胚胎干细胞体外培养.
胚胎干细胞的应用前景
中国校外教育学科教育462 08/2009胚胎干细胞的应用前景◆韩海荣(江苏省射阳县陈洋中学,江苏射阳)干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。
它包括胚胎干细胞和成体干细胞。
人类胚胎干细胞可以成功地在体外培养。
胚胎干细胞经诱导可以分化为其他类型的细胞和组织,为干细胞的广泛应用提供了基础。
干细胞胚胎干细胞克隆器官移植干细胞是一种未充分分化,尚不成熟的细胞,具有再生各种组织器官和人体的潜在功能,医学界称之为“万用细胞”。
人类寄希望于利用干细胞的分离和体外培养,在体外繁育出组织或器官,并最终通过组织或器官移植,实现对临床疾病的治疗。
干细胞具有经培养不定期地分化并产生特化细胞的能力。
如果与克隆技术相结合,胚胎干细胞便可发展成遗传特征与病人完全吻合的细胞、组织或器官。
科学家普遍认为,干细胞的研究将为临床医学提供更为广阔的应用前景。
一、胚胎干细胞1.胚胎干细胞(ES 细胞)的概念胚胎干细胞是指当受精卵分裂发育成囊胚时内细胞团的细胞,它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。
无论在体外还是体内环境,ES 细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。
进一步说,胚胎干细胞是一种高度未分化细胞。
它具有发育的全能性,能分化出成体动物的所有组织和器官,包括生殖细胞。
2.胚胎干细胞的形态学特征ES 细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构,细胞核大,有一个或几个核仁,胞核中多为常染色体质,胞质胞浆少,结构简单,胚胎干细胞具有正常的、完整及稳定的染色体核型。
体外培养时,细胞排列紧密,呈集落状生长。
用碱性磷酸酶染色,ES 细胞呈棕红色,而周围的成纤维细胞呈淡黄色。
细胞克隆和周围存在明显界限,形成的克隆细胞彼此界限不清,细胞表面有折光较强的脂状小滴。
细胞克隆形态多样,多数呈岛状或巢状。
3.胚胎干细胞的全能性ES 细胞的全能性是指ES 细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力,即ES 细胞具有发育成完整动物体的能力,可以为细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的试验材料。
人胚胎生殖干细胞的体外培养研究
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【 ｂｔ ｃ】 Ｔｉｅ ｅｍ ｎａｅ ｔ ｎｒｉｄａａ ｓ ｅ ｏ ｅ ｃ ｙｔ ｄｒ Ｇｃｌｒｓ ｃｎｉ ｎ ｕｅ ｔ ｇ ｉ ｔｎｂ ｃ ｉ Ａ ｓ ａｔ ｈ ｐｒ ｅｔ ｆｒｈ ｇ ｅ ｌｅ ｌ ｉｔ ｍ ｓ ｓｎｅ Ｅ ｅ ｉ ｄｉ ， ｓ ｅ ｒ ｎ ａｏ ｌ ｋ ａｅ ｒ ｓ ｘ ｉ ｔ ｅ ｅ ａｚ ｎ ｙｓｈ ｄ ｔ ｂ ａ ｉ ｌａ ｅ ｏ ｔ ｏ ｓｈ ｏ ａ ｚ ｉ ｏ ｒｓ
格床和 实验 医学毒志 ２０ ０９耳 ３月 弟８卷 弟 ３ 期
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Hale Waihona Puke 人胚 胎 生殖 干细 胞 的体 外 培 养 研 究
陈明玉（ 大连铁路卫生学校 辽宁 大连 １６０ ） １０ １
【 要】 本 实验在综合分析 目 国内外人胚胎 生殖细胞 （ Ｇ细胞 ） 摘 前 Ｅ 的培养条件后 ， 采用组织块培养法 ， 同源胚胎 以
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胚胎干细胞体外诱导分化的研究进展
04
胚胎干细胞体外诱导分化的应用前景
疾病治疗与药物筛选
疾病治疗
胚胎干细胞具有多向分化潜能，可分化为特定类型的细胞，如神经细胞、心肌细 胞等，为疾病治疗提供了新的途径。例如，通过诱导胚胎干细胞分化为神经细胞 ，可以用于治疗帕金森病、阿尔茨海默病等神经系统疾病。
药物筛选
胚胎干细胞可在体外培养扩增，为药物筛选提供了大量的实验样本。通过比较胚 胎干细胞在药物处理前后的分化过程和表型变化，可以评估药物的疗效和副作用 ，为新药研发提供有力支持。
表观遗传修饰
表观遗传修饰可以影响胚 胎干细胞的分化，如DNA 甲基化、组蛋白乙酰化等 。
03
胚胎干细胞体外诱导分化方法
化学诱导分化方法
化学诱导分化是利用化学物质 调节胚胎干细胞的分化过程。
常用的化学物质包括细胞因子 、激素、小分子化合物等。
这些化学物质通过调节胚胎干 细胞的基因表达、信号转导等 途径，诱导细胞定向分化。
组织工程与器官移植
组织工程
胚胎干细胞具有发育成各种组织的潜力，为组织工程提供了理想的基础材料。例如，可以诱导胚胎干细胞分化 为软骨、肌肉、血管等组织，用于修复或替换受损的组织器官。
器官移植
胚胎干细胞可分化为多种器官细胞，为器官移植提供了新的来源。与传统的器官移植相比，胚胎干细胞诱导分 化的器官具有更好的组织匹配性和更少的不良反应，有望成为解决器官短缺和提高移植效果的重要途径。
研究方法
采用体外培养胚胎干细胞的方法，通过添加不同的诱导因子 或采用特殊的培养条件，观察细胞的分化过程和分化产物的 特性，同时结合分子生物学、细胞生物学等技术手段分析相 关机制。
02
胚胎干细胞特性与分化机制
胚胎干细胞特性
GENMED人体胚胎干细胞完全培养基 产品说明书(中文版)
GENMED SCIENTIFICS INC. U.S.A GMS12199.1 v.A GENMED人体胚胎干细胞完全培养基产品说明书（中文版）主要用途GENMED人体胚胎干细胞完全培养基是一种旨在用于体外维护人体胚胎干细胞的多能性，抑制培养中的胚胎干细胞的自发分化等体外培养必须的营养试剂。
其适用于新的胚胎干细胞系的建立、培养已有的胚胎干细胞系以及无基质细胞的 CD34 干细胞等。
产品即到即用，严格无菌、无病毒和支原体，性能稳定，促细胞生长效应极佳，重复性高，建立标准化体系。
技术背景根据胚胎干细胞的生长需求，培养基富含各种营养元素，包括精制胎牛血清，白血病抑制因子，非必需氨基酸、巯基乙醇以及预防污染的青霉素和链霉素等。
白血病抑制因子（leukaemia inhibitor factor； LIF）是一个多效性、分泌性的糖蛋白生长因子，是由鼠染色体上11A1-A2和人染色体的22q12上的独特基因编码控制。
大部分细胞体系中的 LIF 的分子量为38到67 kDa，这种异质性是因为糖基化的多样性所导致的。
鼠、人、牛、大鼠和猪的 LIF 分子克隆被分离，序列分析揭示了具有180个氨基酸的成熟蛋白的分子量为20 kDa。
在不同种系的 LIF 中存在着保守序列（例如：在鼠和人蛋白质中78％氨基酸序列是一致的）。
产品符合美国USDA、FDA和USP的规定。
产品内容GENMED人体胚胎干细胞完全培养基100毫升产品说明书1份保存方式保存在4℃冰箱里，有效保证6月实验提示1．建议按下表用量使用培养板/培养皿/培养瓶试剂用量96孔板微升48孔板微升24孔板毫升12孔板毫升6孔板毫升30mm 毫升60mm 毫升100mm 毫升25cm2毫升75cm2毫升2．建议每3天更换1次培养液；如果溶液颜色为桔红色，须换液，务必不要等到溶液颜色为黄色3．建议传代前4小时换液一次4．建议传代比例为1：1至1：10之间注意事项1．本产品为100毫升2．严格无菌操作3．操作时须戴手套4．使用时，避免污染母液5．用户根据需求，可以添加各种生长因子，例如成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor；FGF）等6．本公司提供系列细胞培养产品质量标准1．产品经鉴定性能长期稳定2．本产品经鉴定无噬菌体、支原体、病毒污染使用承诺杰美基因秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。
动物克隆 第三章胚胎干细胞分离培养
第三章胚胎干细胞分离培养1981年，Evens等首次发现小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)在体外具有稳定增殖并维持未分化状态及分化全能性潜能的特性，并成功建立小鼠ESCs系[1]。
由于ESCs独特的生物学特性，ESCs方面的研究迅速成为生命科学研究领域的热点之一，1999年－2000年连续两年被评为世界十大科技新闻。
ESCs已成为分子遗传学、发育生物学、细胞工程、组织工程等研究的重要工具，在研究细胞分化机制、临床治疗、转基因等方面有着重要的意义。
随着对干细胞研究的不断深入，人们将逐渐掌握和利用干细胞，还将推动相关学科的发展。
文章综述了ESCs的研究概况、体外分离培养、生物学特性、鉴定方法、影响ESCs分离培养的因素、存在问题以及应用前景等。
1 胚胎干细胞研究概况ESCs的研究最早要追溯到畸胎瘤细胞的发现，但真正意义上的开始却是1981年Evens等首先从延缓着床的胚泡分离培养到小鼠的ESCs，并建立小鼠的ESCs系，之后ESCs研究迅速发展，已在大鼠、仓鼠、猪、牛、水貂、兔、山羊、绵羊、恒河猴和人等多种哺乳动物上建立了类ESCs系[2]。
近几年来，ESCs研究在ESCs来源与培养方法、探索建立和维持ESCs系的条件、定向诱导分化、遗传操作、疾病动物模型的治疗等方面取得了一定的进展。
研究人员利用体细胞核移植技术进行胚胎重建，从克隆胚胎中成功得到小鼠、兔和人等多种哺乳动物ESCs[3-5]；利用孤雌激活技术建立小鼠和非人灵长类孤雌激活胚胎源的ESCs系[6]，这些为ESCs的分离克隆开辟了新的途径。
利用定向诱导分化技术成功将ESCs分化为造血细胞、内皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、胰岛细胞、心肌细胞、成骨细胞，甚至滋养层细胞和生殖细胞等所有3 个胚层的细胞类型[7-13]。
试验表明，人ESCs 能有效治疗心肌梗死、糖尿病、中风等疾病。
国内在ESCs方面的研究起步较晚，但发展迅速，在相关领域做了大量的研究。
小鼠胚胎干细胞体外诱导分化成GABA能神经元
小鼠胚胎干细胞体外诱导分化成GABA能神经元目的探讨小鼠胚胎干细胞在体外培养向GABA能神经元定向诱导分化的可能性。
方法将小鼠胚胎干细胞以“无血清”方法培养,用DMEM/F12、N2、B27及NT4作为诱导分化剂定向诱导分化,分化好的细胞利用免疫荧光技术、流式细胞技术和RT-PCR鉴定。
结果在胚胎干细胞诱导分化成神经元后期,免疫荧光显示有GABA能神经元存在;RT-PCR结果证实有GABA能神经元正确分化的重要调控基因Viaat、Gad1和Gad2基因表达;流式细胞仪计数结果显示GABA阳性细胞约占总细胞数的(11.49±6.86)%。
结论小鼠胚胎干细胞经体外培养可以定向诱导分化成GABA能神经元,可作为神经移植的新来源。
[Abstract] ObjectiveTo investigate the possibilities of in vitro culture and differentiation of mouse embryonic stem cell to GABAergic neurons. MethodsMouse embryonic stem cells were cultured and induced into GABAergic neurons in serum-free cultural condition. Immunofluorescence,reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and flow cytometer assay were used to identify the properties of the differentiated cells. ResultsIn the later period of differentiation of embryonic stem cells into neurons,immunofluorescence showed that GABAergic neurons existed,RT-PCR results confirmed the important regulatory genes Viaat,Gad1 and Gad2 gene expression due to the correct differentiation of GABAergic neurons and flow cytometry analysis showed the GABA-positive cells accounted for about(11.49±6.86)% of the total cell number. ConclusionMouse embryonic stem cells can be induced into GABAergic neurons in vitro in serum-free cultural condition,providing a new source of nerve graft.[Key words]Embryonic stem cell; Induce; Differentiate; GABA干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的研究方兴未艾,且取得了一定成果,但由于其多取材于胚脑的神经干细胞,为日后临床应用埋下了伦理道德问题之患,并且受到供体来源短缺的限制[1]。
利用培育技术进行胚胎干细胞培养的操作步骤
利用培育技术进行胚胎干细胞培养的操作步骤胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，简称ESCs）是一种具有无限分裂潜能的细胞，可以分化成人体中任何类型的细胞。
这使得胚胎干细胞培养成为研究和治疗许多疾病的潜在方法。
在利用培育技术进行胚胎干细胞培养的操作步骤中，有几个关键的步骤是必须仔细考虑和执行的。
首先，需要获取胚胎。
这个过程通常是通过体外受精(In Vitro Fertilization，简称IVF)完成的。
医生会收集女性的卵子和男性的精子，然后将它们结合在一起，在实验室环境中进行体外受精。
这一步骤要确保卵子和精子的质量，并控制好培养环境的温度和湿度。
接下来，受精后的卵子会不断分裂，形成胚胎。
为了获取胚胎干细胞，最常用的方法是在胚胎发育到八细胞阶段时，将其分离成单个细胞。
这个过程被称为细胞扩增(Cell Expansion)。
细胞扩增的关键是确保每个细胞的健康和稳定性。
细胞扩增过程中，常常需要添加培养基和生长因子，以促进细胞的分裂和生长。
当细胞扩增到一定数量时，就可以开始进行胚胎干细胞的分化。
分化过程通常涉及将胚胎干细胞移植到特定的培养基中，并加入适当的生长因子和细胞信号转导分子。
这些因子和分子可以模拟人体内特定发育时期的信号，从而促使胚胎干细胞向特定种类的细胞分化。
例如，通过添加一种叫作“Noggin” 的蛋白质，胚胎干细胞可以被诱导分化为神经细胞。
分化的结果取决于培养的时间和添加的生长因子，以及其他培育条件的调节。
通过对胚胎干细胞的培养和分化过程进行精确控制，研究人员可以获得一系列不同类型的细胞，包括心脏细胞、肝细胞、胰岛细胞等。
这些特定的细胞类型可以应用于研究、药物测试和再生医学等领域。
需要注意的是，胚胎干细胞培养涉及许多伦理和法律问题。
在进行胚胎干细胞研究和应用时，必须确保遵守伦理准则和法律规定，保护人类生命和尊严。
总结来说，利用培育技术进行胚胎干细胞培养涉及从胚胎获取细胞、进行细胞扩增和细胞分化的过程。
胚胎干细胞体外定向诱导分化的研究进展
胚胎干细胞体外定向诱导分化的研究进展（姓名：李翔单位：宁夏师范学院化学与化学工程学院11级科学教育班）摘要：胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团分离培养出来的具有发育全能性或多能性的干细胞,具有多向分化潜能和自我更新的特性。
胚胎干细胞可以定向诱导分化生产组织和细胞,可为细胞移植提供无免疫原性的材料,为难以治愈的疾病的细胞移植治疗提供可能。
本文介绍了胚胎干细胞的诱导分化方法和应用。
关键词：胚胎干细胞;定向诱导分化;分化潜能;自我更新胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES 细胞)是从早期胚胎( 桑椹胚、囊胚) 或原始生殖细胞(primordial germ cell, PGCS)分离出来的能在体外永久培养的、具有多方向分化潜能和种系嵌合能力的细胞系。
ES 细胞具有多向分化潜能, 可分化形成外胚层、中胚层和内胚层细胞的谱系干细胞, 再成长为不同的神经、造血、肌肉,骨骼等各种细胞基于其特性,目前普遍认为, ES细胞对体外研究动物和人胚胎的发生发育, 基因表达调控, 药物的筛选和致畸实验及作为组织细胞移植治疗, 克隆治疗和基因治疗的细胞源及产生克隆和转基因动物等领域将产生重要的影响。
1998 年,T homson和Gearhart2 个研究组分别从人ICM和PGCS建立了人类ES细胞系, 在国际上引起了轰动。
Science 杂志将人类ES 细胞研究成果评为1999 年世界十大科技进展之首, 美国《时代》周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就之首, 并认为ES 细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域, 由此掀起了ES细胞研究的高潮。
1体外诱导 ES 细胞的原理在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。
在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。
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胚胎干细胞体外培养(一)胚胎干细胞的来源目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。
其中囊胚的ICM最为常用。
(二)胚胎干细胞的分离1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。
以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。
以PGCs取ES细胞时：小鼠取12.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或13.5～14.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。
2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。
从囊胚分离ICM的方法主要有三种：(1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。
这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。
(2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。
结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。
Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。
(3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。
由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。
组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。
(三)胚胎干细胞的培养和建系ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。
ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs成千上万的克隆。
目前建立ESCs系的方法有多种，常用方法包括以下过程：①原始ESCs 的获得：从受孕动物体内或体外受精卵培养中获得发育至桑葚胚或胚泡阶段的早期胚胎，用机械法分离、胰酶或胶原酶消化桑葚胚或胚泡内细胞团得到原始ESCs悬液。
②ESCs的传代培养：将原始ESCs悬液接种到经放射线照射或丝裂霉素C处理的成纤维细胞饲养层上进行培养。
培养1周左右，发现典型的ESCs集落，挑取细胞集落，用低浓度胰酶分散后，进行传代培养，3～5天传1次。
经反复传代培养，可获得生长旺盛的高纯度ESCs。
③ESCs 的鉴定。
由于ESCs来源于分裂增殖非常活跃的早期胚胎细胞，所以维持其生长代谢所需的营养要充足，用于ESCs培养的饲养层细胞培养基含高糖和谷氨酰胺，同时加胎牛血清、新生牛血清、2-巯基乙醇。
高糖的作用是提高ESCs的增殖速度，同时提供饲养层细胞生长所需的能量；谷氨酰胺作为细胞合成蛋白质与核酸的原料，是饲养层细胞培养基的必需品；2-巯基乙醇的作用为促进胚胎细胞的分裂增殖，并可还原血清中的含硫化合物，防止过氧化物对ESCs的损害。
1.胚胎干细胞的培养体系：(1)常规培养液：选择和配制高质量的培养基是体外培养ESCs的基本要求。
常用的培养基有MEM-α、DMEM、TCM-199、F12等合成培养基，以DMEM应用最为普遍。
再加入10%新生牛血清、10%胎牛血清、0.1mM 2-巯基乙醇、100μg/ml L-谷氨酰胺。
Thomson等建立恒河猴(rhesus monkey)ESCs系时，培养基中补加了1%的非必需氨基酸，结果ESCs生长良好。
Gardner和Lane发现，如果培养基中含有输卵管液中高浓度表达的氨基酸成分，胚胎卵裂、囊胚形成和孵化均显著增加。
(2)无血清培养基：血清中含有大量促细胞生长因子和多种营养物质，有促进细胞生长繁殖和黏附的作用，但血清中还含有许多未知的成分和一些分化诱导因子，不利于ESCs 未分化状态的维持。
为此人们尝试使用无血清培养液、化学合成培养液(chemically defined medium)进行ESCs的培养，加入刺激细胞生长的激素、细胞因子等，发现ESCs 增殖旺盛，且能保持未分化状态。
(3)条件培养基(conditioned medium，CM)：Martin曾应用小鼠畸胎瘤多能干细胞系PSA-1的条件培养基建立了小鼠ESCs系，后Axelrod对其进行了改良：将PSA-1畸胎瘤细胞接种于STO饲养层上，在含有10%胎牛血清的DMEM中贴壁培养，达到50%～75%汇合时更换培养液，用不含血清的DMEM培养基(加有10mg/ml转铁蛋白、10mg/ml 胰岛素)继续培养24小时，收集培养液，离心，去除细胞沉淀，上清液再经过0.22μm的微孔滤膜过滤，过滤后的PSA-1培养液再加入10%胎牛血清、0.1mM 2-巯基乙醇，即为PSA-1条件培养基。
使用前用含有10%胎牛血清、0.1mM 2-巯基乙醇的DMEM培养基稀释，PSA-1细胞分泌的细胞因子等活性物质的活性基本保持不变。
以后许多实验室制备了不同的条件培养基取代饲养层细胞来维持ESCs的生长，如BRL(buffalo rat liver cells)、PC10-6R转染的COS细胞、HBC-5637(5637 human bladder carcinoma cells)、RH-CM(大鼠心肌细胞条件培养基)等，这些条件培养基中都含有高浓度的细胞分化抑制因子，可以抑制ESCs的分化。
(4)饲养层(feeder layer)：饲养层是一层经过射线照射或丝裂霉素C处理后用作培养ESCs的底物细胞层。
饲养层细胞经射线照射或丝裂霉素C处理后，虽然失去分裂能力，但仍能保持生存，并有同化培养液的能力，为胚胎发育提供一些必需因子，如成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等促有丝分裂因子，LIF等细胞分化抑制因子，促进其增殖，抑制其分化，而且可以除去体外培养环境中的毒素。
目前常用的饲养层有：STO、PMEF(primary mouse embryonic fibroblast)、SNL(G418R基因和LIF基因转染的STO)、HBC-5637等。
其中PMEF以其易于取材、抑分化效果好等特点而被广泛应用。
制备饲养层时，取达到80%汇合的原代鼠胚成纤维细胞，加入含10μg/ml丝裂霉素C的培养液，作用2～4小时后，弃去培养液，用无Ca2+、Mg2+的Hank’s液洗涤培养细胞4～5次后，0.125%胰蛋白酶—0.02%EDTA消化制成细胞悬液，接种在涂有0.1%明胶的四孔板中。
安立龙等将小鼠ESCs置于衰老饲养层表面进行培养时发现，ESC集落松散，表面及周围形成许多颗粒细胞、巨型细胞和上皮样细胞，认为衰老饲养层能诱导小鼠ESCs的体外分化，所以建议使用新鲜制备的饲养层细胞来分离培养ESCs。
2.胚胎干细胞的获取：(1)早期胚胎细胞培养法：早期胚胎细胞培养法是将致密桑葚胚用0.3% EDTA将其离散为卵裂球，并单个培养在STO(原代胎儿成纤维细胞)饲养层上，在培养48～72小时后，出现ESCs集落。
(2)胚胎与饲养层细胞共培养法：将早期胚胎如桑葚胚、囊胚、扩张囊胚等放置在铺有STO或3T3饲养层细胞的培养液中培养，待胚胎贴壁、透明带脱落、ICM附着增生，出现鸟巢状集落时，挑出ICM，消化ICM为细胞小块，用等体积培养液或胎牛血清中和胰蛋白酶作用，将细胞小块接种在新饲养层上培养，就会获得ESCs。
(3)ICM与饲养层细胞共培养法：用免疫外科手术法剥除滋养层细胞，以STO细胞为饲养层，用ESCs条件培养基培养ICM细胞，也可获得ESCs，剥除滋养层的主要目的是防止滋养层细胞对ICM细胞的竞争抑制和诱导分化。
(4)原始生殖细胞与饲养层细胞共培养法：将原始生殖细胞PGCs接种于STO饲养层细胞表面，可获得人ESCs。
从人流产胎儿生殖嵴分离和克隆人ES细胞，克服了实验材料难以取得的困难，这将会促进与人ESCs相关研究的进行。
(5)裸胚与饲养层细胞共培养：用玻璃针刺破囊胚或桑葚胚透明带，将有破口透明带的胚胎置于培养液中培养，次日，ICM就从透明带中脱出贴附于饲养层。
透明带坚固、厚、不易破裂的动物胚胎贴壁缓慢，影响ICM增殖，切除透明带，有利于ICM增殖和ESCs 形成。
而透明带薄，易于破裂的胚胎贴壁不受影响，切除透明带等操作对ICM有不利影响，使ESCs形成率降低。
(6)热休克处理胚胎与饲养层共培养：当胚胎在体内发育至2细胞或桑葚胚时，从子宫中取2细胞胚胎或桑葚胚，将胚胎置于41℃持续1小时，增加胚胎ICM细胞。
采用热休克处理胚胎，桑葚胚发育至孵化胚的效率为87%，2细胞胚胎发育至囊胚的比率为85.0%。
在胚胎分裂的活跃期用热应激处理胚胎，阻制了胚胎分化，扩大了ESCs分离的时间范围。
(7)切割胚胎培养：对早期胚胎进行切割，使胚胎一分为二。
若2个半胚均含有ICM 和滋养层细胞，半胚可发育为扩大囊胚，大约有35%的半胚可贴附于子宫成纤维细胞滋养层，且对以后的胚胎和胎儿发育无影响。
这表明，用切割半胚可以分离ICM和ESCs。
(四)小鼠胚胎干细胞分离培养的实验室技术由于ESCs在一般体外培养条件极易分化而失去其多潜能性特点，故需掌握一定的培养技术才能保留其多向分化潜能和体外扩增两大特点。
目前，以小鼠ESCs体外培养技术最为成熟，本文将以小鼠ESCs为例，介绍ESCs体外培养和ESCs分离鉴定等实验技术。
1.培养基的准备：(1)ESCs培养液：以DMEM(高糖，葡萄糖含量要在4.5g/L以上)为基础液，加入以下成分：NaHCO3 2.2g/L谷氨酰胺2mM非必需氨基酸0.1mMβ-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)0.1mM或单硫甘油(monothioglycerol)0.15mM庆大霉素50μg/ml或青、链霉素各100IU/ml(必要时可不加抗生素)15%胎牛血清(FBS)或10%胎牛血清+10%新生牛血清(NBS)LIF(leukemia inhibitory factor)，可选择性加入，用饲养层细胞饲养ES细胞时，可以不加，或加入500～1 000IU/ml，无饲养层细胞饲养时要加1 000IU/ml以上。