贴壁细胞培养
贴壁细胞培养 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998
贴壁细胞培养
一、克隆形成抑制试验
原理：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在-1.0 mm之间。通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。
材料与方法
（一）用品：
含15%新生牛血清的RPMI-1640培养液、含10%新生牛血清的RPMI-
1640、培养液PBS、%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔
板、EP管。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。
（二）操作：
①.制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，用%胰酶消化并吹打成单个细胞，含10%血清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密度为3×102个/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。
PBS过一遍，加1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP 管混合，取10μl细胞计数
倍比稀释（吸出1ml，加2ml培养液。Mix。）
吸出1ml，弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液。
重复。
直到需要的细胞数。12600个细胞/3ml，或8400个细胞/2ml。
种板：12孔板，加培液，加1ml细胞，不用摇。
②.待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000 μL，设6组0，，，，，
μg/ml药物组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO2，饱和湿度条件培养箱内孵育7天。
计数：
满体积2000ul 其中药物浓度100ug/ml 100ul
NS: 0 100 N=2
μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X = + NS N=2
μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X = + NS ul N=2
μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X = + NS N=2
μg/ml *2000ul = 100ug/ml * X X = + NS ul N=2
μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X = ul + NS ul N=1
4.66μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X = ul + NS ul N=1
eg:5-FU * 3 + NS * 3 mix 在EP管中。等待加药。N=2
③.吸去培养液，加入PBS洗涤后，染色,干燥：
刘氏染色法
加Liu A Solution ml染色30 s。
滴加Liu B Solution 1ml于A液上面,轻吹使其充分混合,染色1 min。
水洗, 干燥、拍照
二、细胞传代
原理：培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。
材料与方法
（一）用品：
含10%新生牛血清的RPMI-1640、培养液PBS、%胰酶、EP管，细胞培
养瓶。
（二）操作：
①制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，PBS过一遍，加%胰酶消化并吹打成单个细胞，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出至另
一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP管混合，取10μl细胞计数用。
②细胞传代：在之前制备的细胞悬液中，用滴管吸取1/3滴管至细胞培养瓶，后用滴管吸取3滴管含10%新生牛血清的RPMI-1640至细胞培养瓶，关紧瓶盖用酒精棉球搽拭后，放入37℃5%CO
培养箱中孵育。
2
三、MTT比色法
原理：MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。实验所用的显色剂是一种能接受氢原子的染料。化学名3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐。商品名噻唑蓝，MTT。活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT 还原为难溶性的兰紫色结晶物，并沉积在细胞中。而死细胞无此功能。二甲基亚砜DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其吸光值，可间接反应活细胞数量，在一定的范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。
与其他检测方法如细胞计数法，3H掺入法，LDH法有良好的相关性。
材料与方法
（一）用品：
1 MTT液：称取250mgMTT，放入小烧杯内，加50ml PBS（0.01M，）在电磁
力搅拌仪上搅拌30min。用 um的微孔滤器除菌，分装4度保存，2周内有效。
2. 10%新生牛血清的RPMI-1640， %胰酶，DMSO（分析纯）
3. 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），
用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。
（二）步骤
1. 接种细胞，用%的胰酶消化细胞，1min,弃胰酶。
2. 用10%小牛血清的1640培养液配成单个细胞，取100μl到EP管中，吹打，
计数。
3. 配5000个细胞/120ul。用96孔板，设0， 2， 4， 8， 16， 24 μg/ml组每空
加入120μl细胞。培养。
4. 第二天，加入药物40μl。
5，培养48h。每孔加入MTT（5mg/ml）20μl，继续培养4h。小心吸弃孔内的上清液。
6. 每孔加入150μl的DMSO，震荡10min，570nm 测吸光值。
满体积160ul 其中药物40μl 药物浓度100ug/ml(对照组加40μlNS)
2μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X = ul + NS ul
4μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X = + NS ul
8μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X = + NS ul
16μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X = ul + NS ul
24μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X = ul + NS ul
5-FU * 4 + NS * 4 mix 在EP管中。等待加药。
CCK-8法步骤
1. 接种细胞，用%的胰酶消化细胞，1min,弃胰酶。
2. 用10%小牛血清的1640培养液配成单个细胞，取100μl到EP管中，吹打，
计数。
3. 配5000个细胞/120ul。用96孔板，设0， 2， 4， 8， 16， 24 μg/ml组每空
加入120μl细胞。培养。
4. 第二天，加入药物40μl。
5，培养48h。每孔加入CCK-8溶液10μl，继续培养30—90min。
6. 震荡10min，450nm 测吸光值。