引物退火温度与Tm值的关系-tm退火温度公式
引物设计之退火温度
Tm值就是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。
不同序列的DNA，Tm值不同。
DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系。
退火温度（Annealing Temperature）为引物和模板结合时候的温度参数，当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度·它是影响PCR特异性的较重要因素。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
在模板变性后温度快速冷却至40℃～60℃(某个退火温度)的时候，可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞，这就使PCR后期的过程成为可能。
计算方法核酸Tm值（解链温度）计算评价标准是核酸所吸收的光线量达到其所增加吸收260nm光线的量的两倍达到的温度，当核酸达到Tm值时，其260nm吸收量可增加百分之四十（紫外吸收量随解体程度而增加，直至完全解体。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
2温度时间退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。
对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
tm值计算公式 thermofisher
tm值计算公式 thermofisherThermo Fisher Scientific是一家全球领先的生命科学公司，致力于为科学家提供广泛的实验室解决方案和服务。
其中，TM值计算公式是其产品和服务中的一个重要组成部分。
本文将探讨TM值计算公式的原理和应用，以及相关领域的研究进展。
TM值（Melting Temperature）是指双链DNA分子在退火过程中解链的温度，它是DNA分子的稳定性和热力学性质的重要指标。
TM值的计算可以帮助科学家预测DNA分子在实验条件下的解链温度，从而指导实验设计和优化。
TM值的计算公式基于DNA序列的碱基组成和序列长度等因素。
目前，常用的计算公式包括Wallace公式、Sugimoto公式和Nearest-Neighbor公式等。
这些公式通过考虑DNA序列中碱基间的氢键和其他相互作用力来预测TM值。
具体而言，这些公式考虑了碱基对之间的氢键数目和强度、序列长度、碱基组成的GC含量等因素，从而实现了对TM值的准确预测。
TM值计算公式在生物学和医学研究中有着广泛的应用。
首先，它在分子生物学实验中起着重要的指导作用。
科学家们可以根据TM值的预测结果，选择合适的温度进行PCR扩增、DNA测序、基因克隆等实验操作。
其次，TM值的计算也对基因组学和药物研发等领域具有重要意义。
例如，在药物研发过程中，科学家可以通过计算TM值来评估药物与DNA分子的相互作用强度，从而预测药物的效果和安全性。
此外，TM值的计算还可以用于DNA纳米技术、基因组学研究和疾病诊断等领域。
近年来，随着高通量测序和精准医学的快速发展，TM值计算公式也得到了进一步的改进和优化。
研究人员不断尝试结合机器学习和统计学方法，通过分析大量的实验数据来提高TM值的预测精度。
同时，新的TM值计算工具和软件也不断涌现，为科学家提供更加方便和准确的计算工具。
TM值计算公式是Thermo Fisher Scientific产品和服务中的重要组成部分，也是生命科学研究中的重要工具。
tm值计算经典公式
tm值计算经典公式
TM值（Temperature Melting Point）是指物质的熔点温度，是一个重要的物理性质参数。
计算TM值的经典公式是根据物质的序列碱基组成而得出的。
计算TM值的经典公式为：
TM = 4(G + C) + 2(A + T)
其中，G、C、A和T分别代表序列中的鸟嘌呤（Guanine）、胞嘧啶（Cytosine）、腺嘌呤（Adenine）和胸腺嘧啶（Thymine）的数量。
TM值的单位通常是摄氏度。
这个公式基于DNA和RNA的碱基对结构的特点。
由于G和C之间的氢键数量较多，G-C碱基对的熔点温度较高；而A和T之间的氢键数量较少，A-T碱基对的熔点温度较低。
在计算TM值时，需要确定序列中的鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶的个数，并代入公式进行计算。
通过计算TM值，可以了解序列的热稳定性，从而在实验设计和分子生物学研究中提供重要的参考依据。
需要注意的是，这个经典公式是基于碱基组成而得出的大致估算值，实际的TM值可能受到其他因素的影响，例如DNA和RNA的序列长度、盐度以及其他结构因素等。
因此，在具体应用中，还需考虑其他因素的影响，并结合实验结果进行综合分析。
总之，TM值计算经典公式是根据物质的碱基组成而得出的公式，可用于估算物质的熔点温度。
在实验设计和分子生物学研究中，TM值的计算可以为我们提供重要的参考信息，对于理解序列的热稳定性和合成寡核苷酸具有一定的意义。
PCR的退火温度选择
熔解温度(Tm)是引物的一个重要参数。
这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度・Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非待异性结合。
合理的退火温度从55* 到7(TC。
退火温度一般设定比引物的Tm低5它。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC 含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5°C,以为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5。
(2,就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5它或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以荻得目的模板的部分拷贝。
当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT,对于更长的寡聚核昔酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5+ 16. 6 x LoglO[Na+] + 0.41 (%GC) - 600/size公式中，Size =引物长度。
退火温度取决于引物长度及序列，GC含量越高退火温度越高，引物的Tm值减去5-8度即是引物的退火温度，引物的Tm值一般都会在引物合成单上体现，如果没有的话可以在网上搜个引物退火温度计算器输入序列就可以了。
退火时间一般都是30秒。
同源重组pcr引物退火温度-概述说明以及解释
同源重组pcr引物退火温度-概述说明以及解释1.引言1.1 概述同源重组PCR是一种重要的分子生物学技术，广泛应用于基因工程、基因组学和生命科学研究中。
在同源重组PCR反应中，引物的设计和退火温度的选择是非常关键的步骤。
引物退火温度的选择直接影响了PCR反应的特异性和扩增效率。
引物退火温度是指PCR反应中的温度条件，用来使引物与模板DNA 序列结合，以便进行DNA扩增。
引物的退火温度应适当高于其Tm（退火温度）值，以保证退火反应能够充分进行。
同时，引物退火温度也需要低于DNA链的解链温度，以避免在退火过程中引物与DNA链的解链，影响扩增效率。
引物退火温度的选择需要考虑多个因素。
首先，应根据引物的序列特性来确定其Tm值。
Tm值是DNA双链解链的温度，通常由引物的碱基组成、长度和浓度来决定。
较长的引物和富含GC碱基的引物通常具有较高的Tm值。
其次，引物的退火温度应根据模板DNA的GC含量来进行调整。
高GC含量的模板DNA需要较高的退火温度，以增加引物与模板DNA 的结合力。
最后，应该考虑反应体系的缓冲条件、引物浓度和DNA模板浓度等因素，以获得最优的引物退火温度。
通过合理选择引物退火温度，可以提高同源重组PCR反应的特异性和扩增效率。
较高的退火温度可以增加引物与目标序列的结合力，减少非特异性扩增产物的形成。
同时，适当的退火温度可以提高扩增效率，加快PCR 反应的速度。
总之，引物退火温度在同源重组PCR反应中起着至关重要的作用。
合理选择引物退火温度可以提高反应的特异性和扩增效率，为基因工程和生命科学研究提供有力的技术支持。
1.2文章结构文章结构指的是文章的整体框架和组织方式。
在本文中，我们将遵循以下结构来撰写和组织文章内容：1) 引言部分:a. 概述：介绍同源重组PCR的基本原理和应用背景；b. 文章结构：说明本文的整体组织结构和各个章节的内容；c. 目的：明确文章的研究目标和意义。
2) 正文部分：a. 同源重组PCR引物的意义：介绍同源重组PCR引物在相关研究领域的重要性和作用；b. 引物退火温度对同源重组PCR反应的影响：探讨引物退火温度在同源重组PCR反应中的作用机制和影响因素。
PCR参数
〔PCR的循环参数〕1、预变性（Initial denaturation）．模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。
2、引物退火（Primer annealing）退火温度一般需要凭实验（经验）决定。
退火温度对PCR的特异性有较大影响。
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)复性温度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
3、引物延伸引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。
延伸时间随扩增片段长短而定。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。
3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
4、循环中的变性步骤循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
每完成一个循环需2～4分钟5、循环数大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。
6、最后延伸在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。
3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
引物设计常见问题与解答
引物设计常见问题与解答先看一下Tm的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。
大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。
因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。
PCR的退火温度选择
熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT,对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
退火温度取决于引物长度及序列，GC含量越高退火温度越高，引物的Tm值减去5-8度即是引物的退火温度，引物的Tm值一般都会在引物合成单上体现，如果没有的话可以在网上搜个引物退火温度计算器输入序列就可以了。
退火时间一般都是30秒。
试试下载一个Oligo6.0，这个软件挺不错的，在计算出来的退火温度基础上上下幅度一点是没有什么问题的bioxm2.6 更专业软件很小很方便更能还挺强大我们刚做了PCR实验，当引物长度小于25bp时，退火温度通过（Tm-5）℃计算，Tm=4（G+C）+2（A+T）增加PCR的特异性：1. primers design这是最重要的一步。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
创作编号：
GB8878185555334563BT9125XW
创作者：凤呜大王*
退火温度与Tm值
①在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
②引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值-(5～10℃)
③Tm对于设定pcr退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
④引物退火温度
退火温度决定PCR特异性与产量;温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降;温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。
一般先由37℃反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温度。
也可根据引物的(G+C)%含量进行推测，把握试验的起始点，一般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度Tm(melting temperature)低5℃，可按公式进行计算：
Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃
其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。
例如，20个碱基的引物，如果(G+C)%含量为50%时，则Ta的起点可设在55℃。
在典型的引物浓度时(如0.2μmol/L),退火反应数秒即可完成，长时间退火没有必要。
创作编号：
GB8878185555334563BT9125XW
创作者：凤呜大王*。