实验2荧光显微镜的使用ppt课件
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荧光显微镜分析课件
染色体染色实验
总结词
通过荧光染色技术，观察染色体的结构和数目。
详细描述
采用荧光染料对染色体进行染色，在荧光显微镜下观察染色体的形态、数目和分布，可用于研究染色 体变异、基因定位和遗传疾病等。
荧光原位杂交实验
总结词
通过荧光原位杂交技术，检测特定基因 在染色体上的位置。
VS
详细描述
利用荧光标记的探针与染色体上的特定基 因进行杂交，在荧光显微镜下观察杂交信 号的位置和强度，可用于基因定位、染色 体变异分析和遗传疾病诊断等。
荧光显微镜分析课件
目录 CONTENTS
• 荧光显微镜简介 • 荧光显微镜的基本原理 • 荧光显微镜的操作方法 • 荧光显微镜的实验技术 • 荧光显微镜的实验案例
01
荧光显微镜简介
定义与特点
定义
荧光显微镜是一种利用特定波长 的光激发细胞内或组织内的荧光 物质，从而观察细胞或组织的结 构和功能的显微镜。
重要意义。
05
荧光显微镜的实验案例
细胞核染色实验
总结词
通过荧光染色技术，观察细胞核的结构和分布。
详细描述
采用荧光染料对细胞核进行染色，在荧光显微镜下观察细胞核的形态、大小、分 布以及染色质结构，可用于研究细胞分裂、基因表达和疾病诊断等。
线粒体染色实验
总结词
通过荧光染色技术，观察线粒体的结 构和功能。
荧光共定位技术
荧光共定位技术是一种利用两种或多种 荧光染料标记细胞内不同组分，通过观 察它们的空间位置关系来研究细胞结构
和功能的技术。
通过高分辨率的荧光显微镜观察，可以 清晰地看到不同组分在细胞内的具体位
置和相互关系。
荧光共定位技术广泛应用于生物学、医 学和化学等领域，对于研究细胞内分子 相互作用和细胞生物学特性等方面具有
荧光显微镜的基本使用方法
荧光显微镜的工作原理
荧光显微镜通常由光源、滤 光片、物镜、目镜和荧光屏 等部分组成。
激发光通过物镜照射到样品 上，激发样品中的荧光物质 发出荧光。
光源发出特定波长的光，通 过滤光片过滤掉其他波长的 光，只留下激发光。
荧光通过物镜和目镜的放大 作用，在荧光屏上呈现样品 的图像。
荧光显微镜的应用领域
如果发现仪器工作异常，应及时维修或更换部件，以免影响 观察结果。
定期进行仪器保养与维护
荧光显微镜需要定期进行保养和维护，以确保其长期稳定运行。
保养和维护内容包括清洗物镜、校准光源、检查电路连接等，具体操作应根据仪器说明书进行。
谢谢观看
生物学
荧光显微镜在生物学研究中广 泛应用，如细胞形态学、细胞 分子生物学和生物医学成像等
。
医学
荧光显微镜在医学诊断和治疗 中发挥重要作用，如病理学诊 断、肿瘤标记和药物筛选等。
环境科学
荧光显微镜可用于环境监测和 污染控制等领域，如水体和土 壤中污染物的检测。
材料科学
荧光显微镜在材料科学中用于 研究材料的微观结构和性能， 如表面增强拉曼散射和光子晶
02
了解各种荧光染料的激发波长和发射波长，以便正 确选择合适的滤光片。
03
按照染料说明书进行配制和染色，注意控制浓度和 时间，避免过度染色或染色不足。
样本的制备与染色
01 根据实验目的选择合适的样本，如细胞、 组织切片等。
02
对样本进行预处理，如清洗、固定、脱水 等，以便更好地染色和观察。
03
采用适当的染色方法对样本进行染色，如 免疫荧光染色、核酸染色等。
02
将显微镜的载物台恢复原位， 清理现场。
03
对仪器进行日常维护和保养， 确保仪器性能稳定和延长使用 寿命。
【优质】荧光显微镜的基本使用方法PPT
four
to
six
"cuben(dso"iasteshcpaoitepccioecnialtlanuidmn tiarnaamntosixmr,tucitroteendodfleiginnhstetecrr,foefmireeplndocneents diaphragm, filters, etc.) are built into the main
多用途型BX-RFA(适合多种科研要求)及通用型BX-URA2。 C、关闭显微镜光源，打开荧光通道。 嗜中性粒细胞中脱氢酶辅酶呈现一定的荧光。
emitted from the lamp positioned in the episcopic lamphouse passes through a collector lens and then the field and aperture
Hale Waihona Puke 禁止乱调设置，以免影响他人正常使用。
frame, while fluorescence components are
另细3Sb禁e、e外胞止fcoo作r， 核 乱ne为d根与调paa荧r据细设sys光需胞置filnu显g要质，ort微e还以DhsrN镜o可免cAue使以影gn的hc用选响直ea,；择他接ebma人6荧r孔irt正i光tee滤rd常染f色ibl使色tye片用rfl滑au。no块droi(pnUhto-oRrteShseL6rme/Usici-drRoinSsgcLoi6npEetMhee)y安sepp放eiec激cime发se滤no,r色tcraa片vme和elsr发absa射ycsk滤thistialnehtllonh色uicmadurmletoiu片.snxcuidegncog进idaninthtugtait行onarttarhriioste荧nehbntoeaa光otffhritbvmlerat观ejieeneitrxrcr察th.ctitucfAooiiv。arlunsteeelstiiaroeall,lliuufsnndsmidifnactortithnauehrreatrreoefvtteiododocrriela.csmvnThbiixnicrohrgoer"veocieocsfrui,,relbtmaleiegnrirsshdr"ot r
荧光显微镜PPT课件
度、荧光效率
.
11
荧光显微镜的种类
透射式
落射式
.
12
荧光显微镜的主要部件
透射式
• 汞灯光源 • 激发滤色镜 • 暗场聚光镜 • 吸收滤色镜
落射式
• 汞灯光源 • 激发滤色镜 • 分色镜 • 吸收滤色镜
.
13
暗视野照明方式
聚光镜中央有档 光片，使照明光 线不直接进入物 镜，只允许被标 本反射和衍射的 光线进入物镜， 因而视野的背景 是黑的，物体的 边缘是亮的。
优点： • 检出能力高 • 对细胞的刺激小 • 能进行多重染色 用途： • 物体构造的观察 • 荧光的有无、色调比较进行物质判别 • 发荧光量的测定对物质定性、定量分析
.
4
什么是荧光 ?
物质中的电子吸收光的能量由低能状态转 变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。
即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
.
Immersion objective with specimen
20
透射荧光显微镜
优点：
• 由于用了暗场聚光镜，激发光不能进入物镜，因 此容易形成暗的背景，得到良好的反差。 • 由于上述同样的原因，任何物镜都可用于观察。 • 用低倍物镜时，比反射荧光显微镜更亮。
.
21
透射荧光显微镜
缺点：
• 必须正确调整聚光镜中心和高度，否则不能获得明亮的荧 光像。 • 由于暗视场聚光镜焦距限制，不能使用厚的载玻片。 • 视场照明区不能过大，否则容易使荧光标本荧光色衰褪。 • 厚的或不透明的标本不适用。
water or oil immersion objective medium (water or oil) specimen
Light source
.
11
荧光显微镜的种类
透射式
落射式
.
12
荧光显微镜的主要部件
透射式
• 汞灯光源 • 激发滤色镜 • 暗场聚光镜 • 吸收滤色镜
落射式
• 汞灯光源 • 激发滤色镜 • 分色镜 • 吸收滤色镜
.
13
暗视野照明方式
聚光镜中央有档 光片，使照明光 线不直接进入物 镜，只允许被标 本反射和衍射的 光线进入物镜， 因而视野的背景 是黑的，物体的 边缘是亮的。
优点： • 检出能力高 • 对细胞的刺激小 • 能进行多重染色 用途： • 物体构造的观察 • 荧光的有无、色调比较进行物质判别 • 发荧光量的测定对物质定性、定量分析
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4
什么是荧光 ?
物质中的电子吸收光的能量由低能状态转 变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。
即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
.
Immersion objective with specimen
20
透射荧光显微镜
优点：
• 由于用了暗场聚光镜，激发光不能进入物镜，因 此容易形成暗的背景，得到良好的反差。 • 由于上述同样的原因，任何物镜都可用于观察。 • 用低倍物镜时，比反射荧光显微镜更亮。
.
21
透射荧光显微镜
缺点：
• 必须正确调整聚光镜中心和高度，否则不能获得明亮的荧 光像。 • 由于暗视场聚光镜焦距限制，不能使用厚的载玻片。 • 视场照明区不能过大，否则容易使荧光标本荧光色衰褪。 • 厚的或不透明的标本不适用。
water or oil immersion objective medium (water or oil) specimen
Light source
荧光显微镜使用
显微镜介绍
显微镜的基本调节
打开电源-放入片子-调节灯光-调节倍数-调 节图像清晰
打开荧光电源-放入片子-调节荧光显色-调 节图像清晰
开机顺序
电源-显微镜-荧光电源-电脑
注意事项：汞灯电源开关的预热时间为 15-30分钟，一旦关闭后若再次开启需要
冷却30分钟
拍摄软件的介绍
２个软件
分析软件
拍摄软件的主要功能 １拍摄
其他标记
线条（测量长度） 测量角度 箭头 文字
照片保存
荧光的拍摄
LIVE—EXPOSE—分辨率-SNAP 不可使用白平衡
如果荧光比较弱，可 以调节Binning，但是
会增加噪点
照片合成
其他功能
1 拍摄录像 2 批量加注修改标尺（仅限蔡氏文件） 3 伪3D功能 4 shading correction –去除背景黑点功能 5 拍摄后调节白平衡功能（生成新的文件）
普通光镜的拍摄
肉眼观察 光栅调节 Live 显微镜微调 Snap
电脑数据的调节
3200k 自 然光对应 的白色色
温
照片保存
ZVI格式：未压缩，重要文件可以先保存这个 Tiff格式：目前用的比较多
增加标尺
带标尺图片的保存
该保存标尺不可去除 标尺必须在选对物镜以及选择1380*1440的 情况下才是可靠的
Smooth 明场平 滑（边缘）
谢谢方式EXCEL表格
1 软件计算点（细胞个数） 2 测量角度，面积 3 轨迹测量工具 4 修改图片-锐化增加对 比度 5 确定细胞内颗粒数量
谢谢
Keep tools: 同样功能
计数，右键可以告知数目
同时可测面积平均灰度值， 线条和长度
保留选取所需的区域
显微镜的基本调节
打开电源-放入片子-调节灯光-调节倍数-调 节图像清晰
打开荧光电源-放入片子-调节荧光显色-调 节图像清晰
开机顺序
电源-显微镜-荧光电源-电脑
注意事项：汞灯电源开关的预热时间为 15-30分钟，一旦关闭后若再次开启需要
冷却30分钟
拍摄软件的介绍
２个软件
分析软件
拍摄软件的主要功能 １拍摄
其他标记
线条（测量长度） 测量角度 箭头 文字
照片保存
荧光的拍摄
LIVE—EXPOSE—分辨率-SNAP 不可使用白平衡
如果荧光比较弱，可 以调节Binning，但是
会增加噪点
照片合成
其他功能
1 拍摄录像 2 批量加注修改标尺（仅限蔡氏文件） 3 伪3D功能 4 shading correction –去除背景黑点功能 5 拍摄后调节白平衡功能（生成新的文件）
普通光镜的拍摄
肉眼观察 光栅调节 Live 显微镜微调 Snap
电脑数据的调节
3200k 自 然光对应 的白色色
温
照片保存
ZVI格式：未压缩，重要文件可以先保存这个 Tiff格式：目前用的比较多
增加标尺
带标尺图片的保存
该保存标尺不可去除 标尺必须在选对物镜以及选择1380*1440的 情况下才是可靠的
Smooth 明场平 滑（边缘）
谢谢方式EXCEL表格
1 软件计算点（细胞个数） 2 测量角度，面积 3 轨迹测量工具 4 修改图片-锐化增加对 比度 5 确定细胞内颗粒数量
谢谢
Keep tools: 同样功能
计数，右键可以告知数目
同时可测面积平均灰度值， 线条和长度
保留选取所需的区域
荧光显微镜的原理和使用方法
详细描述
激光共聚焦扫描显微镜采用激光作为激发光源，具有高分辨率和高灵敏度，能够观察细胞内细微结构 和动态过程。它通过逐点扫描样品，获得高清晰度的图像，特别适合观察细胞骨架、线粒体和内质网 等结构。
多光子荧光显微镜
总结词
一种非线性光学成像技术，适用于观察活体动物和组织。
详细描述
多光子荧光显微镜采用多光子激发技术，能够在不损伤样品的情况下获得高分辨率和高对比度的图像。它通过使 用脉冲激光和光子计数检测器，能够观察活体动物和组织中的荧光标记物，特别适合用于神经科学和生物学等领 域的研究。
Hale Waihona Puke 谢谢观看光源提供特定波长的激 发光，通常为紫外 光或蓝光。
样品
放置待观察的荧光 样品。
目镜或摄像系统
观察或记录荧光图 像。
荧光物质和激发光
荧光物质
某些物质在吸收激发光后，会发出特定波长的荧光。
激发光
用于激发荧光物质的特定波长光线。
荧光产生的原理
01
当荧光物质吸收激发光时，电子 从基态跃迁至激发态。
02
激发态的电子不稳定，会释放能 量并返回到基态，同时发出荧光 。
03
荧光显微镜的使用方法
荧光显微镜的安装和调试
安装
荧光显微镜应放置在平稳的工作台上 ，确保电源和光源的连接稳定。
调试
调整显微镜的焦距和光源亮度，确保 图像清晰可见。
荧光样品的制备
荧光染料选择
根据观察目标选择合适的荧光染料， 如FITC、TRITC等。
样品处理
将荧光染料与样品混合，进行染色处 理，然后洗涤和干燥。
，进行相应的调整。
使用注意事项
01 使用前先了解操作规程，遵循操作步骤， 避免因误操作导致仪器损坏。
激光共聚焦扫描显微镜采用激光作为激发光源，具有高分辨率和高灵敏度，能够观察细胞内细微结构 和动态过程。它通过逐点扫描样品，获得高清晰度的图像，特别适合观察细胞骨架、线粒体和内质网 等结构。
多光子荧光显微镜
总结词
一种非线性光学成像技术，适用于观察活体动物和组织。
详细描述
多光子荧光显微镜采用多光子激发技术，能够在不损伤样品的情况下获得高分辨率和高对比度的图像。它通过使 用脉冲激光和光子计数检测器，能够观察活体动物和组织中的荧光标记物，特别适合用于神经科学和生物学等领 域的研究。
Hale Waihona Puke 谢谢观看光源提供特定波长的激 发光，通常为紫外 光或蓝光。
样品
放置待观察的荧光 样品。
目镜或摄像系统
观察或记录荧光图 像。
荧光物质和激发光
荧光物质
某些物质在吸收激发光后，会发出特定波长的荧光。
激发光
用于激发荧光物质的特定波长光线。
荧光产生的原理
01
当荧光物质吸收激发光时，电子 从基态跃迁至激发态。
02
激发态的电子不稳定，会释放能 量并返回到基态，同时发出荧光 。
03
荧光显微镜的使用方法
荧光显微镜的安装和调试
安装
荧光显微镜应放置在平稳的工作台上 ，确保电源和光源的连接稳定。
调试
调整显微镜的焦距和光源亮度，确保 图像清晰可见。
荧光样品的制备
荧光染料选择
根据观察目标选择合适的荧光染料， 如FITC、TRITC等。
样品处理
将荧光染料与样品混合，进行染色处 理，然后洗涤和干燥。
，进行相应的调整。
使用注意事项
01 使用前先了解操作规程，遵循操作步骤， 避免因误操作导致仪器损坏。
荧光荧光显微镜和荧光分光光度计课件PPT
（3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。
（4）检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强 度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3～5min后，荧光 也明显减弱；所以，最多不得超过2～3h。
（5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节 省时间， 保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始 就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后 才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。
荧光荧光显微镜和荧光Байду номын сангаас光光度计
2 常见荧光素：
（1）异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC) （2）四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200) （3）四甲基异硫氰酸罗丹明
(tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC) （4）镧系 （5）藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，其基 因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧 光。
在生物学研究中绿色荧光蛋白具有广泛用途，包括有：
分子标记 利用绿色荧光的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签
(protein tagging)，即利用DNA重组技术， 将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合 适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便 可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。
抗补体染色法简称补体法，是间接染色法的一种改良法， 本法利用补体结合反应的原理，用荧光素标记抗补体抗体，
直接法
荧光素标记的特异性 抗体直接与相应抗原 反应。
直接荧光抗体染色法示意图
（4）检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强 度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3～5min后，荧光 也明显减弱；所以，最多不得超过2～3h。
（5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节 省时间， 保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始 就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后 才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。
荧光荧光显微镜和荧光Байду номын сангаас光光度计
2 常见荧光素：
（1）异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC) （2）四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200) （3）四甲基异硫氰酸罗丹明
(tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC) （4）镧系 （5）藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，其基 因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧 光。
在生物学研究中绿色荧光蛋白具有广泛用途，包括有：
分子标记 利用绿色荧光的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签
(protein tagging)，即利用DNA重组技术， 将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合 适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便 可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。
抗补体染色法简称补体法，是间接染色法的一种改良法， 本法利用补体结合反应的原理，用荧光素标记抗补体抗体，
直接法
荧光素标记的特异性 抗体直接与相应抗原 反应。
直接荧光抗体染色法示意图
实验荧光显微镜的使用演示文稿
现在是28页\一共有51页\编辑于星期六
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反射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
分色镜 物镜
标本
现在是30页\一共有51页\编辑于星期六
汞灯
激发滤色镜
反射荧光显微镜的构造
吸收滤色镜
紫外线 保护罩
激发滤色镜 孔径光栏（FS） 视场光栏（AS）
分色镜
汞灯
现在是31页\一共有51页\编辑于星期六
荧光素的特性
荧光素
激发波长 发射波长
DAPI
372
456
AMC A
350
450
Hoe chst 33258
365
465
FITC
490
520
Acridine O range 4 9 0
590
Acridine Ye llow
470
550
C Y3
552
565
TRITC
541
572
Propidium Iodide 5 3 0
转变为高能状态，再回到低能状态时释放出 的光。
即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
现在是10页\一共有51页\编辑于星期六
荧光的性质
保持固有的荧光特性
n荧光波长＞激发波长
n荧光强度极小于激发光的强度
n有不同程度的衰减 n荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效 率
现在是11页\一共有51页\编辑于星期六
暗场聚光镜
现在是6页\一共有51页\编辑于星期六
汞灯箱
激发滤色镜
透射荧光显微镜原理
目镜
透射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
物镜
暗场聚光镜
现在是29页\一共有51页\编辑于星期六
反射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
分色镜 物镜
标本
现在是30页\一共有51页\编辑于星期六
汞灯
激发滤色镜
反射荧光显微镜的构造
吸收滤色镜
紫外线 保护罩
激发滤色镜 孔径光栏（FS） 视场光栏（AS）
分色镜
汞灯
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荧光素的特性
荧光素
激发波长 发射波长
DAPI
372
456
AMC A
350
450
Hoe chst 33258
365
465
FITC
490
520
Acridine O range 4 9 0
590
Acridine Ye llow
470
550
C Y3
552
565
TRITC
541
572
Propidium Iodide 5 3 0
转变为高能状态，再回到低能状态时释放出 的光。
即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
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荧光的性质
保持固有的荧光特性
n荧光波长＞激发波长
n荧光强度极小于激发光的强度
n有不同程度的衰减 n荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效 率
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暗场聚光镜
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汞灯箱
激发滤色镜
透射荧光显微镜原理
目镜
透射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
物镜
暗场聚光镜
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部分。 在灯室上有调节 灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的
凹面反射镜，前面安装有集光透镜。 由于超高压汞灯压力很高，紫外线强烈，因此灯泡必须置灯室中方可
点燃，以免伤害眼睛和发生爆炸时造成操作。
Page 18
二、滤色镜系统 滤色镜按用途或功能，主要分为两类：
1、激发滤色镜（exciter filter） 对于光源发出的混合光，选择透过能使标本产生荧光的特定波长的光，
线以及没有被选择透过的荧光，以防伤害眼睛。 阻挡滤色镜的选用，应视荧光染料的荧光光谱而定，要能够最大限度的
透过所需荧光并阻断短波光以及不需要波长的荧光。
Page 20
二、滤色镜系统
滤镜一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后面字母代表玻璃 ，数字代表型号特点。
如德国产品（Schott）BG12，就是种蓝色玻璃，B是蓝色的第一个字母 ，G是玻璃的第一个字母；
汞灯能以最小的表面发出最大数量的紫外光和蓝光，且光亮度大，光度稳 定。它是用石英玻璃制作，中间呈球形，有两个钨电极，内充一定数量的汞和少量 氩氖混合气体。
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一、光源
工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水 银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15min。
长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。
Page 5
透射荧光显微镜的构造 吸收滤色镜 暗场聚光镜
汞灯箱
激发滤色镜
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透射荧光显微镜原理 目镜
透射荧光显微镜原理
物镜
吸收滤色镜 暗场聚光镜
激发滤色镜
汞灯
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反射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
分色镜 物镜 标本
汞灯
次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。 因此，使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中其光效是逐渐降低
的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。 点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要
等1W或200W）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个
超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发 射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质。
超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工 作环境温度不宜太高。
Page 16
一、光源 200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h，开动一
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二、滤色镜系统 一个滤光镜系统（即一个滤光块）由激发滤色镜、二向色镜、阻挡滤色镜
（三部分组成。 通过以上激发滤光片、二向色镜、阻挡滤光片的相应组合，可以形成多种
不同的激发方法，如紫外（UV）、紫（V） 、兰（B）和绿（G）等（这些名称 是以激发光主波长的颜色而定的）。
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什么是荧光 ? 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能
状态时释放出的光。 即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
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荧光的性质 保持固有的荧光特性 n荧光波长＞激发波长 n荧光强度极小于激发光的强度 n有不同程度的衰减 n荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率
细胞生物学实验
任课教师：齐云峰
1
实验二 荧光显微镜的使用
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实验目的 掌握荧光显微镜的结构、原理及其使用方法。
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实验用品
片。
荧光显微镜及荧光装置附件。人口腔上皮细胞装片，植物茎部组织装
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实验原理 荧光显微镜是一种较为常用的光学显微镜。它是由光源、滤色镜系统和
光学系统等主要部件组成。 其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波
激发滤色镜
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实验原理 某些物质经波长较短的光照射后，分子被激活,吸收能量后呈激发态。 其能量部分转化为热能或用于光化学反应外，相当一部分则以波长较
长的光能形式辐射出来，这种波长长于激发光的可见光称为荧光。 荧光显微镜是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜
系统放大以观察标本的荧光图像。
次生荧光：有些生物组织经紫外线照射后，并不能发出荧光，但是当它 吸收荧光染料后也可以产生荧光，称为次生荧光（或间接荧光）。如吖啶橙， DAPI均可检测细胞内的核酸。
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荧光显微镜的基本结构组成 一、光源
由于标本发出的荧光和激发光相比，是非常微弱的，因此荧光显微镜的光源强 度必须很高，所以对于荧光显微镜的光源我们通常采用高压汞灯。
我国产品的名称已统一用拼音字母表示，如相当于BG12的蓝色滤镜名 为QB24，Q是青色（蓝色）拼音的第一个字母，B是玻璃拼音的第一个字母。
不过有的滤镜也可以透光分界波长命名，如K530，就是表示阻挡波长 530nm以下的光而透过530nm以上的光。还有的厂家的滤镜完全以数字命名，如 美国Corning厂的NO.5-58，即相当于BG12。
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荧光光源的作用 荧光光源不是作为照明的，而是作为荧光色素产生荧光的激发光。
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实验原理
荧光有两种类型，一种是标本自身的原有荧光（自发荧光），另一种是 利用荧光色素和细胞的特定部分反应所产生的荧光（次生荧光）。
自发荧光：在生物的某些组织中，经紫外线照射后能直接发射出荧光的 称为自发荧光（或直接荧光）。如植物组织中的叶绿素，经紫外线照射后，即可 发出红色荧光。
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二、滤色镜系统 3、二向色镜（DM） 二向色镜位于汞灯激发滤色镜构成的平行光轴与目镜和物镜构成的竖直
光轴的两轴垂直相交处,斜向安装于光路之中。与照明光路成45°角，承担色光的分 流作用。
二向色镜对激发光波长的光（即透过激发滤光片的光），有很高的反射率 。
而对由标本发出的荧光波长区的光，则有很高的透射率，即二色向镜起着 反射激发光和透过荧光的重要作用。
同时阻挡对激发荧光无关的光。 荧光染料均有一定的吸收光谱（激发峰值），利用滤色镜对光线选择吸
收的能力，选用其透射光谱，恰为荧光染料的最大吸收光谱（激发峰值）的激发 滤色镜，以便从汞灯发出的广谱光波中，选择透过最宜波段的光线供用。
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二、滤色镜系统 2、阻挡滤色镜（barrier filter） 阻挡滤色镜是用来阻挡掉没有被标本吸收的激发光和某些波长较短的光
凹面反射镜，前面安装有集光透镜。 由于超高压汞灯压力很高，紫外线强烈，因此灯泡必须置灯室中方可
点燃，以免伤害眼睛和发生爆炸时造成操作。
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二、滤色镜系统 滤色镜按用途或功能，主要分为两类：
1、激发滤色镜（exciter filter） 对于光源发出的混合光，选择透过能使标本产生荧光的特定波长的光，
线以及没有被选择透过的荧光，以防伤害眼睛。 阻挡滤色镜的选用，应视荧光染料的荧光光谱而定，要能够最大限度的
透过所需荧光并阻断短波光以及不需要波长的荧光。
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二、滤色镜系统
滤镜一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后面字母代表玻璃 ，数字代表型号特点。
如德国产品（Schott）BG12，就是种蓝色玻璃，B是蓝色的第一个字母 ，G是玻璃的第一个字母；
汞灯能以最小的表面发出最大数量的紫外光和蓝光，且光亮度大，光度稳 定。它是用石英玻璃制作，中间呈球形，有两个钨电极，内充一定数量的汞和少量 氩氖混合气体。
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一、光源
工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水 银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15min。
长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。
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透射荧光显微镜的构造 吸收滤色镜 暗场聚光镜
汞灯箱
激发滤色镜
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透射荧光显微镜原理 目镜
透射荧光显微镜原理
物镜
吸收滤色镜 暗场聚光镜
激发滤色镜
汞灯
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反射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
分色镜 物镜 标本
汞灯
次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。 因此，使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中其光效是逐渐降低
的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。 点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要
等1W或200W）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个
超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发 射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质。
超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工 作环境温度不宜太高。
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一、光源 200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h，开动一
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二、滤色镜系统 一个滤光镜系统（即一个滤光块）由激发滤色镜、二向色镜、阻挡滤色镜
（三部分组成。 通过以上激发滤光片、二向色镜、阻挡滤光片的相应组合，可以形成多种
不同的激发方法，如紫外（UV）、紫（V） 、兰（B）和绿（G）等（这些名称 是以激发光主波长的颜色而定的）。
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什么是荧光 ? 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能
状态时释放出的光。 即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
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荧光的性质 保持固有的荧光特性 n荧光波长＞激发波长 n荧光强度极小于激发光的强度 n有不同程度的衰减 n荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率
细胞生物学实验
任课教师：齐云峰
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实验二 荧光显微镜的使用
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实验目的 掌握荧光显微镜的结构、原理及其使用方法。
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实验用品
片。
荧光显微镜及荧光装置附件。人口腔上皮细胞装片，植物茎部组织装
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实验原理 荧光显微镜是一种较为常用的光学显微镜。它是由光源、滤色镜系统和
光学系统等主要部件组成。 其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波
激发滤色镜
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实验原理 某些物质经波长较短的光照射后，分子被激活,吸收能量后呈激发态。 其能量部分转化为热能或用于光化学反应外，相当一部分则以波长较
长的光能形式辐射出来，这种波长长于激发光的可见光称为荧光。 荧光显微镜是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜
系统放大以观察标本的荧光图像。
次生荧光：有些生物组织经紫外线照射后，并不能发出荧光，但是当它 吸收荧光染料后也可以产生荧光，称为次生荧光（或间接荧光）。如吖啶橙， DAPI均可检测细胞内的核酸。
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荧光显微镜的基本结构组成 一、光源
由于标本发出的荧光和激发光相比，是非常微弱的，因此荧光显微镜的光源强 度必须很高，所以对于荧光显微镜的光源我们通常采用高压汞灯。
我国产品的名称已统一用拼音字母表示，如相当于BG12的蓝色滤镜名 为QB24，Q是青色（蓝色）拼音的第一个字母，B是玻璃拼音的第一个字母。
不过有的滤镜也可以透光分界波长命名，如K530，就是表示阻挡波长 530nm以下的光而透过530nm以上的光。还有的厂家的滤镜完全以数字命名，如 美国Corning厂的NO.5-58，即相当于BG12。
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荧光光源的作用 荧光光源不是作为照明的，而是作为荧光色素产生荧光的激发光。
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实验原理
荧光有两种类型，一种是标本自身的原有荧光（自发荧光），另一种是 利用荧光色素和细胞的特定部分反应所产生的荧光（次生荧光）。
自发荧光：在生物的某些组织中，经紫外线照射后能直接发射出荧光的 称为自发荧光（或直接荧光）。如植物组织中的叶绿素，经紫外线照射后，即可 发出红色荧光。
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二、滤色镜系统 3、二向色镜（DM） 二向色镜位于汞灯激发滤色镜构成的平行光轴与目镜和物镜构成的竖直
光轴的两轴垂直相交处,斜向安装于光路之中。与照明光路成45°角，承担色光的分 流作用。
二向色镜对激发光波长的光（即透过激发滤光片的光），有很高的反射率 。
而对由标本发出的荧光波长区的光，则有很高的透射率，即二色向镜起着 反射激发光和透过荧光的重要作用。
同时阻挡对激发荧光无关的光。 荧光染料均有一定的吸收光谱（激发峰值），利用滤色镜对光线选择吸
收的能力，选用其透射光谱，恰为荧光染料的最大吸收光谱（激发峰值）的激发 滤色镜，以便从汞灯发出的广谱光波中，选择透过最宜波段的光线供用。
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二、滤色镜系统 2、阻挡滤色镜（barrier filter） 阻挡滤色镜是用来阻挡掉没有被标本吸收的激发光和某些波长较短的光