麦尔多拉蓝作为电子介体的一次性血清酒精生物传感器

Ｅ，Ｖｆ凇．ＳＣＥ）
ห้องสมุดไป่ตู้
一０．４～Ｏ．３一Ｏｔ２ 一Ｏ．１ 一Ｏ．０ ０．１ ０．２ 倒Ｖｆｗ．ＳＣＥｌ
图１ Ｎａｆｉｏｎ—ＭＢ修饰电极的循环伏安曲线
ｖｏｌｔ舢ｅｔｒｉｃ Ｆｉｇ．１ Ｃｖｃｌｉｃ
ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ｎａｆｉｏｎ。ｍｅｌｄｏｌａ’ｓ ｂｌｕｅ
（ＭＢ）一ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅｌｅｃｔｍｄｅ
测量条件（ｔｅｓｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）：Ｏ．１ ｍ出Ｌ ＰＢＳ（ｐＨ ８．Ｏ）．扫描电
Ｏ．１ ｍｏＬ／Ｌ ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ、ＫＣｌ溶液中的循环伏安特性。发现在ＰＢＳ中所得到的氧化峰电流最大，因此本研究选
用ＰＢＳ作为缓冲溶液。
温度在１０～４０℃变化时，随温度的升高，氧化峰电流逐渐增加；但是温度过高将会影响酶的活性。因
此，本研究中所有实验温度均为２５℃。
３．６生物传感器的检测范围、检出限、响应时间
只取决于ＮＡＤＨ的量，而ＮＡＤＨ是由酒精产生的，因此电流强度与酒精浓度成正比。 ３．２ Ｎ娟ｏｎ对ＭＢ的固定及ＭＢ、Ｎ媚ｏｎ用量的影响
Ｎ出ｏｎ由氟碳骨架和许多顶端为磺酸根离子（ＳＯｆ）的侧链构成，而ＭＢ带有一个单位的正电荷。因
此，ＭＢ可以通过离子交换被牢固地固定到Ｎａ６０ｎ膜中。当把Ｎ旃ｏｎ修饰电极插入含有１哪ｏＬ／Ｌ ＭＢ的
以，导致峰电流反而下降。因此本实验中所用的Ｎａｆｉｏｎ量为５止。 ３．３ Ｎａ６伽－ＭＢ修饰电极的电化学性质和稳定性
图１为Ｎ娟ｏｎ．ＭＢ修饰电极的循环伏安曲线。当扫描速度不太大时得到较对称的ｃＶ图，说明固定在
№６０ｎ膜中的ＭＢ可逆性好，表现出明显的扩散电流特征。氧化峰电流ｉ。与还原峰电流ｉ。。之比约为１。随
基础医学院法医研究所３，重庆医科大学附属第一医院４，重庆４０００１６）
摘要基于丝网印刷技术制备一次性碳电极，用Ｎ觚ｏｎ固定麦尔多拉蓝（Ｍｓ）作为电子介体，通过交联法用戊 二醛将乙醇脱氢酶和氧化型辅酶Ｉ固定于Ｎａｆｉｏｎ．ＭＢ修饰的电极上，制备一次性血酒精生物传感器。该传感器 表现出良好的特异性、灵敏度和准确性。传感器响应电流与血清酒精浓度在２．０×１０～～２．５×１０。
麦尔多拉蓝易溶于水。为了验证Ｎ幽ｏｎ膜吸附ＭＢ的稳定性，即ＭＢ是否从修饰电极上脱落而进入缓
万方数据
第１２期
罗鹏等：麦尔多拉蓝作为电子介体的一次性血清酒精生物传感器
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冲液里，将６个新制成的Ｎ世ｏｎ—ＭＢ修饰丝网印刷碳电极分别插入ｐＨ ６．ｏ、６．５、７．ｏ、７．５、８．０和８．５的磷酸 盐缓冲液中浸泡２ ｈ，在５６７ ｎｍ波长处测定缓冲液吸光度以检测缓冲液中是否有ＭＢ脱落，结果吸光度值
ｍ出Ｌ之间呈现良好的线性关系；检出限为１．３×１０～ｍ彬Ｌ，达到９５％稳态响应时间不超过２０ ｓ。探讨了ｐＨ、
缓冲液、温度及干扰物质等对一次性血酒精生物传感器的影响。将传感器用于血清酒精实际样品的测定，取得 了满意的结果。
关键词 乙醇脱氢酶，氧化型辅酶Ｉ，血酒精检测，麦尔多拉蓝
１引言
酒精生物传感器因其固定酶的不同分为乙醇氧化酶（ＡＯＤ）型…和乙醇脱氢酶（ＡＤＨ）型旧’３Ｊ。ＡＯＤ 型生物传感器特异性差、选择陛低。ＡＤＨ型生物传感器虽然具有高度特异性，但是也存在不够稳定、还原 型辅酶Ｉ（ＮＡＤＨ）被电化学氧化需较高的过电位Ｍ Ｊ、会产生其它电活性物质干扰¨１等缺点。为了降低过电 位和减少其它电活性物质的干扰，一些无机或有机电子介体被用来电化学氧化ＮＡＤＨ∞础Ｊ。
２．２一次性血酒精生物传感器的制备 ２．２．１丝网印刷碳电极的制备在０．２ ｍｍ厚的ＰｖＣ薄膜上首先印刷一层导电银膜，用ＰｖＣ油墨印刷在 导电银膜上作为绝缘层，绝缘后仅留出两个端部，其中一端作为接线端，另一端用碳浆印刷∞ｍｍ的圆盘 作为碳工作电极。每次印刷后电极都在６０℃干燥２ ｈ，制备好的电极在室温下老化７ ｄ。 ２．２．２ Ｎ相ｏｎ－ＭＢ修饰丝网印刷碳电极的制备印刷电极依次在无水乙醇和超纯水中超声清洗１０ ｍｉｎ，
压（ｓｃａｎ ｖ０１ｌａｇｅ）：，一Ｏ．４～Ｏ．１ Ｖ（％ｓｃＥ），扫描速度从内向外 （ｓｃａｎ ｒａｔｅ ｆｒｏｍ ｉｎｎｅｒ ｃｕｒｖｅ ｔｏ ｏｕｔｅｒ ｏｎｅ）：１０，２０，５０，１００ ｍＶ／ｓ。
温度（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）：２５℃。
图２生物传感器对血清酒精的电流响应
Ｆｉｇ．２ Ｃｕｒｒｅｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ
测量条件（ｔｅ８ｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）：０．１ ｍ彬Ｌ ＰＢＳ（ｐＨ ８．Ｏ）．扫描电 压（ｓｃａｒＩ ｖｏｌｔａｇｅ）：一０．４～Ｏ．１ Ｖ（∞．ｓｃＥ）；扫描速度（ｓｃａｎ ｒａｔｅ）：】Ｏ ｍＶ／ｓ；温度（ｔｅｍｐｅｒａＩｕｒｅ）：２５℃。ａ．未加入血清酒精 （ｗｉｆｈｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ａｌｃｏｈ０１）；ｂ．加入ｌ ｍｍｏＬ／Ｌ血清酒精（ｗｉｔｈ １ ｍｍｏＬ／Ｌ ｓｅｍｍ ａｌｃｏｈ０１）。
均为０，说明ＭＢ经Ｎａｆｉｏｎ固定后不溶于水且不受缓冲溶液ｐＨ的影响。
３．４生物传感器对血清酒精的电流响应 图２为生物传感器在空白（ａ）和含有１ ｍｍｏｌ／Ｌ血清酒精的０．１ ｍｏＬ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ｐＨ ８．ｏ）中（ｂ）
的循环伏安曲线。从图２可以看到，当加人酒精后，氧化峰和还原峰电流都迅速增高，且其电位基本不变，
如图２所示，生物传感器在一ｏ．４～ｏ．１ Ｖ范围对 ｌ ｍｍ彬Ｌ血清酒精进行循环伏安扫描时，在一０．１９ Ｖ 处氧化峰电流达到最大。因此，在计时电流检测中工
§２．
～
１．
１．
０． ０．
Ｏ
１０ ２０
３０ ４０ ５０ ６０
∥ｓ
作电位确定为一０．１９Ｖ。图３为生物传感器对不同浓 度的血清酒精响应的计时电流图。从图３可知，生物 传感器响应速度快，达到９５％稳态响应时间不超过
着扫描速度的增加，峰电流不断增加，且二者都与扫描速度的平方根成正比。氧化还原峰不随扫描速度的
变化而改变，在一０．１９ Ｖ处出现氧化峰，在一Ｏ．２６ Ｖ处出现还原峰，且氧化峰电位Ｅ。和还原峰电位Ｅ。。之
差（△Ｅ。）为７０ ｍＶ。
６
４
２
萋。
一２
—４
—６
—０．４一Ｏ．３ 一Ｏ．２—０．１ ０．０ Ｏ．１
０．２
相对标准偏差为４％。酒精生物传感器于４℃冰箱放置一个月后，对相同浓度底物的响应为初始的
９８．５％。以上结果表明：本酒精生物传感器具有较好的重复性、批量一致性和稳定性。
传感器的响应电流与血清酒精在２．０×１０一～２．５×１０～ｍｏＬ／Ｌ之间呈现良好的线性关系。电流与血
清酒精浓度（Ｃ）遵循以下关系：ｉ（肚）＝１．１０７３＋
４．
０．５２６３ｃ（ＨｌＩＩｌｏＬ／Ｌ），相关系数ｒ为０．９９７９。生物传感
器的检出限为１．３×１０～ｍｏＬ／Ｌ，表明传感器有较好 的检测灵敏度。
２０ ｓ。
３．７干扰实验 在含１ ｍｍｏＬ／Ｌ血清酒精的０．１ ｍｏＬ／Ｌ磷酸盐缓
图３生物传感器对血清酒精响应的计时电流图 Ｆｉｇ．３ Ｃｈｍｎｏ锄ｐｅｒｏＩｎｅｔｒｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ａｌｃｏ｝１０ｌ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ 测量条件（ｔｅｓｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏＩｌｓ）：０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＰＢｓ（ｐＨ ８．０）。酒精 浓度从下到上（ａｌｃｏｈｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｂｏｔｔｏｍ ｔ０ ｔｏｐ）：Ｏ．０， Ｏ．５，１．ｏ，１．５，２．Ｏ ｍｍｏＬ／Ｌ；工作电位（ｗｏｒｋｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）： 一０．１９ Ｖ（∞．ｓｃＥ）；温度（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）：２５℃。
用同一支生物传感器对含１ ＨⅡｎｏＬ／Ｌ的血清酒精的磷酸盐缓冲液（ｐＨ ８．ｏ）重复测定１０次，相对标准
偏差为１．４％。为了验证酒精生物传感器的批量一致性，在５个批次印制的碳电极中随机抽样５个电极制
成酒精生物传感器，分别对含１ ｍｍｏｌ／Ｌ的血清酒精的磷酸盐缓冲液（ｐＨ ８．０）重复测定３次取其平均值，
冲液（ｐＨ ８．０）中，１ ｍｍｏＬ／Ｌ的甲醇、乙醛、丙酮、乙烯乙二醇、异丙醇、ｎ．丁醇、葡萄糖、乳酸、抗坏血酸对测
定结果均不产生干扰；ｌ ｍｍｏＬ／Ｌ ｎ．丙醇使氧化峰电流增大，但ｎ一丙醇在实际血清样品中含量极少，几乎不 存在，可以完全忽略。因此，该生物传感器检测血清酒精有很高的特异性。
３．８生物传感器的重复性、批量一致性、稳定性
３结果与讨论
３．１酒精生物传感器的反应机制
生物传感器循环伏安法和计时安培法测试均采用三电极系统：Ｎ娟ｏｎ．ＭＢ．酶修饰丝网印刷碳电极作
为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝作为对电极。酒精在ＡＤＨ和ＮＡＤ＋的催化下，被氧化成乙 醛，同时ＮＡＤ＋被还原成ＮＡＤＨ。ＮＡＤＨ再被ＭＢ氧化为ＮＡＤ＋。由于ＮＡＤ＋和ＭＢ的含量是恒定的，电流
ＰＢｓ（０．１ ｍｏＬ／Ｌ，ｐＨ ８．０）中浸泡数分钟，Ｎ拍ｏｎ膜变成了蓝色，这表明ＭＢ被固定到Ｎ娟ｏｎ膜中。 实验表明，Ｎ柏ｏｎ用量从１灿增加到５止时，峰电流逐渐增加。当Ｎ曲ｏｎ用量超过５止时，峰电流
反而减少。这是因为增加Ｎ旃ｏｎ用量，与ＭＢ发生离子交换反应的活性位点增加；但Ｎ觚ｏｎ用量过多，形
成膜太厚，不利于Ｎ碰ｏｎ与ＭＢ进行离子交换反应，从而不利于ＭＢ与丝网印刷电极之间的电子交换。所
吸取５¨Ｌ １％的Ｎ埴ｏｎ一乙醇溶液滴加到超声清洗后的印刷电极表面，在空气中干燥，待电极表面干燥后形 成一层Ｎ崩ｏｎ膜。然后把此电极插入含有１ ｍｍｏＬ／Ｌ ＭＢ的磷酸盐缓冲液（Ｏ．１ ｍｏＬ／Ｌ，ｐＨ ８．０）中浸泡 ３０ ＩＩｌｉｎ，使ＭＢ通过离子交换固定到Ｎ蕊ｏｎ膜中。
２．２．３酒精生物传感器的制备把２ ｍｇ ＡＤＨ、２ ｍｇ ＮＡＤ＋、６ ｍｇ牛血清白蛋白溶于２００曲磷酸盐缓冲 液（０．１ ｍｏＬ／Ｌ，ｐＨ ８．０）中，再加入２０¨Ｌ２．５％戊二醛溶液充分混合。再吸取５灿此溶液滴加到已制备好 的Ｎａｆｉｏｎ—ＭＢ修饰丝网印刷碳电极上；在空气中溶剂蒸发后形成一层酶膜，制成酒精生物传感器。