小鼠胚胎干细胞培养
动物克隆 第三章胚胎干细胞分离培养
第三章胚胎干细胞分离培养1981年，Evens等首次发现小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)在体外具有稳定增殖并维持未分化状态及分化全能性潜能的特性，并成功建立小鼠ESCs系[1]。
由于ESCs独特的生物学特性，ESCs方面的研究迅速成为生命科学研究领域的热点之一，1999年－2000年连续两年被评为世界十大科技新闻。
ESCs已成为分子遗传学、发育生物学、细胞工程、组织工程等研究的重要工具，在研究细胞分化机制、临床治疗、转基因等方面有着重要的意义。
随着对干细胞研究的不断深入，人们将逐渐掌握和利用干细胞，还将推动相关学科的发展。
文章综述了ESCs的研究概况、体外分离培养、生物学特性、鉴定方法、影响ESCs分离培养的因素、存在问题以及应用前景等。
1 胚胎干细胞研究概况ESCs的研究最早要追溯到畸胎瘤细胞的发现，但真正意义上的开始却是1981年Evens等首先从延缓着床的胚泡分离培养到小鼠的ESCs，并建立小鼠的ESCs系，之后ESCs研究迅速发展，已在大鼠、仓鼠、猪、牛、水貂、兔、山羊、绵羊、恒河猴和人等多种哺乳动物上建立了类ESCs系[2]。
近几年来，ESCs研究在ESCs来源与培养方法、探索建立和维持ESCs系的条件、定向诱导分化、遗传操作、疾病动物模型的治疗等方面取得了一定的进展。
研究人员利用体细胞核移植技术进行胚胎重建，从克隆胚胎中成功得到小鼠、兔和人等多种哺乳动物ESCs[3-5]；利用孤雌激活技术建立小鼠和非人灵长类孤雌激活胚胎源的ESCs系[6]，这些为ESCs的分离克隆开辟了新的途径。
利用定向诱导分化技术成功将ESCs分化为造血细胞、内皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、胰岛细胞、心肌细胞、成骨细胞，甚至滋养层细胞和生殖细胞等所有3 个胚层的细胞类型[7-13]。
试验表明，人ESCs 能有效治疗心肌梗死、糖尿病、中风等疾病。
国内在ESCs方面的研究起步较晚，但发展迅速，在相关领域做了大量的研究。
《Bdh2基因敲除的小鼠胚胎干细胞的生物特性研究》范文
《Bdh2基因敲除的小鼠胚胎干细胞的生物特性研究》篇一摘要：本研究关注于Bdh2基因敲除的小鼠胚胎干细胞（ESCs）的生物特性研究。
通过基因编辑技术，我们成功构建了Bdh2基因敲除的ESCs模型，并对其细胞增殖、分化潜能、基因表达谱等方面进行了深入分析。
本文旨在解析Bdh2基因在小鼠ESCs中的作用，并进一步揭示其在生物医学研究中的应用潜力。
一、引言Bdh2基因，作为细胞内脂肪酸β-氧化途径的重要一环，其在生物体内具有至关重要的功能。
然而，Bdh2基因在小鼠胚胎干细胞中的具体作用尚未完全明确。
本研究旨在探讨Bdh2基因敲除对小鼠胚胎干细胞生物特性的影响，为研究其生物学功能提供理论基础。
二、材料与方法1. 材料实验选用的小鼠胚胎干细胞来自实验室前期培养的野生型和Bdh2基因敲除型ESCs。
2. 方法（1）通过CRISPR-Cas9技术，成功构建Bdh2基因敲除的小鼠胚胎干细胞模型；（2）运用细胞增殖实验、细胞周期检测、克隆形成实验等手段，研究Bdh2基因敲除对细胞增殖的影响；（3）采用实时定量PCR、免疫荧光等实验技术，探讨Bdh2基因敲除对小鼠胚胎干细胞分化潜能及基因表达谱的影响；（4）运用生物学信息分析方法，分析数据并绘制相关图表。
三、实验结果1. Bdh2基因敲除对小鼠胚胎干细胞增殖的影响实验结果显示，Bdh2基因敲除后，小鼠胚胎干细胞的增殖能力显著降低。
通过细胞周期检测发现，Bdh2基因敲除导致细胞周期停滞在G1期，S期细胞数量减少。
此外，克隆形成实验也证实了Bdh2基因敲除对细胞增殖的抑制作用。
2. Bdh2基因敲除对小鼠胚胎干细胞分化潜能的影响实时定量PCR和免疫荧光实验表明，Bdh2基因敲除后，小鼠胚胎干细胞的分化潜能发生改变。
在特定诱导条件下，Bdh2基因敲除的ESCs在向特定细胞类型分化的过程中出现障碍。
这表明Bdh2基因在小鼠胚胎干细胞的分化过程中发挥重要作用。
3. Bdh2基因敲除对小鼠胚胎干细胞基因表达谱的影响通过对Bdh2基因敲除前后小鼠胚胎干细胞的基因表达谱进行分析，我们发现一系列与细胞增殖、分化及代谢相关的基因表达发生改变。
影响小鼠孤雌胚胎干细胞的建系效率因素初探
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影 响小 鼠孤雌胚 胎 干细胞 的建 系效 率 因素初 探
陈志胜 吴 浩佳 刘林 。 ， ，
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【 摘要 】 目的
检测孤雌胚胎干细胞系的建系效率与小 鼠品系以及培 养体系的关系 。方 法
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小 鼠孤 雌
卵子 孤 雌 激 活 发育 至 囊 胚 ， 后从 囊 胚 内细胞 团分 离 孤 雌胚 胎 干 细 胞 。 结果 杂 交 和 近 交 系 小 鼠的 建 系 效 率 没 有 然
以间充质干细胞为饲养层分离培养昆明小鼠胚胎干细胞
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重庆医科大 学学报 ２ ０ ０ ９年第 ３ ４卷第 ４期 （ｏ ｒａ ｏ ｈ ｎ ｑｎ ｄｃ ｌ ｎｖ ｒｉ ０ ９ ＶＯ．４Ｎｏ４） Ｊ ｕｎ ｌ ｆ ｏ ｇ ｉ Ｍｅ ｉ ｉｅｓｔ ２ ０ ． １ ． Ｃ ｇ ａＵ ｙ ３
一
３３ 一 ９
基础研 究
文 编 ０ ３ ６ （ ０） — ９ ０ 章 号： ５ ３ ６ ０ ０ ０ ３ ４ ２— ２２ ９４ ３ —
Ｔ ｅ ｒ ｓ ｌ ｈ ｗｅ ｈ ｔ ． ｌ ｔ ｅ Ｅ ｅｌ ｈ ｄ ｉ ｐ ｃ ｌ ｒ ｈ ｌｇｃ ｌ ｈ ｒ ｃｅ ｉｔ ｓｓ ｃ ｓ ｎ ｓｌ ｅ ｃ ｌｎ ｅ ，ｏ ｎ ｒｅｌ ｔ ， ｉ ｈ ｅ ｕ ｔ ｓ ｏ ｄ ｔ ａ ：１ ａ ｌ ｈ Ｓ ｃ ｌ ａ ｔ ｔ ｉａ ｐ ｏｏ ｉａ ａａ ｔｒｓ ｃ ｕ ｈ ａ ｅ ｔｋ ｏｏ ｉｓ ｒ ｕ ｄ ｏ ｌ ｐ ｉ ｗ ｔ ｓ ｓ ｓｙ ｍｏ ｃ ｉ ｉ ｉ ｃ ｈ ｃｅ ｒ ｄ ｅ ａ ｄ ｓ ｏ ｈ ｓ ｒａ ｅ，ｔ ｎ ｅｒ ｃｉ ｎ ，ｉ ｎｆ ａ ｔ ｗｅｌ ｇ ｇ ｏ ｈ， ｏ ａ ｔｅ ｓ ｆ ｅｌ ｇ ｒｇ ｔ ｎ ａ ｄ ｉ ｄｓｉ ｃｉｎ ｂ ｔ ｅ ｎ ｔ ｏ ｌａ ｇ ｎ ｍｏ ｔ ｕ ｆ ｃ ｓｒ ｇｒ ｆ ｔ ｅ ｏ ａ ｏ ｓｇ ｉ ｃ ｎ ｌ ｎ ｒｗｔ ｃ ｍｐ ｃ ｎ ｓ ｌ ａ ｇａ ａ ｉ ｎ ｉｔ ｔ ｅ ｗ ｅ ｉ ｓ ｉ ｏｃ ｏ ｎ ｎ ｏ ｗ ｅ ｇ ｓｏ ｅｇ ｂ ｕ ｅｌ ｗｉ ｉ ｏｏ ｙ ｒ ｌｔ ｅｙｂ ｇ ｅ ｕ ｌａ ｏ ａ ｅ ｔ ｉ ｌ ｃ ｔｐ ａ ｍ ，．．ｈ ｇ ａｉ ｆ ｈ ｕ ｌａ － ｙｏ ｌｓ ； ｄ ｅ ｆ ｉｈ ｏ ｒｃ ｌ ｔ ｎ ａｃ ｌｎ ，ｅａｉ ｌ ｉｇ ｒ ｃ ｅ ｒｃ ｍｐ ｒ ｄ ｗｉ ｌ ｔ ｙｏ ｌｓ ｉ ， ｉｈ ｒ ｔ ｏ ｅ ｎ ｃｅ ｒ ｃ ｔｐ ａ ｍ ｎ ｓ ｈ ｖ ｎ ｈ ｔｅ ｅ ｏ ｔ ２ ａｔｒｔｅ ＡＫＰ ｓａｎ ｎ ａｌ ｆ ｈ ｅｌ ｈ ｗｅ ｔｏ ｇ ＡＫＰ ａ ｔ ｉ ｓ ｓ ｍｅａ ｈ Ｓ ｃ ｌ ｆＦ ａ ｄ ｏ ｅｃ ｎ ｒ ｒ ｔ ｅｅ ｒ ｏ ｉ ． ｅ ｆ ｈ ｔｉ ｉｇ， ｌ ｏ ｅＥＳ ｃ ｌ ｓ ｏ ｄ ｓｒ ｎ ｔ ｓ ｃｉ ｔ ａ ａ ｓｔ ｅ Ｅ ｅｌ ｏ ０， ｎ ｎ ｔ ｏ ｔａｙ， ｍｂ ｎ ｃ ｖｙ ｓ ｈ ｈ ｙ
小鼠胚胎干细胞体外诱导分化成GABA能神经元
小鼠胚胎干细胞体外诱导分化成GABA能神经元目的探讨小鼠胚胎干细胞在体外培养向GABA能神经元定向诱导分化的可能性。
方法将小鼠胚胎干细胞以“无血清”方法培养,用DMEM/F12、N2、B27及NT4作为诱导分化剂定向诱导分化,分化好的细胞利用免疫荧光技术、流式细胞技术和RT-PCR鉴定。
结果在胚胎干细胞诱导分化成神经元后期,免疫荧光显示有GABA能神经元存在;RT-PCR结果证实有GABA能神经元正确分化的重要调控基因Viaat、Gad1和Gad2基因表达;流式细胞仪计数结果显示GABA阳性细胞约占总细胞数的(11.49±6.86)%。
结论小鼠胚胎干细胞经体外培养可以定向诱导分化成GABA能神经元,可作为神经移植的新来源。
[Abstract] ObjectiveTo investigate the possibilities of in vitro culture and differentiation of mouse embryonic stem cell to GABAergic neurons. MethodsMouse embryonic stem cells were cultured and induced into GABAergic neurons in serum-free cultural condition. Immunofluorescence,reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and flow cytometer assay were used to identify the properties of the differentiated cells. ResultsIn the later period of differentiation of embryonic stem cells into neurons,immunofluorescence showed that GABAergic neurons existed,RT-PCR results confirmed the important regulatory genes Viaat,Gad1 and Gad2 gene expression due to the correct differentiation of GABAergic neurons and flow cytometry analysis showed the GABA-positive cells accounted for about(11.49±6.86)% of the total cell number. ConclusionMouse embryonic stem cells can be induced into GABAergic neurons in vitro in serum-free cultural condition,providing a new source of nerve graft.[Key words]Embryonic stem cell; Induce; Differentiate; GABA干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的研究方兴未艾,且取得了一定成果,但由于其多取材于胚脑的神经干细胞,为日后临床应用埋下了伦理道德问题之患,并且受到供体来源短缺的限制[1]。
昆明种小鼠胚胎干细胞的分离、培养与鉴定
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昆 明 种 小 鼠胚 胎 干 细 胞 的 分 离 、 养 与 鉴 定 培
陈 明玉（ 大连铁 路 卫生 学校 辽 宁 大连 １６ ０ ） １０ １
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小鼠胚胎干细胞的鉴定
小鼠胚胎干细胞的鉴定小鼠ES细胞的鉴定主要围绕ES细胞的形态、核型、分化潜能和特异性染色等方面进行。
一、形态学观察小鼠ES细胞的形态特点为圆形或扁圆形，表面平滑，体积较小，核质比大，有一个或多个凸起的核仁结构。
经培养后紧密聚集，细胞之间界限不清，形成岛状，巢状群体生长状态，集落边缘整齐，与滋养层细胞界限分明且色泽深亮，克隆的边缘可以看到比较清晰的单个细胞。
多次传代消化或改变培养基的成分，如降低血清浓度、去除LIF或碱性FGF等某些生长因子时，悬浮培养形成的细胞团开始出现松散，球形的边缘可以清楚地看到圆而大的细胞，细胞团开始自分化。
二、核型分析正常的二倍体核型特征是ES细胞全能性的基础，因此需要对所建立的ES细胞系的核型进行鉴定分析。
【实验材料】1.材料载玻片、镊子、离心管、移液管、吸管、35mm 培养皿（Corning，430165）。
2.试剂Demecolcine（Sigma，D6165）、Giemsa（Sigma，G4507）、NaH2 PO4（Sigma，S6566）、Na2HPO4（Sigma，S5136）、甲醇、冰醋酸。
配制类试剂：①磷酸缓冲液：0.2mol/L NaH2PO4+0.2mol/L Na2 HPO4；②Giemsa染液：8ml磷酸缓冲液+2ml Giemsa贮存液，吹吸混匀；③固定液：甲醇∶冰醋酸=3∶1（现用现配）。
【实验步骤】1.将需要做核型分析的ES传代，通常用一个35mm皿的细胞做核型，在传代后25～40小时向培养皿中加入0.2µg/ml democolcin，继续培养1～2小时。
2.取出培养皿，用标准传代的消化方法将其消化成单细胞悬液，1200r/min离心10分钟，弃上清，注意：上清要吸得彻底些。
3.加入事先预热至37℃的0.56%KCl低渗液4ml，用滴管吹打成单细胞悬液（较剧烈），37℃低渗处理15～20分钟。
4.配10ml固定液，4℃冰箱预冷。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化 ...
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）体外分化方法注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
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以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。
一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM（高糖）马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
冻存细胞冻存液90％HS和10％DMSO步骤：1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；2．用细胞刮刀收集细胞；3．将细胞转入15ml 离心管管内并离心3分钟；4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10 cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。
）5．分装于冻存管内，每管1ml；6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。
Geltin（明胶）包被准备500ml 0.1％geltin溶液1．将0.5 g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。
2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.22 μm滤膜过滤，贮存在4℃。
包被培养板或培养皿1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15 cm培养皿加2ml，10 cm培养皿加0.5～1 ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。
）；2．置室温30分钟；3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平放或倒扣，以免明胶污染盖子和流出培养板。
细胞传代建议每2天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。
纯化步骤包含在下面的方法中。
1．去除培养液；2．无钙镁PBS（Gibco）洗涤；3．加入胰酶EDTA（Gibco）。
37℃孵育5分钟。
4．加入ES培养基使胰酶失活；5．将细胞转入15 ml离心管中离心3min；6．去除上清，将细胞重悬于2 ml ES培养基，至少吹打10－20次。
如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。
ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。
这样可能会减少细胞的自然分化。
7．将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将保持悬浮）；8．将含有细胞的培养基转入geltin包被的组织培养皿。
吹打以确保细胞被分散开（前面已经提到－－ES细胞有聚集成团的倾向）9．建议按1：4－1：10的比率传代（ATCC）保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。
当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1来计算传代比率。
体外分化胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。
我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。
细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。
一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。
时间线（总时间为27～34天）第2步；4＋1天第3步；4－10天第4步；4天第5步；10－15天体外向心肌细胞方向分化胚胎干细胞在体外去除LIF情况下会自然向心肌细胞方向分化，小鼠的R1系一般在第7-8天自然出现搏动的心肌细胞，与胚胎发育时间线是完全一致的。
培养基EB配制一20×不含DMEM，FBS，LIF的溶液（该溶液也能用于ES培养基－－见前述）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
将21ml该溶液和50ml FBS 加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。
贮存于4℃。
贮存液DMEM（高糖）胎牛血清L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PEST（P104U/mlS104μg/mlITSFn ａnd N3（分化培养基）：配制一20×不含DMEM/F12的溶液。
分装在15ml 离心管中，（稀释为1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2μm滤膜过滤，贮存在-20℃。
将该溶液加入DMEM/F12中制备培养基，贮存于4℃。
贮存液DMEM（高糖）转铁蛋白50mg/ml胰岛素5mg/ml亚硒酸钠300μM黄体酮（20μM）腐胺（100μM）PEST（P104U/ml S104μg/ml）层粘连蛋白100μg/ml纤维连接蛋白250μg/ml碱性rhFGF, 10μg/ml*在第4步将bFGF加入N3培养基使终浓度为10ng/ml。
ITSFn ａnd N3培养基贮存液的准备使用无菌的溶剂和稀释液，在分装之前要对溶液进行过滤，如果因为某些原因溶液在分装之前没有进行过滤，需要在管子上标明以便别人在使用时知道该溶液不能直接用于细胞培养。
贮存液溶剂，贮存液，稀释剂和储存转铁蛋白50mg/ml胰岛素5mg/ml亚硒酸钠300μM黄体酮（20μM）腐胺（100μM）PEST（P104U/ml S104μg/ml）层粘连蛋白（100μg/ml）纤维连接蛋白（250μg/ml ）碱性rhFGF, （10μg/ml）包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）包被液的准备多聚-L-赖氨酸，15μg/ml把75ml多聚-L-赖氨酸和425ml 1×PBS混合。
贮存在4℃。
纤维结合蛋白，1μg/ml把0.5ml纤维结合蛋白和500ml 1×PBS混合。
包被过程：1．加入多聚-L-赖氨酸，至少2－3小时（过夜也行）2．吸出多聚-L-赖氨酸3．加入纤维结合蛋白，大约1－2小时4．吸出纤维结合蛋白，放置30分钟晾干5．贮存在4℃24孔板用200μl，6孔板用500μl。
震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻片或培养孔。
有时需要剧烈震荡培养板。
体外分化方法第1步：ES培养基在LIF存在的条件下维持细胞培养第2步：EB培养基使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
1．分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）2．纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15ml管中离心3分钟。
3．用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液4．一个15cm的细菌培养皿接种4～5×106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。
5．2天后更换培养基将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。
弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6．用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。
1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
形成胚状体需要4天时间。
在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。
这一天被认为是第2步和第3步的分界。
第3步－－ITSFn培养基在最少量培养基中选择神经前体细胞1．在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基2．并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3．保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基－－大约每隔一天。
观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。
当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。
步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6到第10天。
第4步－N3培养基＋bFGF通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。
1.PBS洗涤，加入1-2ml 胰酶2．37℃孵育5分钟3．用4mlEB培养基终止胰酶活性，将细胞转入锥形管中放置3～5分钟移出细胞团，将上清移入一新的离心管离心。
4．将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。
5．将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上（最好将盖玻片放于24孔培养板或6孔培养板，6孔培养板中每孔放置5个盖玻片如果是塑料的放置4个，以使最大可能的获得样品数量）。
24孔板接种3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。
6．2天后更换培养基第5步－N3培养基通过撤除bFGF使神经前体细胞分化1．细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基2．根据需要换液（大约每隔一天）3．分化10～15天后固定细胞移除培养基PBS洗涤加入4%福尔马林室温放置30分钟PBS洗涤2次储存于PBS。
长期储存使用含0.01％叠氮化纳的PBS移植细胞的准备细胞在胚状体形成4天以后被移植（相应于体外分化过程中的第2步末细胞被转种到组织培养板）。
正如在前文体外分化中所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。
通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10cm的培养皿。