病毒感染的实验室诊断PPT课件
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新冠病毒实验室检测+课件
抗体检测是通过检测人体内是否产生针对病毒的抗体来判断是否感染过病毒。抗体检测通常在病毒感染后2-3周内出现阳性结果，可以用于回顾性诊断和流行病学调查。抗体检测可以通过采集静脉血液标本进行检测。优缺点：抗体检测的优点是操作简便、检测时间短、样本易获取。但是抗体检测不能用于早期感染的诊断，因为抗体产生需要一定的时间。此外，抗体检测也有一定的假阳性率和假阴性率，需要结合临床症状和其他检查结果进行综合判断。应用场景：抗体检测主要用于确诊病例的回顾性诊断、流行病学调查和人群免疫水平的评估等场景。
新冠病毒实验室检测 课件
汇报人：
202X-12-27
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目录
新冠病毒概述新冠病毒实验室检测方法新冠病毒检测的流程与注意事项新冠病毒检测的挑战与未来展望新冠病毒检测的伦理与法规问题
01
新冠病毒概述
2019年12月，中国武汉出现不明原因肺炎病例。经过后续调查，科学家们从病例样本中检测到了新型冠状病毒。
发现
世界卫生组织将其命名为“严重急性呼吸综合征冠状病毒2”，简称新冠病毒。
命名
新冠病毒属于冠状病毒科，其形态为圆形或椭圆形，表面有凸起的冠状结构。
形态
基因组
宿主范围
新冠病毒基因组为单链RNA，长度约为30,000个核苷酸。
新冠病毒主要感染人类，但也有可能感染其他哺乳动物和鸟类。
03
02
01
人对人传播
假阳性与假阴性问题
由于检测方法的敏感性和特异性限制，可能会出现误报或漏报的情况。
03
降低成本
通过规模化生产和技术创新，降低检测试剂的成本，使其更易于在贫困地区和国家推广应用。
01
研发更快速、准确的检测试剂
通过改进技术手段和优化试剂配方，提高检测的敏感性和特异性，缩短检测时间。
(完整版)感染性疾病实验室诊断
1.尽快送检
对环境敏感的细菌应保温立即送检,其他所有采集后最好在2小时内送 检,不能及时送检,应注意保存
2. 必须注意安全防护,切勿污染环境 3.厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，有时可直接
用抽取标本的注射器运送
二、 检验方法
查病原体：形态与结构检查 分离培养和鉴定
检测病原体成分（抗原和核酸） 检测患者血清中特异性抗体 代谢产物 （生化试验） 毒素：外毒素、内毒素
SARS冠状病毒 新甲型H1N1流感病毒 高致病性禽流感病毒
(二）按疾病特征分类 1. 病原体被清除 2. 隐性感染(covert infection)，亦称亚临床感染
一般占人群的90％或以上 3. 显性感染(overt infection)又称为临床感染
发病快慢和病程长短：急性感染和慢性感染 感染部位及性质：局部感染和全身感染 全身感染： ①菌血症 ②败血症 ③毒血症 ④脓毒血症
革兰阳性
革兰阴性
抗酸染色
培养在McCoy细胞的沙眼衣原体 吉姆萨染 色的McCoy细胞，含大衣原体包涵体，使 部分细胞核不清楚。（吉姆萨染色,放大
1000倍）
狂犬病毒可于细胞浆中 可形成嗜酸性包涵体
新生隐球菌 墨汁负染
假丝酵母菌（白色念珠菌）
革兰染色
2.不染色标本
1) 检查生活状态下细菌的动力及运动状况 2） 螺旋体由于不易着色并有形态特征
对某些病原菌作出初步鉴定，如霍乱弧菌
常用方法 压片法(压滴法)或悬滴法 暗视野显微镜或相差显微镜检查
体癣皮屑可见关节孢子
3. 直接电镜检测EM 免疫电镜技术IEM
HAV形态电镜图 粪便标本负染 X200000
HAV particles found in fecal extracts by immunoelectron microscopy
对环境敏感的细菌应保温立即送检,其他所有采集后最好在2小时内送 检,不能及时送检,应注意保存
2. 必须注意安全防护,切勿污染环境 3.厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，有时可直接
用抽取标本的注射器运送
二、 检验方法
查病原体：形态与结构检查 分离培养和鉴定
检测病原体成分（抗原和核酸） 检测患者血清中特异性抗体 代谢产物 （生化试验） 毒素：外毒素、内毒素
SARS冠状病毒 新甲型H1N1流感病毒 高致病性禽流感病毒
(二）按疾病特征分类 1. 病原体被清除 2. 隐性感染(covert infection)，亦称亚临床感染
一般占人群的90％或以上 3. 显性感染(overt infection)又称为临床感染
发病快慢和病程长短：急性感染和慢性感染 感染部位及性质：局部感染和全身感染 全身感染： ①菌血症 ②败血症 ③毒血症 ④脓毒血症
革兰阳性
革兰阴性
抗酸染色
培养在McCoy细胞的沙眼衣原体 吉姆萨染 色的McCoy细胞，含大衣原体包涵体，使 部分细胞核不清楚。（吉姆萨染色,放大
1000倍）
狂犬病毒可于细胞浆中 可形成嗜酸性包涵体
新生隐球菌 墨汁负染
假丝酵母菌（白色念珠菌）
革兰染色
2.不染色标本
1) 检查生活状态下细菌的动力及运动状况 2） 螺旋体由于不易着色并有形态特征
对某些病原菌作出初步鉴定，如霍乱弧菌
常用方法 压片法(压滴法)或悬滴法 暗视野显微镜或相差显微镜检查
体癣皮屑可见关节孢子
3. 直接电镜检测EM 免疫电镜技术IEM
HAV形态电镜图 粪便标本负染 X200000
HAV particles found in fecal extracts by immunoelectron microscopy
病毒病的常规实验室诊断
胞现象也可被特异性抗血清所抑制，故在病毒鉴定，特别是对
某些不产生细胞病变的病毒，常用红细胞吸附和吸附抑制试验 进行快速鉴定。
2.4 补体结合试验（CFT）
原理：CFT是根据任何抗原抗体复合物可激活、固定补体的特 性，用一定量的补体与致敏红细胞来检测抗原、抗体间有无特 异性结合的一类实验。 参与本实验的五种成分分为两个系统 ①待检系统：已知抗原（或抗体）和待检 抗体（或抗原细胞代谢的测定
病毒间的干扰现象
抗原的测定
电子显微镜观察
1.5 病毒感染力的测定—半数细胞培养物感染量 （TCID50)
Reed-Muench
内插法
Karber法
细胞病变孔：50%以上细胞发生病变才可算为细胞病变孔。
病毒种类 狂犬病病毒 接种途径 卵黄囊 ++ 绒毛尿囊膜 ++ 尿囊腔 养膜腔 脑内 +++ 病变 特征 鸡胚死亡 备注
流感病毒
新城疫病毒 痘病毒 蓝舍病病毒 传支 法氏囊 鹅细小
++++
++++ +++ +++ +++ ++ +++++ ++ ++++ ++++
2.9 单扩溶血试验
是在琼脂单扩散基础上发展起来的，又称为被动溶血技术，主要用于流感 病毒血凝素和神经氨酸酶抗体的测定。 吸附在红细胞表面上的抗原与同种抗体结合，再加上补体的作用，就会使 红细胞溶血，由于糠油抗体血清的稀释度与溶血圈直径或面积的大小成直 线关系，所以可对血清抗体进行定量测定。
动物微生物--病毒感染实验诊断
病毒抵抗力弱，室温中容易灭活， 用于分离培养的标本要尽快送检， 4℃下数ｈ或-70℃。 冻存液中加入甘油或二甲基亚砜 (DMSO)等作保护。
病毒传送培养基以Hanks液为基础加 灭活的小牛血清。为抑制细菌生长加 青霉素100U／ml和链霉素100μg／ml， 为了抑制真菌的生长加入2．5μg／ml 二性霉素B或40μg／ml制霉菌素。
五、病毒检验的结果评价
通过实验手段，从标本中获得有 关病毒感染的证据，从而确定病毒 感染和临床疾病之间的因果关系， 是病毒实验诊断的目标。
通过分离和鉴定获得致病性病毒， 发现病毒感染的特异征象，如机 体内产生特异性抗体,急性期和恢 复期血清中相应的特异性抗体有4 倍以上的升高，细胞内包涵体的形 成等,就可得出病原学诊断。
二、病毒抗原检测
病毒抗原是病毒特异性的标志， 通过免疫学技术检测标本中特 异性抗原存在，可以早期诊断 病毒感染。
1．免疫荧光技术 适合于型别少， 细胞培养难以成功的病毒，如流 感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、 巨细胞病毒、腺病毒等。肝活检 组织中的肝炎病毒、神经组织中 的单纯疱疹病毒、脑组织中的狂 犬病毒或其他脱落细胞和活检组 织中的病毒抗原检测。
必须通过全面了解其特性才能 得到鉴定。 1.根据临床特点，流行病学资 料，标本来源，大致了解病 毒的一些特性，有助于确认 病毒的种类。
2.动物感染范围及特点 病毒感 染动物的范围、发病的潜伏期。 3.细胞培养特点。 综合上述资料作出鉴定。
病毒鉴定的方法
1.细胞培养的结果观察
病毒增殖后导致细胞发生:①细胞病 变效应(CPE)。细胞肿大，变圆堆积 成葡萄状，细胞溶解出现空斑，细胞 融合形成多核巨细胞，胞浆内或核内 出现嗜酸性或嗜碱性包涵体等；
第一节标本采集与运送
病毒传送培养基以Hanks液为基础加 灭活的小牛血清。为抑制细菌生长加 青霉素100U／ml和链霉素100μg／ml， 为了抑制真菌的生长加入2．5μg／ml 二性霉素B或40μg／ml制霉菌素。
五、病毒检验的结果评价
通过实验手段，从标本中获得有 关病毒感染的证据，从而确定病毒 感染和临床疾病之间的因果关系， 是病毒实验诊断的目标。
通过分离和鉴定获得致病性病毒， 发现病毒感染的特异征象，如机 体内产生特异性抗体,急性期和恢 复期血清中相应的特异性抗体有4 倍以上的升高，细胞内包涵体的形 成等,就可得出病原学诊断。
二、病毒抗原检测
病毒抗原是病毒特异性的标志， 通过免疫学技术检测标本中特 异性抗原存在，可以早期诊断 病毒感染。
1．免疫荧光技术 适合于型别少， 细胞培养难以成功的病毒，如流 感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、 巨细胞病毒、腺病毒等。肝活检 组织中的肝炎病毒、神经组织中 的单纯疱疹病毒、脑组织中的狂 犬病毒或其他脱落细胞和活检组 织中的病毒抗原检测。
必须通过全面了解其特性才能 得到鉴定。 1.根据临床特点，流行病学资 料，标本来源，大致了解病 毒的一些特性，有助于确认 病毒的种类。
2.动物感染范围及特点 病毒感 染动物的范围、发病的潜伏期。 3.细胞培养特点。 综合上述资料作出鉴定。
病毒鉴定的方法
1.细胞培养的结果观察
病毒增殖后导致细胞发生:①细胞病 变效应(CPE)。细胞肿大，变圆堆积 成葡萄状，细胞溶解出现空斑，细胞 融合形成多核巨细胞，胞浆内或核内 出现嗜酸性或嗜碱性包涵体等；
第一节标本采集与运送
EB病毒感染的实验室诊断方法及合理运用PPT课件
3
EB病毒持续感染示意图
• 原发感染后， EBV 在人体B淋巴细胞建 立潜伏感染，只表 达潜伏抗原，受感 染者成为终生病毒 携带者
• EBV健康携带者咽 部不定时排毒
• 在机体免疫功能下 降和某些因素触发 下 ， 潜 伏 的 EBV 可 以被再激活，引起 病毒复制及临床症 状
Rev. Med. Virol. 2008; 18: 305–319
在罕见的病例中抗CA 抗体(IgM)会持续阳 性
20-30% 的EBV新近感染 抗 EA抗体（IgG）阴 性
抗EBNA抗体(IgG)阴 性
14
实验室指标四：EBV病毒核酸检测
• Real-time PCR是目前最主要的监测EBV载量的方法，可以指导治 疗和判断疗效，如PTLD/EBV-HLH/CAEBV等
• 人群感染率高，终身潜伏感染， 具有感染-潜伏-活化的特性
• 肿瘤相关病毒，每年EBV相关 肿瘤死亡病例达15-20万
• 与很多疾病相关，几乎可引起 所有脏器和组织的相关疾病
• 细胞免疫非常重要
Khan G et al. Infectious Agents and Cancer, 2014, 9:38.
6
临床实践诊断EBV感染时需要回答的问题
• 是否感染EBV? • EBV感染的时相？ • 是否EBV活动性感染？ • 组织或器官中EBV感染的细胞定位如何？
7
EBV感染相关的实验室指标
• 血常规：淋巴细胞比例＞50%（学龄以上儿童）
• 嗜异凝集抗体 • 异型淋巴细胞
非特异 性指标
• EBV特异性抗体
• 荧光定量PCR检测EBV核酸 • EBERs原位杂交实验：EBV感染受累的组织学证据
特异性 指标
EB病毒持续感染示意图
• 原发感染后， EBV 在人体B淋巴细胞建 立潜伏感染，只表 达潜伏抗原，受感 染者成为终生病毒 携带者
• EBV健康携带者咽 部不定时排毒
• 在机体免疫功能下 降和某些因素触发 下 ， 潜 伏 的 EBV 可 以被再激活，引起 病毒复制及临床症 状
Rev. Med. Virol. 2008; 18: 305–319
在罕见的病例中抗CA 抗体(IgM)会持续阳 性
20-30% 的EBV新近感染 抗 EA抗体（IgG）阴 性
抗EBNA抗体(IgG)阴 性
14
实验室指标四：EBV病毒核酸检测
• Real-time PCR是目前最主要的监测EBV载量的方法，可以指导治 疗和判断疗效，如PTLD/EBV-HLH/CAEBV等
• 人群感染率高，终身潜伏感染， 具有感染-潜伏-活化的特性
• 肿瘤相关病毒，每年EBV相关 肿瘤死亡病例达15-20万
• 与很多疾病相关，几乎可引起 所有脏器和组织的相关疾病
• 细胞免疫非常重要
Khan G et al. Infectious Agents and Cancer, 2014, 9:38.
6
临床实践诊断EBV感染时需要回答的问题
• 是否感染EBV? • EBV感染的时相？ • 是否EBV活动性感染？ • 组织或器官中EBV感染的细胞定位如何？
7
EBV感染相关的实验室指标
• 血常规：淋巴细胞比例＞50%（学龄以上儿童）
• 嗜异凝集抗体 • 异型淋巴细胞
非特异 性指标
• EBV特异性抗体
• 荧光定量PCR检测EBV核酸 • EBERs原位杂交实验：EBV感染受累的组织学证据
特异性 指标
新冠病毒实验室检测ppt课件
用于病毒分离和核酸检测的标本应尽快进行检测， 能在24小时内检测的标本可置于4℃保存；24小时 内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存（如 无-70℃保存条件，则于-20℃冰箱暂存）。血清可 在4℃存放3天，-20℃以下可长期保存。应设立专 库或专柜单独保存标本。标本运送期间应避免反复 冻融。
标本采集后应尽快送往实验室，如果需要长途运输
重大疫情采样如果出现不合格样本，应该及时向上级汇报 实验检测进行中发现的无法检测的样本
分析无法检测原因； 判断排查是样本质量问题还是保存问题，如：样本降解、严重污染等 保留相应的书面证据 对样本做出妥当处置决定或找到弥补措施
及时通知采样者或被检测者标本无法检测，并说明理由 可能的情况下再次采集标本
十一：样本的保存和送检
病原微生物现场采集的样本
全血、血清 鼻咽分泌液、鼻咽拭子、痰液、唾液、鼻咽洗液 粪便、肛拭子 疱疹液 活检组织、尸检组织
一、 标本种类
咽拭子标本从咽部和扁桃体取分泌物样本。 鼻拭子标本是鼻道内鼻腭处分泌物的样本。 用以检测可能引起疾病的相关微生物。 注：拭子尖端可为是聚酯纤维、人造丝或尼龙绒。 不可使用棉签或海藻酸钙棉签或木柄材质，因为这 些材料中存在的残留物会抑制PCR分析。
九、尸检标本的采集
病人死亡后越早采集越好。 采集感染部位标本（如脑、肝、肺和肠等重 要组织），每一采集部位分别使用单独的消 毒器械。每种组织应多部位取材，每部位应 取2-3份约5-10g，分别置于装有相应培养基 的无菌容器中。
十、不合格样本处理
在采样日志上注明，写清楚不合格的原因，妥善处理
采集到的样品是非常珍贵的，尤其是疫情标本，不能够轻易拒绝或丢弃标 本，仍需要与采样人员明确说明后妥善保存
六、下呼吸道标本
标本采集后应尽快送往实验室，如果需要长途运输
重大疫情采样如果出现不合格样本，应该及时向上级汇报 实验检测进行中发现的无法检测的样本
分析无法检测原因； 判断排查是样本质量问题还是保存问题，如：样本降解、严重污染等 保留相应的书面证据 对样本做出妥当处置决定或找到弥补措施
及时通知采样者或被检测者标本无法检测，并说明理由 可能的情况下再次采集标本
十一：样本的保存和送检
病原微生物现场采集的样本
全血、血清 鼻咽分泌液、鼻咽拭子、痰液、唾液、鼻咽洗液 粪便、肛拭子 疱疹液 活检组织、尸检组织
一、 标本种类
咽拭子标本从咽部和扁桃体取分泌物样本。 鼻拭子标本是鼻道内鼻腭处分泌物的样本。 用以检测可能引起疾病的相关微生物。 注：拭子尖端可为是聚酯纤维、人造丝或尼龙绒。 不可使用棉签或海藻酸钙棉签或木柄材质，因为这 些材料中存在的残留物会抑制PCR分析。
九、尸检标本的采集
病人死亡后越早采集越好。 采集感染部位标本（如脑、肝、肺和肠等重 要组织），每一采集部位分别使用单独的消 毒器械。每种组织应多部位取材，每部位应 取2-3份约5-10g，分别置于装有相应培养基 的无菌容器中。
十、不合格样本处理
在采样日志上注明，写清楚不合格的原因，妥善处理
采集到的样品是非常珍贵的，尤其是疫情标本，不能够轻易拒绝或丢弃标 本，仍需要与采样人员明确说明后妥善保存
六、下呼吸道标本
病毒感染的实验诊断
本 • 对冷冻标本应避免反复冻融
2.保湿送检
• 50%甘油盐水保存送检 • 病毒转运培养基（virus transport medium ，VTM）
含0.5%明胶或牛血清白蛋白的Hank’s液
3.无菌送检
• 抑制细菌生长 100U/ml青霉素＋100μg/ml链霉素 • 抑制真菌生长 2.5μg/ml二性霉素B 或40 μg/ml制霉
细胞变圆、融合、肿胀、细胞空 泡、核浓缩、形成嗜酸性或嗜碱 性包涵体等。
某些病毒感染细胞后不出现CPE
3. 干扰现象（interference）
当两种不同的病毒同时或先后感染同一细胞时， 其中一种病毒可抑制另一种病毒的增殖，称为 病毒的干扰现象。
干扰现象也可被相应特异性抗体抑制，称为干 扰抑制现象
绒毛尿囊膜表现有痘病毒的特异性损伤
优点 鸡胚来源充足，操作简便，有多种接种途径 病毒增殖快，可收获大量病毒
鸡胚本身是无菌的，对接种的病毒不产生抗 体
缺点
易感病毒少，目前主要用于流感病毒、腮腺 炎病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养。
某些病毒在鸡胚内传代后，其毒力下降
3. 动物接种
常用动物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。 不同病毒对动物的敏感性不同，根据病毒种类
一般比细菌强，耐甘油，对抗生素及磺胺类药物不 敏感，干扰素可抑制病毒复制。
病毒感染的实验诊断方法
病原学诊断
✓ 病毒分离培养 ✓ 显微镜检查 ✓ 抗原检测 ✓ 核酸检测
血清学诊断
✓ 抗体检测 IgM、IgG
一、标本采集、运送和处理
（一）标本采集
➢ 采集时间：尽早采集（越早越好） ➢ 标本种类：根据感染的部位、可能感染的病毒类
醚作用后，失去感染性 4. 耐酸试验 肠道病毒耐酸，在pH3的环境下稳
2.保湿送检
• 50%甘油盐水保存送检 • 病毒转运培养基（virus transport medium ，VTM）
含0.5%明胶或牛血清白蛋白的Hank’s液
3.无菌送检
• 抑制细菌生长 100U/ml青霉素＋100μg/ml链霉素 • 抑制真菌生长 2.5μg/ml二性霉素B 或40 μg/ml制霉
细胞变圆、融合、肿胀、细胞空 泡、核浓缩、形成嗜酸性或嗜碱 性包涵体等。
某些病毒感染细胞后不出现CPE
3. 干扰现象（interference）
当两种不同的病毒同时或先后感染同一细胞时， 其中一种病毒可抑制另一种病毒的增殖，称为 病毒的干扰现象。
干扰现象也可被相应特异性抗体抑制，称为干 扰抑制现象
绒毛尿囊膜表现有痘病毒的特异性损伤
优点 鸡胚来源充足，操作简便，有多种接种途径 病毒增殖快，可收获大量病毒
鸡胚本身是无菌的，对接种的病毒不产生抗 体
缺点
易感病毒少，目前主要用于流感病毒、腮腺 炎病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养。
某些病毒在鸡胚内传代后，其毒力下降
3. 动物接种
常用动物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。 不同病毒对动物的敏感性不同，根据病毒种类
一般比细菌强，耐甘油，对抗生素及磺胺类药物不 敏感，干扰素可抑制病毒复制。
病毒感染的实验诊断方法
病原学诊断
✓ 病毒分离培养 ✓ 显微镜检查 ✓ 抗原检测 ✓ 核酸检测
血清学诊断
✓ 抗体检测 IgM、IgG
一、标本采集、运送和处理
（一）标本采集
➢ 采集时间：尽早采集（越早越好） ➢ 标本种类：根据感染的部位、可能感染的病毒类
醚作用后，失去感染性 4. 耐酸试验 肠道病毒耐酸，在pH3的环境下稳
感染性疾病实验室诊断ppt演示课件
②败血症
③毒血症 ④脓毒血症
. 6
(三）按病原体来源
外源性感染
内源性感染
.
7
三、感染性疾病的实验诊断
（一）一般实验检测 WBC常规检查 C-反应蛋白（CRP）
血清降钙素原（PCT）
器官功能改变的检测
.
8
（二）病原学实验诊断 临床病原体检查目的
明确感染病原体 指导治疗，预防，判断预后
.
9
第二节 感染性疾病的常用病原学检测
体外联合药物敏感试验
.
51
第三节 常见感染性疾病的实验诊断
.
52
一、血流感染
（一）引起血流感染常见微生物与常见疾病
常见微生物
革兰阳性球菌：葡萄球菌、 链球菌、肠球菌 革兰阴性杆菌：大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷 伯菌、沙门菌
真菌：
病毒：HBV、HCV
血流感染常见疾病
细菌：菌血症、败血症、脓毒血症 真菌：真菌血症
.
47
2. 外毒素的测定
（1）体内毒力试验
若先给动物注射抗毒素，然后再注射外毒素，则动物
细菌外毒素对机体的毒性作用，可被相应抗毒素中和， 不产生中毒症状。
.
48
（2）体外毒力试验
以细菌外毒素的特异性免疫血清为抗体与被检细菌外毒素(抗 原)进行抗原抗体反应，来检测外毒素，从而鉴定细菌是否产生 该种毒素。 白喉棒状杆菌的Elek平板毒力测定 （３) 免疫学方法：如ELISA法
PNA-FISH PCR
Serological detection
Direct microscopic examination
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最后鉴定
• 血清学鉴定: 中和试验、补体结合试验、血凝抑制
试验等 分离的新病毒，必须进行系统的鉴定
编现
（1）细胞代谢作用改变（培养液颜色变化） 正常细胞代谢： 培养液由红变黄 病毒增殖，抑制细胞代谢：培养液颜色不变或更红
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13
（2）细胞病变效应（cytopathic effect ，CPE）
（1）组织块培养
（2）器官培养 人胚气管－呼吸道病毒；人胚肠－肠道病 毒
（3）细胞培养 最常用
– 原代和次代细胞培养 – 二倍体细胞培养 – 传代细胞培养
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7
原代和次代培养细胞
动物新鲜组织（人胚肾等）→胰酶消化→营养液培养→ 单层细胞（原代细胞）
原代细胞→胰酶消化→转种培养（次代培养细胞） 对病毒敏感，但制备费时费力，只能传2～3代。
• 病毒在细胞内增殖后，使宿主的形态发 生不同程度改变，这种由病毒增殖引起 的细胞形态变化，称为细胞病变效应。
• 细胞变圆、融合、肿胀、细胞空泡、核 浓缩、形成嗜酸性或嗜碱性包涵体等。
• 某些病毒感染细胞后不出现CPE
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15
（3）空斑现象
• 空斑（plaque）是指在单层细胞中，由活细胞包围的由
• 二倍体细胞株 原代细胞反复传代（50～70代）仍保持二
倍体染色体特性。病毒分离和疫苗制备的首选细胞株。
• 传代细胞系 来源于肿瘤细胞或突变的二倍体细胞，能在
体外无限增殖。增殖快，不易衰老，易于传代保存。常用 于病毒的分离鉴定，但不能用于制备疫苗。
编辑版ppt
8
2. 鸡胚培养
常用于粘病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养
病毒感染的实验室诊断
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1
病毒感染的实验诊断方法
➢病原学诊断
➢病毒分离培养 ➢显微镜检查 ➢抗原检测 ➢核酸检测
➢血清学诊断
➢ 抗体检测 IgM、IgG
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2
一、标本采集与运送
（一）标本采集 ➢采集时间：尽早采集（越早越好） ➢标本种类：根据感染的部位、可能感染的病毒类型选择
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病毒的理化性质测定
主要用于新发现病毒的鉴定 （1）病毒的大小及形态 电镜直接观察 （2）核酸类型
5-溴-2-脱氧尿苷（BUDR）能抑制DNA复制，而不抑 制RNA病毒。 （3）乙醚敏感试验
有包膜病毒对乙醚敏感，经乙醚作用后，失去感染性 （4）耐酸试验
肠道病毒耐酸，在pH3的环境下稳定，鼻病毒不耐酸， 在pH3的环境下被灭活
3
（二）标本的运送与保存
1.低温送检
• 4℃可保存数小时 •-70℃可长期保存 • -10 ～ -20℃下病毒易灭活，不可用于保存病毒标本 • 对冷冻标本应避免反复冻融
2.保湿送检
• 50%甘油盐水保存送检 • 病毒转运培养基（virus transport medium ，VTM）含0.5%明
胶或牛血清白蛋白的Hank’s液
接种途径及方法
38～39℃
新鲜受精卵
7～13d
卵黄囊接种 羊膜腔接种 接种病毒 尿囊腔接种 绒毛尿囊膜接种
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绒毛尿囊膜表现有痘病毒的特异性损伤
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10
3. 动物接种
常用动物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。不同病对 动物的敏感性不同，根据病毒种类加以选择。
接种途径 按病毒侵袭部位选择相应的接种途径：
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病毒的血清学鉴定
• 中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等
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21
三、病毒的血清学诊断
单份血清IgM测定 早期诊断 双份血清IgG测定 4倍以上增长，有诊断意义
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病毒血清学试验常用方法
（一）中和试验
原理 抗体与相应病毒结合后，能够使病毒失去感染性。 V.＋Ab → 失去感染易感细胞的能力 一定量抗体可中和一定量病毒。 中和试验的必要条件：
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（二）补体结合试验
• 检测IgM，常用于早期诊断。 • 不需活细胞，比中和试验简单，省时。
3.无菌送检
• 抑制细菌生长 100U/ml青霉素＋100μg/ml链霉素 • 抑制真菌生长 2.5μg/ml二性霉素B 或40 μg/ml制霉菌素
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二、病毒的分离与鉴定
（一）病毒分离和鉴定的一般程序
标本采集
标本处理后接种
动物接种
观察发病
抗原检测 抗体检测 病理检查
组织培养
鸡胚接种
CPE EM
• 乙型脑炎病毒及狂犬病毒 小鼠脑内接种 • 柯萨奇病毒 乳鼠腹腔接种 • 乙肝病毒 黑猩猩静脉注射 • 流感病毒 鼻腔滴种
用途
• 分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清
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（三）病毒的鉴定
病毒的初步鉴定
• 动物感染范围及潜伏期 • 对鸡胚的敏感性 • 在细胞培养中的表现 • 理化性质的测定
1. 活病毒 2. 敏感细胞、鸡胚或动物
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中和试验的常用方法：
•固定V.，稀释血清，测定抗体效价 （常用） • 固定血清，稀释V.，求中和指数
中和试验的优缺点
• 特异，敏感，既可检测抗体，也可测定抗原（定属、定型）。 • 既可用细胞培养做，也可用动物或鸡胚接种，以细胞最常用。 • 检测IgG，不能用于早期诊断，常用用于流行病学调查。
病毒感染引起的死细胞的区域。一个空斑由一个病毒颗粒 感染 所致，利用空斑可纯化病毒。
• 不同种类病毒形成 的空斑大小和形状不同，可用于鉴定
病毒。
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（4） 干扰现象
当两种不同的病毒同时或先后感染同一细胞时，其中一种 病毒可抑制另一种病毒的增殖，称为病毒的干扰现象。
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（5）红细胞吸附及吸附抑制试验
包涵体
空斑试验
红细胞吸附
中和试验
卵黄囊膜 尿囊液 羊膜腔液 绒毛尿囊膜
观察囊膜病变
血凝试验
血凝抑制试验
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（二）病毒的分离
• 组织培养 • 鸡胚培养 • 动物接种
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1.组织培养
将人或动物离体的活组织或分散的活细胞在体外人工控制的 条件下使其生长繁殖的一种技术。
组织培养的类型
受感染的宿主细胞膜含 病毒抗原（血凝素），可吸附 鸡、豚鼠或猴红细胞
如果在培养瓶中加入相应 的血凝素抗血清，则不出现红 细胞吸附现象，即红细胞吸附 抑制试验阳性
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（6）血凝及血凝抑制试验
含有血凝素的病毒能吸附一定种类的哺乳动物或禽类的 红细胞，使红细胞凝集。该现象可被相应的血凝素抗体抑制， 称为血凝抑制试验，可用于分型。
• 血清学鉴定: 中和试验、补体结合试验、血凝抑制
试验等 分离的新病毒，必须进行系统的鉴定
编现
（1）细胞代谢作用改变（培养液颜色变化） 正常细胞代谢： 培养液由红变黄 病毒增殖，抑制细胞代谢：培养液颜色不变或更红
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（2）细胞病变效应（cytopathic effect ，CPE）
（1）组织块培养
（2）器官培养 人胚气管－呼吸道病毒；人胚肠－肠道病 毒
（3）细胞培养 最常用
– 原代和次代细胞培养 – 二倍体细胞培养 – 传代细胞培养
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原代和次代培养细胞
动物新鲜组织（人胚肾等）→胰酶消化→营养液培养→ 单层细胞（原代细胞）
原代细胞→胰酶消化→转种培养（次代培养细胞） 对病毒敏感，但制备费时费力，只能传2～3代。
• 病毒在细胞内增殖后，使宿主的形态发 生不同程度改变，这种由病毒增殖引起 的细胞形态变化，称为细胞病变效应。
• 细胞变圆、融合、肿胀、细胞空泡、核 浓缩、形成嗜酸性或嗜碱性包涵体等。
• 某些病毒感染细胞后不出现CPE
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（3）空斑现象
• 空斑（plaque）是指在单层细胞中，由活细胞包围的由
• 二倍体细胞株 原代细胞反复传代（50～70代）仍保持二
倍体染色体特性。病毒分离和疫苗制备的首选细胞株。
• 传代细胞系 来源于肿瘤细胞或突变的二倍体细胞，能在
体外无限增殖。增殖快，不易衰老，易于传代保存。常用 于病毒的分离鉴定，但不能用于制备疫苗。
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2. 鸡胚培养
常用于粘病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养
病毒感染的实验室诊断
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病毒感染的实验诊断方法
➢病原学诊断
➢病毒分离培养 ➢显微镜检查 ➢抗原检测 ➢核酸检测
➢血清学诊断
➢ 抗体检测 IgM、IgG
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一、标本采集与运送
（一）标本采集 ➢采集时间：尽早采集（越早越好） ➢标本种类：根据感染的部位、可能感染的病毒类型选择
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病毒的理化性质测定
主要用于新发现病毒的鉴定 （1）病毒的大小及形态 电镜直接观察 （2）核酸类型
5-溴-2-脱氧尿苷（BUDR）能抑制DNA复制，而不抑 制RNA病毒。 （3）乙醚敏感试验
有包膜病毒对乙醚敏感，经乙醚作用后，失去感染性 （4）耐酸试验
肠道病毒耐酸，在pH3的环境下稳定，鼻病毒不耐酸， 在pH3的环境下被灭活
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（二）标本的运送与保存
1.低温送检
• 4℃可保存数小时 •-70℃可长期保存 • -10 ～ -20℃下病毒易灭活，不可用于保存病毒标本 • 对冷冻标本应避免反复冻融
2.保湿送检
• 50%甘油盐水保存送检 • 病毒转运培养基（virus transport medium ，VTM）含0.5%明
胶或牛血清白蛋白的Hank’s液
接种途径及方法
38～39℃
新鲜受精卵
7～13d
卵黄囊接种 羊膜腔接种 接种病毒 尿囊腔接种 绒毛尿囊膜接种
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绒毛尿囊膜表现有痘病毒的特异性损伤
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3. 动物接种
常用动物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。不同病对 动物的敏感性不同，根据病毒种类加以选择。
接种途径 按病毒侵袭部位选择相应的接种途径：
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病毒的血清学鉴定
• 中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等
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三、病毒的血清学诊断
单份血清IgM测定 早期诊断 双份血清IgG测定 4倍以上增长，有诊断意义
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病毒血清学试验常用方法
（一）中和试验
原理 抗体与相应病毒结合后，能够使病毒失去感染性。 V.＋Ab → 失去感染易感细胞的能力 一定量抗体可中和一定量病毒。 中和试验的必要条件：
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（二）补体结合试验
• 检测IgM，常用于早期诊断。 • 不需活细胞，比中和试验简单，省时。
3.无菌送检
• 抑制细菌生长 100U/ml青霉素＋100μg/ml链霉素 • 抑制真菌生长 2.5μg/ml二性霉素B 或40 μg/ml制霉菌素
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二、病毒的分离与鉴定
（一）病毒分离和鉴定的一般程序
标本采集
标本处理后接种
动物接种
观察发病
抗原检测 抗体检测 病理检查
组织培养
鸡胚接种
CPE EM
• 乙型脑炎病毒及狂犬病毒 小鼠脑内接种 • 柯萨奇病毒 乳鼠腹腔接种 • 乙肝病毒 黑猩猩静脉注射 • 流感病毒 鼻腔滴种
用途
• 分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清
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（三）病毒的鉴定
病毒的初步鉴定
• 动物感染范围及潜伏期 • 对鸡胚的敏感性 • 在细胞培养中的表现 • 理化性质的测定
1. 活病毒 2. 敏感细胞、鸡胚或动物
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中和试验的常用方法：
•固定V.，稀释血清，测定抗体效价 （常用） • 固定血清，稀释V.，求中和指数
中和试验的优缺点
• 特异，敏感，既可检测抗体，也可测定抗原（定属、定型）。 • 既可用细胞培养做，也可用动物或鸡胚接种，以细胞最常用。 • 检测IgG，不能用于早期诊断，常用用于流行病学调查。
病毒感染引起的死细胞的区域。一个空斑由一个病毒颗粒 感染 所致，利用空斑可纯化病毒。
• 不同种类病毒形成 的空斑大小和形状不同，可用于鉴定
病毒。
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（4） 干扰现象
当两种不同的病毒同时或先后感染同一细胞时，其中一种 病毒可抑制另一种病毒的增殖，称为病毒的干扰现象。
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（5）红细胞吸附及吸附抑制试验
包涵体
空斑试验
红细胞吸附
中和试验
卵黄囊膜 尿囊液 羊膜腔液 绒毛尿囊膜
观察囊膜病变
血凝试验
血凝抑制试验
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（二）病毒的分离
• 组织培养 • 鸡胚培养 • 动物接种
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1.组织培养
将人或动物离体的活组织或分散的活细胞在体外人工控制的 条件下使其生长繁殖的一种技术。
组织培养的类型
受感染的宿主细胞膜含 病毒抗原（血凝素），可吸附 鸡、豚鼠或猴红细胞
如果在培养瓶中加入相应 的血凝素抗血清，则不出现红 细胞吸附现象，即红细胞吸附 抑制试验阳性
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（6）血凝及血凝抑制试验
含有血凝素的病毒能吸附一定种类的哺乳动物或禽类的 红细胞，使红细胞凝集。该现象可被相应的血凝素抗体抑制， 称为血凝抑制试验，可用于分型。