干细胞培养手册(吉泰生物)
Mx3000P操作说明
第一章
聚合酶链式反应原理
PCR 反应原理
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是 80 年代中期发展起来的体 外核酸扩增技术。 它具有特异、灵敏度高、产率高、 快速、 简便、重复性好、易 自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一 DNA 片段在数小 时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚 至一个细胞中扩增出足量的 DNA 供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到 的事情，用 PCR 几小时便可完成。PCR 技术是生物医学领域中的一项革命性创举和 里程碑。
目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶， 另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2.5U(指总 反应体积为 100μl 时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减 少。
上海吉泰生物科技有限公司
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PCR 反应原理
dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保 存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH或 1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到 7.0～7.5，小量分装，-20℃ 冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为 50～200μmol/L， 尤其是注意 4 种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其 它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各 种dNTP浓度为 200μmol/L时，Mg2+浓度为 1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高， 反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使 反应产物减少。
干细胞培养操作步骤详解
干细胞培养操作步骤详解干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，具有重要的研究和应用价值。
为了能够在实验室中进行干细胞的培养与研究，科学家们经过不断的探索与总结，发展出了一套可行的干细胞培养操作步骤。
本文将详细介绍干细胞培养的操作步骤，并分析其中的关键环节。
1. 细胞分离与传代干细胞在培养的过程中，需要定期进行细胞分离与传代，以保持其细胞群体的活力和稳定性。
细胞分离可以采用酶解的方法，通过处理细胞培养物，在细胞间层加入胰蛋白酶等酶类物质，使细胞分散。
分散后的细胞可通过离心等操作，获得细胞沉淀，从而用于细胞传代。
2. 细胞培养物的制备在进行干细胞培养前，需要准备好适合细胞生长的培养基。
常用的培养基有DMEM、MEM和RPMI-1640等。
培养基内通常添加胎牛血清、人血清等添加剂，以提供细胞生长所需的营养和因子。
在制备培养基时，需要注意消毒与无菌操作，以避免细菌污染对细胞培养造成的不良影响。
3. 细胞接种与培养将分散的细胞沉淀加入预先准备好的培养基中，控制细胞密度，通常为每平方厘米约1-2×10^5个细胞。
接种后的培养皿或培养瓶需要放入恒温培养箱中，保持适宜的温度和湿度条件。
此外，还需要提供适当的气体环境，如常规培养箱中的5%CO2和95%空气混合气体。
细胞的培养时间因细胞类型和实验要求而不同，一般为1-2周。
4. 细胞定期观察与检测在细胞培养的过程中，需要进行定期的细胞观察与检测，以评估细胞生长的情况和健康状态。
观察可以通过显微镜、细胞染色和细胞活性试剂等进行，以获得细胞形态、增殖能力和生物学活性等相关信息。
在观察和检测过程中，应注意操作的轻柔与无菌。
5. 干细胞分化与诱导干细胞具有多向分化的潜能，可以不同程度地分化成各种细胞类型。
因此，在培养过程中，可以通过添加特定的生长因子、细胞因子或化学诱导剂，来控制干细胞向特定细胞类型的分化。
分化和诱导的过程通常需要一定的时间和特定的培养条件，如培养基成分的变化和培养环境的调控。
癌症干细胞分离培养指南手册
癌症干细胞分离培养指南手册多年来，癌症研究人员都在试图解答为何经过了成功的化疗或者放疗的患者，还是会出现复发呢，这个问题直到上个世纪70年代末的时候，癌症干细胞假说的出现才有了答复，科学家们假定了一小部分的癌细胞可以无限期地自我更新，从而引起不同细胞类型的肿瘤。
这一假说也解释了为什么许多癌症药物会对标准的治疗进程产生抗药性：这些药物并没有影响到干细胞群。
如果这一假说成立，那么针对癌症干细胞的药物也许能完全治愈癌症。
也就是为何时至今日，这么多科学家们都在努力研究癌症干细胞，了解它们是如何在癌症治疗后继续生存的。
最早研究人员是在1997年发现了急性髓系白血病（AML）血液样品中的癌症干细胞，但是由于采用表面标记物证明实体肿瘤中癌症干细胞的存在，常常会出现不一致的结果，因此这一理论也引发了激烈的讨论。
但是近年来科学家们在所有癌症类型（胶质母细胞瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌）中发现了具有自我更新能力，启动肿瘤发生的细胞，因此讨论不再围绕着“癌症干细胞是否存在？”了，而是变成了“癌症干细胞的类型有多少种？”要想了解癌症干细胞并不容易，其中一大阻碍就是癌症干细胞的获得，许多医院会对肿瘤样品进行冷冻切片，而要从解冻组织中获得可用的细胞就没有从新鲜样品中取样那么简单了。
另外一个问题在于根据细胞表面标记分离高纯度的细胞群。
近期The Scientist杂志找到了一些专家，请教了他们在这些方面的经验。
如何处理患者样品来自多伦多大学的John Dick教授是癌症干细胞研究的鼻祖，就是他在做实验的时候发现，并不是所有的癌细胞都是经历相同的步骤发展而来的。
尤其是其中小部分的具有自我更新能力的白血病细胞能发展成肿瘤，由此他将能发育成肿瘤的变异细胞命名为癌症干细胞。
对于样品处理，他认为能否从临床医生那里获得新鲜组织是成功分离出癌症干细胞的关键，即使这很困难，但是用移液器或轻轻从患者样品切片，并将其放置在冰上，能最大限度的保存可用的分离细胞。
PeproGrow
PeproGrow™ hESC培养基—常见问题解答1. PeproGrow™ hESC的配方是什么？PeproGrow TM h ESC培养基是PeproTech与美国罗格斯大学干细胞培训中心合作研发的专有配方，不含血清和酚红，化学成分明确。
每个PeproGrow™ h ESC培养基试剂盒中包含一瓶基础培养基和一管单独的PeproTech重组生长因子冻干粉。
2. 如何储存PeproGrow™ hESC培养基？基础培养基避光2°C-8°C最长保存6个月，生长因子冻干粉组分2°C-8°C可保存6个月，-20°C至-80°C则可保存长达5年。
3. PeproGrow™ hESC培养基应该如何使用？生长因子冻干粉在开盖前需离心，然后根据试剂盒的规格不同用100 µl或500 µl细胞培养级无菌水重悬。
如果两周内能用完，则将全部的已重悬生长因子组分无菌操作加入基础培养基中，通过旋转或吹打充分混匀。
如果两周内用不完，则需无菌操作取所需体积的基础培养基至一个无菌的聚碳酸酯(PC)瓶或锥形底聚丙烯(PP)管中，然后按比例加入已重悬的生长因子组分，并通过旋转充分混匀。
如果整个过程均为无菌操作，配制完成后无需再次过滤除菌。
在瓶子标签上标注配制时间及新的有效期(混合后2周)，避光保存于2°C - 8°C。
细胞换液前，仅取当次所需量的培养基，复温后使用。
4. 从我目前使用的培养基更换为PeproGrow™ hESC培养基时必须进行适应培养吗？在两种均含胰岛素的培养基间切换不必进行适应培养，而当从含胰岛素的培养基更换为不含胰岛素的培养基时则可能需要适应培养。
是否需要适应培养液也与细胞类型有关。
当快速方案(无适应培养)的效果不尽如人意时，额外的适应培养(短期或长期的)可能就有必要了。
如果短期的适应培养不奏效时，可使用长期的适应培养，同时逐步提高新培养基的比例，如按100:0，80:20，60:40，20:80和0:100分步进行。
干细胞培养方案
干细胞培养方案如下：
1. 原代培养方案：
培养基成分：DMEM/F12（1:1）+10% FBS+1% L-Glutamine+1% penicillin/streptomycin；
步骤：
(1) 将骨髓、脐带血或胚胎等组织来源的细胞进行酶解，获得单个细胞；
(2) 分装到预处理好的培养皿中，并加入适量培养基，充分混匀；
(3) 放入37℃恒温培养箱中，每两天换一次新鲜的培养基；
(4) 观察细胞生长情况并进行定期检测以确保其品质。
2. 传代培养方案：
培养基成分同上；
步骤：
(1) 将原代培养的细胞进行足够程度的增殖，达到80%-90%的密度；
(2) 用胰酶等酶消化细胞，并分装到新的培养皿中；
(3) 加入适量的培养基，放入恒温培养箱中，每两天换一次新的培养基。
3. 无血清培养方案：
培养基成分：StemPro® MSC SFM XenoFree培养基或StemPro® NSC SFM XenoFree培养基等无血清培养基；
步骤：
(1) 将干细胞进行酶解，获得单个细胞；
(2) 分装到预处理好的培养皿中，加入适量的无血清培养基；
(3) 放入恒温培养箱中，每两天换一次新的培养基。
以上是常用的干细胞培养方案。
干细胞培养实验报告
干细胞培养实验报告实验目的本实验的目的是探究合适的培养基条件对于干细胞培养与增殖的影响，以及评估干细胞在不同培养条件下的生长特性和表型。
实验方法1. 实验材料准备- 干细胞培养基- 培养皿- 细胞培养试剂- 透明封闭盖玻璃2. 干细胞分离和培养- 从小鼠骨髓中分离获得干细胞- 将干细胞置于培养基中进行培养和增殖- 分成若干组，在不同培养基条件下进行培养3. 观察与记录- 在培养过程中观察细胞的形态特征和增殖情况- 定期记录观察结果，并拍摄干细胞的相片以备参考实验结果在本实验中，我们选取了三种常用的干细胞培养基：A、B、C。
以下是不同培养基条件下观察到的结果：1. 培养基A- 观察到细胞呈现规则的形态特征，生长态势良好- 细胞增殖速度较为稳定，在培养第3天后开始形成典型的集落状结构- 细胞表型表现出较为幼稚的形态特征2. 培养基B- 观察到细胞呈现略微不规则的形态特征，但整体生长态势较为良好- 细胞增殖速度稍慢，但形成集落的时间与培养基A相近- 细胞表型表现出中等程度的分化特征3. 培养基C- 观察到细胞表现出不规则的形态特征，其中一部分细胞生长缓慢 - 细胞增殖速度相对较慢，在培养第5天后形成微小的集落- 细胞表型表现出明显的分化特征，部分细胞开始失去干细胞特性结论通过本实验的观察和分析，可以得出以下结论：1. 不同培养基条件对于干细胞的生长和增殖具有明显的影响。
2. 培养基A对于维持干细胞的幼稚性和增殖速度具有最佳效果。
3. 培养基B相对于培养基A，其细胞的分化程度略有提高。
4. 培养基C对于干细胞的生长和增殖效果不如前两者，且细胞开始表现出明显的分化特征。
实验总结本实验通过观察不同条件下干细胞的生长和增殖情况，较为客观地评估了三种常用培养基对于干细胞的影响。
实验结果可为后续干细胞研究提供参考。
然而，本实验存在一些局限性，如仅选取了三种培养基，其他未涉及的培养基类型可能存在更好的效果，需要进一步研究和扩展。
人间充质干细胞培养试剂盒说明书 (2)
人间充质干细胞培养试剂盒说明书【产品名称】通用名称：人间充质干细胞培养试剂盒【产品型号】A型、B型【包装规格】500mL/kit【预期用途】仅用于对人间充质干细胞的增殖培养，不具备对细胞的选择、诱导、分化功能。
培养后的细胞用于体外诊断。
【检验原理】细胞培养广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域，成为最重要的基础科学之一，建立合适的细胞培养方案能够有效提高实验效率和实验稳定性，同时节约实验成本。
在传统细胞培养过程中，培养基中大多含有FBS或FCS，由于血清中含有的很多未知成分会抑制或者刺激细胞，从而干扰实验，并且由于血清的不确定性，不同批次对于实验的影响也不同，造成了实验的重复性降低，因此我们推出不含血清的人间充质干细胞培养试剂盒，该试剂盒可有效避免因血清质量和血清组分变动对实验造成影响，提高细胞培养和实验结果的可重复性。
【主要组成成分】产品名称型号规格组成成份数量体积人间充质干细胞培养试剂盒A型（有酚红）500mL/Kit人间充质干细胞基础培养基(A型)1瓶475mL人间充质干细胞培养添加物1瓶25mL B型（无酚红）500mL/Kit人间充质干细胞基础培养基(B型)1瓶475mL人间充质干细胞培养添加物1瓶25mL【储存条件及有效期】人间充质干细胞基础培养基未开封并且2℃~8℃保存，有效期为1年；人间充质干细胞培养添加物未开封并且-80℃~-20℃保存，有效期为1年；两者混合后置于2℃~8℃保存，有效期2周。
【样本要求】1、细胞要求：原代培养或冻存复苏的人间充质干细胞；2、细胞悬液要求吹打混匀，成单细胞悬液。
【检验方法】准备工作1、准备25mL的人间充质干细胞培养添加物，37℃水浴解冻，若有沉淀析出，可用0.22μm细胞滤器过滤或4℃，3000g/10min离心取上清，该步骤不影响实验结果；2、准备475mL的人间充质干细胞基础培养基，恢复到室温；3、将人间充质干细胞培养添加物加入475mL人间充质干细胞基础培养基中，即可得到5%浓度的完全培养基；4、配置好的人间充质干细胞完全培养基可于2-8℃保存2周。
干细胞培养方案
干细胞培养方案
一、概述
干细胞是指具有自我更新和多向分化潜能的细胞，可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。
干细胞研究已经成为生物医学领域的热门话题，可以用于治疗多种疾病。
二、培养基配方
以下是常用的培养基配方：
• 1. DMEM/F12培养基：Dulbecco最小必需培养基（DMEM）和Ham的F12培养基的混合物，含有丰富的氨基酸、维生素和营养物质，可用于支持干细胞增殖和分化；
• 2. Knockout DMEM培养基：不含L-谷氨酸、L-精氨酸和脯氨酸，可用于防止干细胞分化；
• 3. N2B27培养基：含有N2补充物和B27补充物，不含血清，可用于维持干细胞的自我更新。
三、干细胞培养技术
干细胞培养需要注意以下技术：
• 1. 培养基配方的选择和调配：根据不同类型的干细胞选择适当的培养基，并按照比例将各种成分混合；
• 2. 细胞解离：用酶或机械方法将细胞从培养基底物上分离，并转移到新的培养基中；
• 3. 培养条件的控制：温度、湿度、CO2浓度和通风等条件需要严格控制，以保证细胞的正常生长和分化。
四、结语
干细胞培养是干细胞研究的重要组成部分，需要注意培养基的配方和技术的掌握，以保证干细胞的质量和数量。