40μl。
5，培养48h。
每孔加入CCK-8溶液10μl，继续培养30—90min。
6. 震荡10min，450nm 测吸光值。