小鼠胚胎干细胞
《2024年小鼠新型胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESC）的研究在生物学和医学领域中具有重大意义。
这些细胞具备自我更新和多向分化的潜能，为再生医学、疾病模型创建、药物筛选等多个领域提供了宝贵的资源。
近年来，随着对小鼠胚胎干细胞研究的深入，新型小鼠胚胎干细胞系的建立成为研究热点。
本文旨在详细介绍新型小鼠胚胎干细胞系的建立过程及研究进展。
二、研究背景与目的在生物医学领域，胚胎干细胞研究具有重要意义。
其具备分化成各种类型细胞的能力，使其在再生医学、药物筛选以及疾病模型研究中有着广泛应用。
而建立稳定、高效的胚胎干细胞系更是科学研究的重要前提。
目前，虽然已有多种小鼠胚胎干细胞系，但随着科研的深入，对于具有更高分化潜力、更低异源性的新型胚胎干细胞系的需求愈发迫切。
因此，本文研究的主要目的是建立一种新型的小鼠胚胎干细胞系，以满足科研需求。
三、实验方法1. 实验材料：选用特定品系的小鼠作为实验对象，准备相关实验试剂和仪器。
2. 胚胎获取：通过显微操作技术获取小鼠的早期胚胎。
3. 培养与分化：将胚胎置于特定培养基中，进行培养和诱导分化。
4. 筛选与鉴定：通过形态学观察、基因检测等方法筛选出具有多向分化潜力的细胞系。
5. 细胞系建立：对筛选出的细胞进行扩增和冻存，建立稳定的小鼠胚胎干细胞系。
四、实验结果1. 成功获取小鼠早期胚胎，并建立了稳定的体外培养体系。
2. 通过诱导分化实验，发现新型胚胎干细胞系具有较高的分化潜力。
3. 通过形态学观察和基因检测，成功筛选出具有多向分化潜力的细胞系。
4. 建立的小鼠新型胚胎干细胞系具有较低的异源性，稳定性好，可长期传代。
五、讨论与结论本文成功建立了新型小鼠胚胎干细胞系，其具有较高的分化潜力和较低的异源性。
这一新型细胞系的建立为再生医学、疾病模型创建、药物筛选等领域提供了新的资源。
同时，该细胞系的建立也为进一步研究胚胎干细胞的分化机制、调控网络等提供了有力工具。
小鼠胚胎干细胞培养
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。
一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM（高糖）马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
《2024年小鼠新型胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言随着生物医学技术的不断发展，干细胞研究在生命科学领域中扮演着越来越重要的角色。
其中，胚胎干细胞（ESC）作为一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞类型，已成为研究各种生物过程和疾病模型的热门研究对象。
本文旨在探讨小鼠新型胚胎干细胞系的建立过程及其在科研领域的应用价值。
二、材料与方法1. 实验材料本实验所需材料包括小鼠胚胎、培养基、生长因子等。
所有材料均需经过严格的质量控制，确保实验结果的可靠性。
2. 方法（1）胚胎获取与处理：从特定品系的小鼠中获取早期胚胎，并进行必要的处理，如去透明带等。
（2）干细胞培养：将处理后的胚胎置于特定培养基中，添加生长因子等必要成分，进行干细胞培养。
（3）干细胞系建立：通过细胞克隆、筛选等方法，建立新型胚胎干细胞系。
（4）细胞鉴定与表型分析：通过分子生物学技术对新型胚胎干细胞系进行鉴定，包括基因型、染色体稳定性等方面的分析。
三、实验结果1. 胚胎处理与干细胞培养结果经过适当的处理后，胚胎在特定培养基中成功附着并开始发育。
在适宜的条件下，干细胞得以增殖并形成克隆。
2. 新型胚胎干细胞系的建立通过细胞克隆、筛选等步骤，成功建立了新型胚胎干细胞系。
该细胞系具有自我更新能力和多向分化潜能，为后续研究提供了可靠的细胞来源。
3. 细胞鉴定与表型分析结果通过分子生物学技术对新型胚胎干细胞系进行鉴定，结果显示该细胞系基因型稳定，染色体无异常，具有较高的纯度。
此外，该细胞系在体外分化实验中表现出良好的分化潜能。
四、讨论1. 小鼠新型胚胎干细胞系建立的意义建立小鼠新型胚胎干细胞系对于研究生物学、医学等领域具有重要意义。
首先，该细胞系可用于研究小鼠胚胎发育过程及机制，为人类胚胎发育研究提供参考。
其次，该细胞系可分化为多种细胞类型，为疾病模型研究、药物筛选等领域提供可靠的细胞来源。
此外，该细胞系还可用于基因编辑、基因治疗等方面的研究。
2. 小鼠新型胚胎干细胞系的优点与挑战（1）优点：新型胚胎干细胞系具有自我更新能力强、分化潜能高、基因型稳定等特点，为科研工作者提供了可靠的细胞来源。
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言近年来，随着干细胞生物学技术的不断发展，干细胞在生命科学领域中的应用愈发广泛。
作为一项具有革命性的生物技术，干细胞在研究生物体的发育、生长以及治疗人类疾病方面展现出巨大潜力。
尤其是小鼠胚胎干细胞，由于具有分化潜能大、繁殖速度快、操作相对简便等优点，已成为科研人员研究的重要工具。
本文旨在探讨小鼠新型胚胎干细胞系的建立过程及其意义。
二、研究背景与目的小鼠胚胎干细胞系（mESCs）是生物学研究的重要工具，可用于研究发育生物学、疾病模型以及药物筛选等领域。
然而，现有的小鼠胚胎干细胞系存在一些局限性，如分化效率低、遗传稳定性差等问题。
因此，建立新型小鼠胚胎干细胞系，对于推动干细胞研究领域的发展具有重要意义。
三、材料与方法本研究采用小鼠胚胎组织作为起始材料，通过以下步骤建立新型胚胎干细胞系：1. 选取健康小鼠胚胎，进行无菌操作以获取胚胎组织；2. 消化胚胎组织，获得单细胞悬液；3. 将单细胞悬液接种于培养基中，培养一定时间后筛选出阳性克隆；4. 对阳性克隆进行遗传学分析，验证其基因组稳定性；5. 进一步对筛选出的细胞系进行分化潜能和增殖能力的评估。
四、实验过程与结果1. 细胞培养与筛选：通过优化培养条件，成功获得了一批生长良好的小鼠胚胎干细胞系。
在显微镜下观察，这些细胞形态均一，呈现出典型的干细胞特征。
2. 遗传学分析：通过基因组学和遗传学分析，验证了新型小鼠胚胎干细胞系的基因组稳定性。
结果显示，这些细胞系具有较低的突变率和较高的遗传纯合性。
3. 分化潜能评估：将新型小鼠胚胎干细胞系进行定向诱导分化，成功获得了多种组织细胞类型，如神经细胞、心肌细胞等。
这表明这些细胞系具有较高的分化潜能。
4. 增殖能力评估：通过细胞增殖实验，发现新型小鼠胚胎干细胞系具有较快的增殖速度和较高的存活率。
这为后续实验提供了充足的细胞来源。
五、讨论本研究成功建立了新型小鼠胚胎干细胞系，具有较高的基因组稳定性、分化潜能和增殖能力。
小鼠胚胎干细胞的分化特性研究
小鼠胚胎干细胞的分化特性研究小鼠胚胎干细胞是一种具有潜在分化能力的多功能细胞。
在适当的条件下，这些细胞可以分化为各种不同类型的细胞，包括心脏细胞、肝细胞、神经细胞等。
因此，小鼠胚胎干细胞已成为许多生命科学研究中的重要工具。
在研究小鼠胚胎干细胞的分化特性时，科学家们通常会采用一些特殊的技术。
例如，他们可能会在细胞培养基中添加特定的生长因子或化学物质，这些因子和化学物质能够促进或抑制细胞的分化。
此外，科学家们还常常通过转染技术，将某些关键的基因或转录因子导入到小鼠胚胎干细胞中，从而影响它们的分化。
通过这些技术，科学家们已经对小鼠胚胎干细胞的分化特性有了较为深入的了解。
例如，研究表明，小鼠胚胎干细胞具有向三个不同胚层分化的能力：外胚层、中胚层和内胚层。
这意味着这些细胞可以分化成形态和功能各异的细胞类型，包括皮肤细胞、消化道细胞、肌肉细胞等。
此外，研究还发现，小鼠胚胎干细胞的分化也受到许多因素的影响。
例如，细胞培养基中的生长因子浓度、培养时间以及引入的基因等都可能会影响它们的分化。
因此，在进行小鼠胚胎干细胞的分化研究时，科学家们需要谨慎操作，确保实验结果的准确性和可重复性。
除了研究小鼠胚胎干细胞的分化特性外，科学家们还探索了这些细胞在再生医学中的潜在应用。
例如，小鼠胚胎干细胞可以用于制造组织和器官，这有望在治疗某些疾病时发挥重要作用。
此外，这些细胞还可以用于药物筛选和毒性测试等领域。
尽管小鼠胚胎干细胞具有广泛的应用前景，但在实际应用中仍面临一些挑战。
其中一个关键问题是如何保证细胞的稳定性和纯度，以便于它们的应用。
此外，还需要进一步完善培养和分化技术，以提高细胞的分化效率和质量。
总之，小鼠胚胎干细胞的分化特性研究为生命科学领域的发展提供了新的机会和挑战。
通过进一步的研究和技术创新，科学家们有望更好地利用这些多功能细胞，推动再生医学领域的发展，并为人类健康做出更大的贡献。
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言近年来，小鼠胚胎干细胞（Mouse Embryonic Stem Cells, mESCs）在生命科学研究领域得到了广泛的应用。
它们在细胞生物学、发育生物学、疾病模型和药物研发等方面具有重要作用。
因此，建立稳定、高效的小鼠新型胚胎干细胞系是科学研究的关键任务之一。
本文将详细介绍小鼠新型胚胎干细胞系的建立过程及其潜在应用。
二、研究目的和意义本研究的目的是建立一种新型的小鼠胚胎干细胞系，旨在提高干细胞的分化潜能、稳定性以及可操控性。
这种新型胚胎干细胞系将有助于更好地研究细胞发育和分化机制，为疾病模型研究、药物研发和再生医学提供有力工具。
三、研究方法1. 实验材料与试剂：本实验采用小鼠胚胎组织作为起始材料，使用特定培养基和生长因子进行细胞培养。
2. 细胞培养：从早期胚胎中获取内细胞团（ICM），将其置于特定的培养条件下进行培养和扩增。
3. 细胞克隆和筛选：通过特定标记和筛选方法，从培养的细胞中筛选出具有干细胞特性的克隆。
4. 遗传和表型分析：对筛选出的干细胞进行遗传学和表型分析，评估其特性和稳定性。
5. 数据分析与统计：采用适当的统计方法对实验数据进行处理和分析，以验证实验结果的有效性。
四、实验结果1. 细胞培养与扩增：成功从早期胚胎中获取内细胞团，并培养成新型胚胎干细胞系。
经过多次传代，细胞保持稳定增殖。
2. 细胞克隆和筛选：通过特定标记和筛选方法，成功筛选出具有干细胞特性的克隆，并建立新型胚胎干细胞系。
3. 遗传和表型分析：新型胚胎干细胞系在遗传学和表型分析中表现出良好的稳定性和可操控性。
4. 数据分析与统计：通过适当的统计方法对实验数据进行处理和分析，验证了新型胚胎干细胞系的有效性和可靠性。
五、讨论本研究成功建立了新型小鼠胚胎干细胞系，具有较高的分化潜能、稳定性和可操控性。
与传统的胚胎干细胞系相比，新型干细胞系在细胞生物学、发育生物学、疾病模型和药物研发等方面具有更广泛的应用前景。
《2024年小鼠新型胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESC）的研究一直是生物学和医学领域的重要课题。
这些细胞具有自我更新和多潜能的特性，为再生医学、疾病模型、药物筛选等多个领域提供了巨大的研究潜力。
近年来，随着对小鼠胚胎干细胞研究的深入，新型小鼠胚胎干细胞系的建立显得尤为重要。
本文旨在详细介绍小鼠新型胚胎干细胞系的建立过程、方法和应用前景。
二、材料与方法1. 材料准备（1）实验动物：选择合适的小鼠品系作为供体，确保其遗传背景清晰。
（2）实验试剂：包括培养基、生长因子、抗生素等。
（3）实验设备：显微镜、培养箱、离心机等。
2. 方法（1）胚胎获取：从小鼠中获得早期胚胎。
（2）胚胎培养：将胚胎置于特定培养基中，加入生长因子，进行体外培养。
（3）干细胞诱导：通过特定方法诱导胚胎内细胞团向胚胎干细胞方向分化。
（4）干细胞系建立：经过筛选和扩增，建立稳定的小鼠胚胎干细胞系。
三、实验过程与结果1. 胚胎获取与培养通过超数排卵和人工授精等方法，从小鼠中获得早期胚胎。
将胚胎置于含有适当营养成分和生长因子的培养基中，置于适宜温度和湿度的培养箱中培养。
2. 干细胞诱导与分化通过特定方法诱导胚胎内细胞团向胚胎干细胞方向分化。
这一过程需要严格控制培养条件和时间，以确保干细胞的成功诱导和分化。
3. 干细胞系的建立与鉴定经过筛选和扩增，建立稳定的小鼠胚胎干细胞系。
通过细胞形态观察、生长曲线绘制、基因表达分析等方法，对干细胞系进行鉴定和评估。
四、讨论与分析1. 小鼠新型胚胎干细胞系的特点与优势新型小鼠胚胎干细胞系具有较高的分化潜能、稳定的遗传背景和良好的扩增能力等特点。
与以往的小鼠胚胎干细胞系相比，新型干细胞系在研究过程中具有更高的可靠性和实用性。
2. 小鼠新型胚胎干细胞系的应用前景（1）再生医学：小鼠新型胚胎干细胞系可用于研究细胞分化和组织再生，为再生医学提供新的治疗策略。
（2）疾病模型：通过基因编辑技术，可以构建特定疾病的小鼠模型，为疾病研究和药物筛选提供有力工具。
小鼠胚胎干细胞自我更新的信号调控机制
小鼠胚胎干细胞自我更新的信号调控机制在生命科学的广袤领域中，小鼠胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）自我更新的信号调控机制一直是备受关注的研究热点。
这不仅对于深入理解胚胎发育的奥秘至关重要，还为再生医学和疾病治疗带来了无限的可能。
要明白小鼠胚胎干细胞的自我更新机制，首先得清楚什么是胚胎干细胞。
简单来说，胚胎干细胞是一种具有全能性的细胞，它们有潜力分化成身体内的各种细胞类型。
而自我更新，则指的是这些细胞在保持未分化状态的同时，能够不断地分裂增殖，产生更多的相同类型的胚胎干细胞。
那么，是什么在背后操控着这一神奇的过程呢？其中，一系列的信号通路起着关键的调控作用。
首先，LIF/STAT3 信号通路在小鼠胚胎干细胞的自我更新中扮演着重要角色。
LIF（Leukemia Inhibitory Factor，白血病抑制因子）与细胞表面的受体结合后，激活了 STAT3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3，信号转导与转录激活因子 3）。
活化的 STAT3 进入细胞核，调控一系列与自我更新相关的基因的表达。
当 LIF 存在时，STAT3 被激活，促进胚胎干细胞的自我更新；而缺乏 LIF 时，STAT3活性降低，胚胎干细胞容易发生分化。
再者，BMP（Bone Morphogenetic Protein，骨形态发生蛋白）信号通路也对小鼠胚胎干细胞的自我更新有着重要影响。
BMP 与相应的受体结合后，通过一系列的信号转导，激活下游的 Smad 蛋白。
这些被激活的 Smad 蛋白会与其他转录因子相互作用，调节与自我更新和多能性相关的基因表达，从而维持胚胎干细胞的未分化状态。
除了上述两条主要的信号通路，还有其他一些因素也参与其中。
例如，Wnt 信号通路在小鼠胚胎干细胞的自我更新中也发挥了一定的作用。
当 Wnt 信号通路被激活时，它可以抑制胚胎干细胞的分化，促进其自我更新。
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为了避免批次差异对实验的影响，要根据实验计划
一次买足，避免中途更换，同时每个批次的血清要
用克隆形成效率检验。
部分血清在低浓度时效果很好，但高浓度
（如40%）时出现毒性，选择时要选择那些 高、低浓度效果均佳的血清。
由于专业技能和使用试剂批次的差异（特别
是胎牛血清），ES细胞的建系在不同实验室 变化很大。因此需要开发定义明确的培养条 件，如使用化学成分确定的血清替代物。
排卵雌鼠的胚胎数目较大。
这两种条件下，通常从3.5dpc动物子宫收集
胚胎，此时胚胎正好处于囊胚期，不需要进 一步培养即可用于建立ES细胞。
细胞核移植获得胚泡
利用显微操作方法把供体细胞核移植入去核 的受体卵母细胞中，然后经过活化后获得重 构胚胎的过程。
重构胚胎在体外发育到囊胚阶段后，一方面 可以移入受体动物体内以获得克隆动物，另 一方面，可以用于建立核移植胚胎干细胞系 (ntES)。而ntES 细胞可以在体外被诱导形成 特定的体细胞用于治疗。
显微外科法
小鼠受精后3-4天，利用显微操作系统直接从胚泡 中吸出内细胞团细胞进行培养。该方法需要专门 的仪器设备，技术要求较高，难以推广。
组织培养法
模拟体内胚泡的着床过程：在获取时，胚胎被透明 带(zona pellucida,ZP) 包围。体外培养时，ZP的变 薄、破裂将诱导囊胚向灭活的细胞饲养层贴附。 囊胚逐渐脱离ZP，开始向饲养层贴附，注意不要轻 易晃动培养板，至少保证孵育箱门关闭48小时，接 种2-3天后观察并更换培养基。 囊胚贴附后，细胞将很快贴着饲养层表面长出，随 后几天要注意观察，确定首次分散的最佳时机。
序一致。
karyogram of a mouse ES cell with 2n= 40. Color karyotyping demonstrates a trisomy for chromosome 8 and the absence of the Y chromosome
目前建立的大多数小鼠ESCs系都是XY型， XY型小鼠ESCs比XX型的核型容易维持。 XX型ESCs系在传代过程中常发生一条X染 色体缺失，不容易维持其二倍体核型，2条 X染色体存活似乎对细胞增殖不利。 ESCs保持核型完整与多种因素有关，如饲 养层细胞类型、细胞传代程序、培养液构 成及其稳定、细胞性别以及小鼠品系等。
1.7 病原体的排除
从活体动物衍化ES细胞，总是伴随着将动
物病原体传播到组织培养物的风险。因此， 要分别使用各自的培养基、试剂、超净台和
孵育箱，直至建立的细胞系经过筛查而确保
没有病原体。
二、影响小鼠ES细胞建系效 率的因素
2.1遗传背景
最容易衍生的小鼠品系是内交129亚系，但该
亚系存在特征描述不充分、解剖和行为异常的 缺点。
A 将高质量的囊胚接种在MEF上，准备进行ES细胞 的衍化；B 处于孵化后期的胚胎；C 贴附的胚胎； D 生长变大
E 可以见到ES样细胞区域; F 区域变大，适合 分散
首次分散的时间是成功建立ES细胞系最
关键的因素：分散太早，没有足够的细
胞量；太晚，细胞开始分化，形成特异 性的细胞类型而不再是ES样的克隆。
三、小鼠ES细胞系的特征描述
3.1 细胞形态
小鼠 ESCs大小处于7~18μm之间，胞核大，胞核内有多个 核仁，胞浆少，核质比高，与胚胎细胞相似。
体外培养时，ESCs呈集落状生长，形成隆起、致密、折光
性强和边界清晰的细胞集落，集落形态多呈岛状或鸟巢状，
呈圆性、椭圆性、纺锤性或梭形等，集落内细胞排列致密，
传代时要小心、反复吹打，使细胞分散成单细胞悬
液。如果接种的是小细胞团的话，就会引发ES细
胞分化。
1.6 ES细胞系的冻存
ES细胞系的质量的关键是确保其较低代数。早期
代数的细胞以后可以扩增出一个细胞系；在此过
程中，应该连续冻存每一代细胞。
最宝贵的早期代数瓶是很容易丢失的，因此除了
将这些“宝贝”用于开始的特征描述和扩增，不 要浪费在其他用途上。
胞培养的标准操作规程传代。通常把首次接种到
较大面积的细胞记为第一代。
1.5 ES细胞的传代培养
不要等到细胞铺满使培养基极度酸化时再传代；要
避免继续分裂的细胞死于极度拥挤和营养耗竭。
传代可望收获3×105个细胞/cm2，再以2×104个
/cm2的密度接种。规律更换培养基，大约3天左右
传一次代。
固定，Giemsa染色。通过形态和染色鉴定 ES细胞克隆。分化细胞的克隆着色浅淡。 计数克隆总数和ES细胞克隆占克隆总数的 比例。
2.3 提高效率的改良技术
初次接种时，将培养基中的FBS增加至
25%。 选用低糖DMEM，并在培养基中添加核 苷。 分离延迟发育的胚胎，即经卵巢切除和 使用孕酮而不能植入的胚胎 接种前使用免疫溶解法去掉囊胚外面的 滋养层细胞。
分散过程要注意使用温和的手段，将外
生物分散成含有5-10个的小细胞团。
1.4 首个ES细胞样克隆的扩增
经过首次分散后，通常生长缓慢，需要耐
心等待小克隆的出现，一旦确定细胞生长， 就要再次每天观察培养物。 可能三种生长情况：
非ES样/细胞类型的克隆生长；
主要为ES样克隆的生长；
ES样克隆和混合细胞类型克隆的生长。
第四课
小鼠胚胎干细胞 的培养和分化
内容提要
1.
2. 3.
小鼠ES细胞建系过程和关键所在
影响小鼠ES细胞建系效率的因素 小鼠ES细胞的特征描述
1.1 胚泡来源
延迟着床方法获得的延迟胚泡
自然状态下合笼获得的正常胚泡 超排卵法得到超排卵胚泡
通过核移植的途径获得重构胚,
进而获得胚
泡。
延迟植入囊胚步骤
DEVELOPMENTAL DYNAMICS 235:2460 –2469, 2006
1.2 饲养层准备
饲养层能够抑制ES 细胞的分化, 一般认为是 由于饲养层可以分泌白血病抑制因子( LIF) 以及成纤维细胞生长因子(FGF), 前者是释放 到培养基中, 后者结合在饲养层的细胞膜上。 有两种细胞可以充当饲养层细胞：STO细胞 和小鼠原代成纤维MEF细胞。
要求：新鲜配制、理想密度、代数较低。
STO成纤维细胞
STO细胞是来自SIM小鼠的成纤维细胞，广 泛用于多潜能畸胎瘤细胞及胚胎干细胞的培 养。
STO作为连续细胞系具有明显优点：连续传 代，易生长；但应特别注意保持STO细胞生 长的最佳条件，密度不能太高，传代20-30 次后，应重新复苏。
STO饲养层的制备
病原体检查不但有利于将来使用这些ES细 胞生成不含特殊病原体SPF动物，而且还有 利于避免将病原体传染给其他细胞培养物。 最常见的病原体是支原体。
3.3 核型分析
核型是指染色体组在有丝分裂中期的表型，包括染色
体数目、大小、形态特征等。
核型分析是指在对染色体进行测量计算的基础上，进
行分组、排队、配对并进行形态分析的过程。核型分
AP staining of mouse ES Cells
端粒与端粒酶
端粒是位于染色体末端的特殊DNA-蛋白质结 构, 由一段TTAGGG重复DNA序列及相关蛋 白质组成。其长度作为评估细胞分裂及细胞 衰老的生物时钟，它在每一次细胞分裂中都 会缩短50~100bp，但可以被端粒酶修复。
STO细胞在10cm培养皿中铺满后，用 DMEM/10%NCS+10μg/ml丝裂霉素C孵育 2-3小时。
PBS洗涤——胰酶消化——洗涤——培养 基重悬——接种明胶包被的培养皿备用 （不超过一周）。
STO feeder cell
MEF饲养层的制备
MEF取自交配日后12.5d的ICR孕鼠，3-6代
有人提出使用交替使用胎牛血清和血清替代
物的解决方案，可以达到75%的成功率（一 般是25%）。
集落形成试验检测培养条件
在6孔板中加入待测培养基（2ml/孔），添 加物为终浓度的两倍；如果检测血清，则 需要设置5%、10%和20%三种浓度。 ES细胞半铺满时，通过胰酶消化，最终用 无血清培养基分散ES细胞成单细胞悬液， 以103个/ml的密度重悬于生长培养基。 每孔加入2ml细胞悬液，使添加物在4ml终 体积中为1×，正常培养6-8天。
雌、雄合笼过夜，次晨检查雌鼠阴道栓，有 栓雌鼠分开饲养（记为0天）。
Hale Waihona Puke 第二天通过腹腔注射10μg它莫西芬和1mg Depo-Provera，来降低雌激素水平而保持孕 激素水平。
在第6-8天处死动物，冲洗宫腔获得延迟植入 囊胚，其个体较大，外观略粗糙，常有清晰 可见的ICM。
使用延迟植入囊胚并不影响胚胎的贴壁, 主 要是在ICM 的增殖方面明显地优于正常的胚 泡, 因此也对后来的ES 细胞集落的出现和生 长带来有利的影响。
析用于确定细胞系的性别以及检测可能存在的染色体
畸形。一个成系的ESCs系应该具有70%以上核型完整
的细胞。
核型分析方法
标准G带法：将中期染色体制片经过胰酶或热、碱 、尿素、去垢剂处理后再用 Giemsa染料染色后呈
现的染色体区带。一般至少需要分析20-30个中期
铺片。
ESCs核型分析方法与体细胞没有区别，总体上程
如果6天以后还未可见的细胞生长或只有非
ES样的克隆，即可放弃培养
A 混有多种细胞类型的克隆；B 已经分化了的非ES样细胞 C 典型ES样克隆； D 仅含ES细胞的小克隆
对于既有ES样克隆又有混合细胞类型的克隆的情 况，在轻柔分散后挑取单个的小克隆，转移到备 有新鲜培养基的新孔中培养。