DNA的酶切与连接
DNA体外酶切连接
3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质
修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键 5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G … 3’
3‘ … C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C … 5’ P OH nick
1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 ℃反应 1 小时，
完全连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量
DNA连接酶
平头双链DNA片段的连接操作
从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的 连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连 接，因此后者反应速度要慢得多 提高平头末端连接效率的方法包括：
酶切效率1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小
时，完全 水解 1 mg 标准DNA所需的酶量
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：
对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：
BamHI SmaI
5‘ …GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’ 5‘ …GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA…5’ 5‘ …GCTACATGGATCCC 3‘ …CGATGTACCTAGGG GGGTTCGCAT…3’ CCCAAGCGTA…5’
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质
修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键 nick
dna片段的连接,转化及酶切鉴定
dna片段的连接,转化及酶切鉴定
DNA片段的连接、转化和酶切鉴定是基因工程中常用的实验
技术。
下面是这些步骤的详细描述：
1. DNA片段的连接（Ligation）：将两个或多个DNA片段连
接在一起。
这通常使用DNA连接酶（ligase）来催化连接反应，其中DNA连接酶通过形成磷酸二酯键将DNA片段连接起来。
2. DNA转化（Transformation）：将连接好的DNA片段转化
进入宿主细胞。
转化是通过加入特定的化学物质（例如钙离子和热激冷冻）或基因枪等方法，使细胞质膜对DNA片段通透，使其能够进入细胞内。
3. 酶切（Enzyme Digestion）：使用限制性内切酶（restriction enzyme）对转化后的DNA进行酶切，以确认连接是否成功。
限制性内切酶具有特异性，能够识别特定的DNA序列并在其
附近切割DNA链。
4. 鉴定（Identification）：通过凝胶电泳（gel electrophoresis）等方法对酶切后的DNA进行分离和鉴定。
凝胶电泳是一种基
于DNA分子的大小和电荷的分离方法，可以将DNA分子按
照大小分开，并可根据标准样品和分子量标记DNA片段等进
行鉴定。
通过上述步骤，可以实现DNA片段的连接、转化和酶切鉴定，从而用于基因工程研究和应用中。
实验DNA酶切连接及电泳检测
1.粘性末端形成的氢键在低温下更稳定； 2. 连接反应时间长，低温下酶不容易失活
材料、试剂及器具
1、材料与试剂 连接反应： λDNA/EcoT14 I :由11条DNA片段组成：
19329、7743、6223bp、4254、3472、 2690、1882、1489、925、421、74 bp T4 DNA连接酶及其配套的 10×连接缓冲液 检测： 0.5×TBE电泳缓冲液 6×电泳载样缓冲液 、Goldview、琼脂糖
材料、试剂及器具
1、材料与试剂 酶切反应： 标准pUC19(2686bp) EcoRⅠ及其配套的酶切缓冲液
检测：
0.5×TBE电泳缓冲液 6×电泳载样缓冲液 、Goldview、琼脂糖
2 、器具： 水平式电泳装置 电泳仪,台式高速离心机 恒温水浴锅（用PCR仪代理） 微量移液枪 微波炉或电炉 紫外透射仪 照相机及其附件
(1)
实 验 原 理 – 连接
DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的 。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或 NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一 DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必 须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶 除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA 连接酶催化成磷酸二酯键。
实验结果分析
关于OD值分析
一40个ugO/mDl2单60n链m单DN位A相或当R于NA于50ug/ml 双链DNA 或 OD260/280: 1.8-2.0 DNA: 1.8 (RNA: 2.0) 比值<1.8：蛋白质污染 比值>2.0: RNA污染
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。
4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。
二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。
在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。
目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。
Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。
Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。
Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。
Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。
限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。
DNA连接反应的步骤及说明
DNA连接反应的步骤及说明1.DNA片段的准备：首先，需要准备待连接的DNA片段。
这些片段可以通过PCR扩增、酶切、化学合成等方法获得。
通常情况下，需要使用DNA电泳等方法对所得片段进行纯化。
2.酶切：对于需要连接的DNA片段，通常需要进行酶切。
酶切是通过特定的限制性内切酶作用于DNA分子的特定位点将其切割为片段。
酶切的目的是使得两个相互连接的DNA片段具有互补的黏性末端，为连接反应提供条件。
3.连接反应的混合：将需要连接的DNA片段以及连接酶和相应的缓冲液混合。
连接酶通常是DNA连接酶，可以将DNA分子连接在一起。
4. 连接反应的条件：连接反应通常在适当的反应缓冲液中进行。
连接酶对于温度和pH值都有特定的要求，因此在连接反应中必须保持恰当的温度和缓冲液pH值。
例如，常用的DNA连接酶T4 DNA Ligase在适宜的pH值和温度下具有最佳的酶活性。
5.连接反应的时间：连接反应的时间取决于所使用的连接酶的速度以及连接反应的目的。
一般情况下，连接反应通常需要在4°C至37°C下进行数分钟至几小时。
6.连接反应的酶切：连接反应结束后，需要用限制性内切酶对连接的DNA分子进行酶切。
这一步是为了去除未连接的DNA分子以及连接酶，以提高连接反应的准确性。
7.DNA连接酶的去除：连接酶在连接反应结束后需要被去除，一般常用热灭活法或化学去除法。
热灭活法是将连接反应体系加热至70°C一段时间（如10分钟），高温可使连接酶失活。
化学去除法是通过柱等手段，利用一些物质能够与连接酶结合并使其失活的性质，达到去除目的。
8.电泳鉴定：连接反应后的DNA片段可以通过电泳进行鉴定。
通过与大小标准品进行比较，可以确定连接反应是否成功。
连接反应成功后，DNA片段的大小会发生改变，从而可以通过电泳图谱来观察。
DNA连接反应是分子生物学中重要的技术，可以实现基因克隆、构建重组融合表达载体等应用。
连接反应的成功与否对后续实验结果的可靠性至关重要，因此在每一步操作中需仔细操作，确保反应条件的正确性，以及对连接酶的适当去除等。
酶切和连接
双酶切：载体大小为3000bp左右，在SfiⅠ和BssHⅡ位点之间有370bp左右的片段存在。
我想通过SfiⅠ和BssHⅡ双酶切，将370bp的片段切掉，然后装入不同的片段。
我的酶切体系如下：质粒（载体＋老片段）1ul（约100ng）(NEBlack Eye SfiⅠ1ul(NEBlack Eye BssHⅡ1ul10×buf 2.2ul100×BSA 0.2ul水14.8ul总体积20ul50度，2小时。
切出了370bp左右的片段，回收载体。
然后取回收载体的1ul自连，铺平板，但是长出了300多个克隆。
证明酶切不完全，怀疑有大量载体只是单酶切。
50度3小时我试过，但是质粒有降解。
酶量应该说是过量的。
请问有什么办法可以酶切完全？粘性连接（一）外源DNA和质粒载体的连接反应外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。
如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。
但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。
在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。
相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和Ｔ４噬菌体DNA连接酶。
实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。
这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。
ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。
不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。
现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。
在瓜作用的底物。
如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。
DNA的酶切与连接1.实验目的了解DNA限制性内切酶和连接的作用...
DNA的酶切与连接1. 实验目的了解DNA限制性内切酶和连接的作用原理，学习和掌握利用限制性内切酶进行DNA 消化和片段的方法和技术。
2. 实验原理DNA限制性内切酶和连接酶是遗传工程中实现DNA的切割和重组的重要工具酶，也是基因工程技术赖以生存的基础。
1970年Smith H·O等从流感病毒中提取了第一个限制性内切酶Hind II，其作用于外源DNA后，切割产生平末端。
人们经过研究发现，限制性内切酶可以识别双链DNA分子上的特异序列，通常识别区具有回纹结构，并使两个特定核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
目前已经从微生物中发现了200多种限制性内切酶，其中大部分可以切割DNA形成粘性末端。
如EcoR I，可以识别6个碱基的序列：▼5’ ――――――GA TTC――――――3’3’ ――――――CTTAAG――――――5’▲切割后形成的片段5’――――――G AA TTC――――――3’3’――――――CTTAA G――――――５’当限制性内切酶作用于DNA时可以形成的酶切片段数为：片段数目= 切点数+1 （线状DNA）片段数目= 切点数（环状DNA）切点出现的频率为1/4s（S为识别顺序所含的碱基数目）DNA连接酶则可以将切开的DNA片段连接起来，此时需要接口两端具有磷酸根。
对粘性末端的单链可以进行点接，对于平末端来说也可以进行连接，但是需要较多的酶。
在基因工程中，可以利用同一种限制性内切酶分别切割目标DNA和运载体，然后利用T4DNA 连接酶将目标序列整合到运载体中，使DNA中的3’-OH与5’-P生成磷酸二酯键。
3. 实验用具及材料电泳仪、恒温水浴锅、紫外检测仪、微量移液器、Eppendorf离心管10×酶切反应缓冲液、T4DNA连接酶缓冲液、溴酚蓝指示液、EB电泳缓冲液、PBR322质粒DNA、pXZ6质粒DNA，λphage DNA、DNA Marker EcoRI Hind III。
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定摘要：以质粒pUC19作为载体、λDNA作为外源片段来源，限制性核酸内切酶Hin dⅢ分别对其进行单酶切，产生相同的黏性末端后用T4 DNA连接酶连接从而构建重组质粒，用CaCl2制备E.coli感受态细胞，并用热激法进行重组质粒的转化，培养并用α-互补筛选法进行筛选，最后用试剂盒提取质粒DNA进行检测。
根据在实验过程中所遇到的问题及对结果的分析，探讨关键步骤及影响转化/重组效率的相关因子，并说明实验过程中应当注意的问题。
关键词：DNA酶切连接感受态细胞转化重组子的筛选与鉴定引言：实验目的为掌握限制性核酸内切酶的分类、特性与作用原理以及对DNA进行酶切的实验技术，掌握DNA连接酶的作用原理以及利用T4 DNA连接酶构建重组DNA分子的实验技术，掌握利用CaCl2制备E.coli感受态细胞的原理和方法，掌握α-互补筛选法的原理，学习用试剂盒提取质粒DNA的方法，复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法，掌握利用琼脂糖凝胶电泳筛选重组质粒。
限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。
主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制（限制修饰系统）。
限制性核酸内切酶分为三类，Ⅰ型与Ⅲ型：识别位点与切割位点不一致，故同一种酶切产生的片段长度不同；Ⅱ型：固定的识别序列处切割，故每次都产生完全相同的片段。
影响限制性内切酶活性的因素有：DNA纯度，DNA甲基化程度，反应温度，DNA 的分子结构，缓冲液。
DNA连接酶在体内合成DNA某条链上丢失的磷酸二酯键，体外连接反应中，DNA连接酶则需要合成两个磷酸二酯键。
T4-DNA连接酶不需要PEG等就能进行平端的连接，所以实验中绝大多数情况下使用T4-DNA连接酶。
影响DNA连接的因素有：温度、时间、酶量、缓冲体系、DNA末端的性质及浓度、DNA片段的大小等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
材料、试剂及器具
1、材料与试剂 酶切反应： 标准pUC19(2686bp) EcoRⅠ及其配套的酶切缓冲液 连接反应： λDNA/EcoT14 I :由11条DNA片段组成：
19329、7743、6223bp、4254、3472、 2690、1882、1489、925、421、74 bp T4 DNA连接酶及其配套的 10×连接缓冲液 检测： 0.5×TBE电泳缓冲液 6×电泳载样缓冲液 、Goldview、琼脂糖
用量（μl） 6.0 10.0 2.0 2.0 20
（三）质粒及质粒酶切样品和DNA连接样品的电泳检测
1、琼脂糖凝胶的制备：制备2%琼脂糖凝胶（0.4g/20ml）。 （注：2 人一组制胶板一块，8个加样孔）
2、加样：
（1）酶切样品的检测
酶切阴性对照：pUC19标样 10μl + 10X的loading buffer 2μl 酶切样品：标准pUC19酶切样品 10μl+ 10X的loading buffer 2μl
通过DNA重组技术构建DNA重组子
利用限制性核酸内切酶切割DNA和利用DNA连接酶 连接DNA是DNA重组过程中的关键步骤之一。成功的 酶切和有效的连接为后续的外源基因进入宿主细胞进行 表达提供了有效的实验材料。
酶切
连接
实 验 原 理 – 酶切
限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性 酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上， 并切割双链DNA。
主要特点： 识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个 或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸 以及7个、8个、9个、10个和11个核苷 酸的。在分子克隆实验中使用最普遍的 是那些识别4个或6个碱基对的限制性内 切酶。II 型限制性内切酶的识别顺序是 一个回文对称顺序，即有一个中心对称 轴，从这个轴朝两个方向“读”都完全 相同。这种酶的切割可以有两种方式： 粘性末端和平头末端。
（二）DNA片段的连接(注：以2人为一组）
取200 μl的离心管按下表加入试剂。
↓ 混匀后点动离心，将溶液甩至管底
↓ 置于已调好温度为12℃-14℃PCR仪中
↓ 保温2h后取出
↓ 电泳检测
样品代号 H I f T
成分 ddH2O λDNA/EcoT14 I片段 连接缓冲液 T4DNA连接酶 总体积
根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修 饰酶活性，可分为Ⅰ型、 Ⅱ型和Ⅲ型三类。DNA重组技 术中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是带粘性末端或 平末端的线性DNA。
II型限制性内切酶： 由两种酶分子组成的复合体，一种具有 限制性内切酶功能，另一种为独立的甲 基化酶功能，它们具有识别同一序列的 能力，但却发挥不同的作用。
实 验 原 理 – 连接
核酸片段可以通过连接酶的作用 连接起来而获得重组分子。
DNA连接酶催化双链DNA分子中 相邻碱基的5’- P末端与3’-OH 间形成3’,5’-磷酸二酯键。
一个DNA片段的5’-P末端与另一 个3’-OH末端相互靠近时，在 DNA连接酶的作用下，有Mg2+, ATP存在的缓冲系统中可以被 连接起来而形成重组分子。
实验五 DNA的酶切与连接
E-mail: huanglh@ 本节课讲义请到如下网址下载： /blog/insecthuang.htm
实验目的
基本原理： 1、掌握限制性内切酶的特性和酶切的目的和原理 2、掌握DNA连接酶的一般性质和作用机制 基本操作： 1、掌握限制性内切酶酶解体系的建立及酶切样品的检测 2、掌握DNA连接体系的建立以及连接样品的检测
实验预期结果
质粒及酶切样品电泳预期结果
1
23
线型 DNA
质粒不同构型的电泳行为
从左至右：
1. λ/EcoT14 I DNA Marker 2. pUC19质粒 3. pUC19质粒酶切样品
超螺旋 DNA
DNA片段的连接样品电泳预期结果
1： λDNA/Eco14Ⅰ酶切片段 2-3：λDNA/Eco14Ⅰ 酶切片段 的连接 产物
思考题
1. 用提取的一种质粒作电泳分析，可能会出现一条或二条 或三条带型，该如何判断它们的构型？
2. 影响限制性内切酶活性的因素有哪些？ 3. DNA完全酶切所具备的条件？ 4. 如果一种DNA酶解液在电泳后发现DNA未被切动，你认为
是什么原因？ 5. T4DNA连接酶的最适反应温度为３７℃，为什么实验中
DNA连接酶作用机制
常用的DNA连接酶是T4 DNA连接酶，其作用底 物是双链的DNA分子或RNA：DNA杂交分子， 可以连接粘性末端、平末端。
T4 DNA连接酶的活性用Weiss单位表示。
1 Weiss单位是指在37℃下20min内催化1nmol 32P从焦磷酸根置换到 [γ,β-32P] ATP所 需的酶量。
2 、器具： 水平式电泳装置 电泳仪,台式高速离心机 恒温水浴锅（用PCR仪代理） 微量移液枪 微波炉或电炉 紫外透射仪 照相机及其附件
实验步骤
（一）质粒DNA酶切(注：以2人为一组）
在200μl 的薄壁离心管中，按照下表加入试剂（单位：μl）
↓ 混匀；点动离心将反应液甩至管底。37℃(PCR仪)保温2h进行酶切反应。
↓ 反应结束后，加入2μl 10×loading buffer 钝化酶活性；
（或：65℃，保温20min使酶失活） ↓
电泳检测
样品代号 H P b E
成份 无菌水(μl)
质粒(μl) 酶切缓冲液(μl)
EcoRI酶(μl) Total(μl)
反应1（标准pUC19) 2.5 10 1.5 1.0 15
实验报告
按规范的实验报告格式完成本节内容的实 验报告，要求记录电泳图谱，说明带型含义并 与标准质粒pUC19(浓度：25ng/ μl ）和 λDNA/Eco14ⅠDNA Marker比较。如未能得到预 期结果，请分析失败原因。
本节回顾
z 酶切的原理和实验体系的建立 z 连接反应的原理和实验体系的建立 z 质粒DNA三种构型的电泳速率差异
（2）连接样品检测：
λ/EcoT14 I 样品 10μl（兼作 DNA Marker）+ 10X的loading buffer 2μl
DNA连接样品：10 μl + 10X的loading buffer 2μl
3、恒压电泳: 130V 电泳至溴酚蓝离凝胶外端1-2cm处，大约30分钟 4、观察:紫外透射仪下观察电泳结果，并拍照记录。
采用１２～14℃？（1.粘性末端形成的氢键在低温下更 稳定；2. 连接反应时间长，低温下酶不容易失活） 6. 如何确定连接反应中各成分的用量（优化连接反应条 件）？（参考实验指导P.169）
如: EcoRI的识别顺序为：
5’…… G A A T T C ……3’ 3’…….C T T A A G …单位表示，1个酶单位 （1 Unit）指的是在指定缓冲液中，37℃下反应60min,完 全酶切1μg的纯DNA所用的酶量。
影响酶切的因素：在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液 中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增 加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。但应 该注意的是，过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异 性的酶切(星号活性)。图:构建DNA重组子