小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
小鼠胚胎干细胞培养
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。
一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM（高糖）马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
《2024年小鼠新型胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言随着生物医学技术的不断发展，干细胞研究在生命科学领域中扮演着越来越重要的角色。
其中，胚胎干细胞（ESC）作为一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞类型，已成为研究各种生物过程和疾病模型的热门研究对象。
本文旨在探讨小鼠新型胚胎干细胞系的建立过程及其在科研领域的应用价值。
二、材料与方法1. 实验材料本实验所需材料包括小鼠胚胎、培养基、生长因子等。
所有材料均需经过严格的质量控制，确保实验结果的可靠性。
2. 方法（1）胚胎获取与处理：从特定品系的小鼠中获取早期胚胎，并进行必要的处理，如去透明带等。
（2）干细胞培养：将处理后的胚胎置于特定培养基中，添加生长因子等必要成分，进行干细胞培养。
（3）干细胞系建立：通过细胞克隆、筛选等方法，建立新型胚胎干细胞系。
（4）细胞鉴定与表型分析：通过分子生物学技术对新型胚胎干细胞系进行鉴定，包括基因型、染色体稳定性等方面的分析。
三、实验结果1. 胚胎处理与干细胞培养结果经过适当的处理后，胚胎在特定培养基中成功附着并开始发育。
在适宜的条件下，干细胞得以增殖并形成克隆。
2. 新型胚胎干细胞系的建立通过细胞克隆、筛选等步骤，成功建立了新型胚胎干细胞系。
该细胞系具有自我更新能力和多向分化潜能，为后续研究提供了可靠的细胞来源。
3. 细胞鉴定与表型分析结果通过分子生物学技术对新型胚胎干细胞系进行鉴定，结果显示该细胞系基因型稳定，染色体无异常，具有较高的纯度。
此外，该细胞系在体外分化实验中表现出良好的分化潜能。
四、讨论1. 小鼠新型胚胎干细胞系建立的意义建立小鼠新型胚胎干细胞系对于研究生物学、医学等领域具有重要意义。
首先，该细胞系可用于研究小鼠胚胎发育过程及机制，为人类胚胎发育研究提供参考。
其次，该细胞系可分化为多种细胞类型，为疾病模型研究、药物筛选等领域提供可靠的细胞来源。
此外，该细胞系还可用于基因编辑、基因治疗等方面的研究。
2. 小鼠新型胚胎干细胞系的优点与挑战（1）优点：新型胚胎干细胞系具有自我更新能力强、分化潜能高、基因型稳定等特点，为科研工作者提供了可靠的细胞来源。
小鼠胚胎干细胞
胞培养的标准操作规程传代。通常把首次接种到
较大面积的细胞记为第一代。
1.5 ES细胞的传代培养
不要等到细胞铺满使培养基极度酸化时再传代；要
避免继续分裂的细胞死于极度拥挤和营养耗竭。
传代可望收获3×105个细胞/cm2，再以2×104个
/cm2的密度接种。规律更换培养基，大约3天左右
传一次代。
3.4 酶活测定
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AP)是一 类单酯磷酸水解酶，通常在囊胚ICM及其衍 生的ES细胞也表现较高AP活性，而ES细胞 发生分化后， AP活性随之降低。 因此，尽管AP不是多潜能性细胞特异表达 ，但AP活性检测仍广泛用于确定这些细胞 是否处于未分化状态的标志之一。
有人提出使用交替使用胎牛血清和血清替代
物的解决方案，可以达到75%的成功率（一 般是25%）。
集落形成试验检测培养条件
在6孔板中加入待测培养基（2ml/孔），添 加物为终浓度的两倍；如果检测血清，则 需要设置5%、10%和20%三种浓度。 ES细胞半铺满时，通过胰酶消化，最终用 无血清培养基分散ES细胞成单细胞悬液， 以103个/ml的密度重悬于生长培养基。 每孔加入2ml细胞悬液，使添加物在4ml终 体积中为1×，正常培养6-8天。
病原体检查不但有利于将来使用这些ES细 胞生成不含特殊病原体SPF动物，而且还有 利于避免将病原体传染给其他细胞培养物。 最常见的病原体是支原体。
3.3 核型分析
核型是指染色体组在有丝分裂中期的表型，包括染色
体数目、大小、形态特征等。
核型分析是指在对染色体进行测量计算的基础上，进
行分组、排队、配对并进行形态分析的过程。核型分
《小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言随着生物医学研究的深入发展，小鼠作为实验室研究模型在生命科学领域中扮演着重要角色。
其中，小鼠胚胎干细胞（ES细胞）的建立与应用已成为研究热点。
孤雌胚胎干细胞系作为一种新型的细胞模型，具有独特的优势和潜力。
本文旨在介绍小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立过程、方法及意义。
二、材料与方法1. 材料（1）实验小鼠：选用特定品系的小鼠作为实验对象。
（2）实验试剂：包括培养基、生长因子等。
（3）实验设备：显微镜、培养箱等。
2. 方法（1）孤雌胚胎的获取与培养：通过超数排卵等方法获取孤雌胚胎，并在特定培养基中进行培养。
（2）二倍体孤雌胚胎干细胞的诱导与筛选：通过基因编辑技术等方法诱导孤雌胚胎形成干细胞，并筛选出二倍体细胞。
（3）细胞系的建立与鉴定：对筛选出的二倍体孤雌胚胎干细胞进行扩增和鉴定，建立稳定的细胞系。
三、实验过程1. 孤雌胚胎的获取与培养首先，通过超数排卵等方法获取小鼠孤雌胚胎。
随后，将孤雌胚胎放置在特定培养基中，提供适宜的生长环境。
2. 二倍体孤雌胚胎干细胞的诱导与筛选采用基因编辑技术等方法，对孤雌胚胎进行诱导，使其形成干细胞。
在诱导过程中，通过遗传学和表型分析等方法筛选出二倍体细胞。
3. 细胞系的建立与鉴定将筛选出的二倍体孤雌胚胎干细胞进行扩增，并对其基因型、表型等进行鉴定。
通过多次传代验证其稳定性和一致性，最终建立稳定的细胞系。
四、结果与讨论1. 结果（1）成功获取小鼠孤雌胚胎并建立适宜的培养体系。
（2）通过基因编辑技术成功诱导出二倍体孤雌胚胎干细胞。
（3）建立稳定的二倍体孤雌胚胎干细胞系，并对其基因型、表型等进行鉴定。
2. 讨论小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立对于生物医学研究具有重要意义。
首先，该细胞系为研究小鼠发育生物学、遗传学等领域提供了新的工具和模型。
其次，该细胞系具有独特的优势，如可快速扩增、遗传稳定等，为基因编辑、疾病模型构建等领域提供了有力支持。
《2024年小鼠新型胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESC）的研究一直是生物学和医学领域的重要课题。
这些细胞具有自我更新和多潜能的特性，为再生医学、疾病模型、药物筛选等多个领域提供了巨大的研究潜力。
近年来，随着对小鼠胚胎干细胞研究的深入，新型小鼠胚胎干细胞系的建立显得尤为重要。
本文旨在详细介绍小鼠新型胚胎干细胞系的建立过程、方法和应用前景。
二、材料与方法1. 材料准备（1）实验动物：选择合适的小鼠品系作为供体，确保其遗传背景清晰。
（2）实验试剂：包括培养基、生长因子、抗生素等。
（3）实验设备：显微镜、培养箱、离心机等。
2. 方法（1）胚胎获取：从小鼠中获得早期胚胎。
（2）胚胎培养：将胚胎置于特定培养基中，加入生长因子，进行体外培养。
（3）干细胞诱导：通过特定方法诱导胚胎内细胞团向胚胎干细胞方向分化。
（4）干细胞系建立：经过筛选和扩增，建立稳定的小鼠胚胎干细胞系。
三、实验过程与结果1. 胚胎获取与培养通过超数排卵和人工授精等方法，从小鼠中获得早期胚胎。
将胚胎置于含有适当营养成分和生长因子的培养基中，置于适宜温度和湿度的培养箱中培养。
2. 干细胞诱导与分化通过特定方法诱导胚胎内细胞团向胚胎干细胞方向分化。
这一过程需要严格控制培养条件和时间，以确保干细胞的成功诱导和分化。
3. 干细胞系的建立与鉴定经过筛选和扩增，建立稳定的小鼠胚胎干细胞系。
通过细胞形态观察、生长曲线绘制、基因表达分析等方法，对干细胞系进行鉴定和评估。
四、讨论与分析1. 小鼠新型胚胎干细胞系的特点与优势新型小鼠胚胎干细胞系具有较高的分化潜能、稳定的遗传背景和良好的扩增能力等特点。
与以往的小鼠胚胎干细胞系相比，新型干细胞系在研究过程中具有更高的可靠性和实用性。
2. 小鼠新型胚胎干细胞系的应用前景（1）再生医学：小鼠新型胚胎干细胞系可用于研究细胞分化和组织再生，为再生医学提供新的治疗策略。
（2）疾病模型：通过基因编辑技术，可以构建特定疾病的小鼠模型，为疾病研究和药物筛选提供有力工具。
《小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言近年来，小鼠胚胎干细胞（mESCs）在生物学和医学领域的应用越来越广泛。
而其中，二倍体孤雌胚胎干细胞系作为一种新型的细胞系，其独特的遗传特性和分化潜力使得其成为重要的研究工具。
本文旨在详细介绍如何建立小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系，以期为相关研究提供理论和实践参考。
二、材料与方法1. 实验材料（1）小鼠卵母细胞和受精卵（2）饲养层细胞（如STO细胞）（3）培养基、血清等培养材料（4）其他实验仪器和试剂2. 方法步骤（1）孤雌激活：采用化学或电刺激方法激活小鼠卵母细胞，使其进入孤雌发育状态。
（2）胚胎培养：将激活后的卵母细胞置于培养基中培养，使其发育成囊胚。
（3）干细胞诱导：从囊胚中分离出内细胞团，通过特定条件诱导形成胚胎干细胞。
（4）筛选和鉴定：通过遗传学和生物学特性对诱导出的干细胞进行筛选和鉴定，筛选出二倍体孤雌胚胎干细胞系。
三、实验过程与结果分析1. 孤雌激活与胚胎培养采用化学或电刺激方法成功激活小鼠卵母细胞，使其进入孤雌发育状态。
在适宜的培养条件下，卵母细胞发育成囊胚，囊胚结构完整，细胞数量和活力均达到实验要求。
2. 干细胞诱导与筛选从囊胚中分离出内细胞团，通过特定条件诱导形成胚胎干细胞。
在诱导过程中，观察到细胞形态变化，逐渐形成具有干性特征的细胞群。
通过遗传学和生物学特性对诱导出的干细胞进行筛选和鉴定，成功筛选出二倍体孤雌胚胎干细胞系。
3. 结果分析通过对筛选出的二倍体孤雌胚胎干细胞系进行遗传学和生物学特性分析，发现其具有稳定的遗传背景、较高的分化潜力和较低的异源性等特点。
与传统的mESCs相比，新型二倍体孤雌胚胎干细胞系在遗传学和生物学特性上具有一定的优势。
此外，通过实验数据比对和分析，我们还发现新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立过程中具有一定的可重复性和可操作性。
四、讨论与展望小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立为生物学和医学研究提供了新的工具。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤小鼠胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）是一类在小鼠早期胚胎内分化产生的多能干细胞。
培养和研究ESC可以为了解细胞发育和分化提供重要的实验材料。
下面将为您介绍小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤。
一、准备实验所需材料和器械：1.小鼠胚胎干细胞系（ES细胞系）。
2.ESC培养基：一般使用含有LIF（鼠胚性干细胞生长因子）的培养基，如DMEM/F12或DMEM培养基，添加血清、LIF等。
3.ESC传代培养基：与ESC培养基相同，但不含LIF。
4.ESC学习培养基：免LIF和血清的无血清培养基，可以用于学习ES细胞的分化能力。
5. ESC传递板（T25细胞培养板、10 cm细胞培养板等）。
6.培养皿：培养皿的选择可以根据不同的实验目的选用，如离体实验可以选择培养皿或培养碟等。
7.显微镜：用于观察和鉴定细胞形态。
8.细胞培养箱：用于多肽瓶、培养皿等细胞培养。
9.无菌注射器、移液器、离心管等常见实验器材，以及媒液和试剂。
二、实验步骤：1.将小鼠胚胎干细胞系解冻至细胞存储液解冻的方法，迅速转移到预先加热培养皿中。
添加完整的ESC培养基，将细胞孵育在37℃、5%CO2的培养箱中。
2.每两天更换一次ESC培养基，观察细胞的形态和生长情况。
当细胞接近80%的密度时，可以进行传代。
3.小鼠胚胎干细胞的传代通常采用机械法和酶解法两种方法。
机械法是直接使用离心管头吸吸细胞，然后用超声波吹散细胞，最后转入新的培养皿中。
酶解法则是先用胰酶等酶溶解细胞，形成单细胞悬液，然后接种入新的培养皿中。
4.传代完成后，继续在37℃、5%CO2的培养箱中培养细胞，并定期更换培养基。
5.ESC的分化实验通常采用去除LIF和血清的无血清培养基。
将小鼠胚胎干细胞移到含有学习培养基的培养皿中，观察和记录细胞的分化情况。
6.对于特定的实验要求，如体外器官培养、离体实验等，可以将小鼠胚胎干细胞移至特定的培养皿或装置中，进行相关实验。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化 ...
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）体外分化方法注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
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细胞的原代培养点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园一、原代细胞培养原理原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。
借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。
• 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养• 掌握无菌操作技术• 了解小鼠解剖操作技术• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤•了解培养细胞的消化分散• 了解倒置显微镜的使用二、实验材料• 实验动物：孕鼠或新生小鼠• 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇•器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法三、胰酶消化法（1）胰酶消化法操作步骤——取材a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。
e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。
f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。
继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。
（2）胰酶消化法操作步骤——切割a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。
b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。
c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。
e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。
e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。
（4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次。
b.静置，吸去上清，用平衡盐溶液漂洗消化后的组织块，用吸管反复吹打组织块，使细胞分离，静置，使未分散的组织块下沉。
c. 取细胞悬液接种至加了细胞生长液的培养瓶中（调整细胞浓度到5×105/ml左右），37℃下培养。
（注意：省略了离心、计数等步骤）一、实验器材：手术小直剪刀三把、眼科直镊子三把、眼科弯镊子两把、玻璃平皿三套、200目尼龙滤网、50ML、15ML离心管和手术刀片。
以上物品均需要高压灭菌消毒处理。
二、实验试剂：无Ca+2和Mg+2的PBS、0.05%胰酶0.53mmol/L EDTA溶液、小鼠胚成纤维细胞（MEF）生长培养基:高糖DMEM加10%FCS。
`三、实验动物：孕期14至16天的孕鼠四、实验步骤：1. 处死孕鼠，置于75%酒精里全身浸泡，然后在超净台中用一把剪刀和一把镊子把孕鼠外皮剪开，用另外一把剪刀和一把镊子把内皮剪开，露出子宫，最后用第三把剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。
2.用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30MLPBS的50ML离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉PBS，再重复此步骤一次，留少许PBS 将胚胎转移到另一装有PBS的平皿中，用手术刀片将其细细切碎。
3.用200ul的移液枪反复快速吹打平皿中的液体，放在15ML离心管中，4℃1500rpm离心5分钟，倒掉上清，加10ML胰酶，重悬沉淀，放37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。
4.将上层细胞悬液倒入一装有10MLMEF生长培养基的50ML离心管中，用200目尼龙滤网过滤后，1500rpm离心5分钟收集细胞。
30ML MEF生长培养基洗涤两次（此步骤中作者试过用无血清的培养基洗涤，结果无差别）。
5.细胞沉淀用15ML生长培养基悬起，细胞计数（八只14天胎鼠可获得2-3×107细胞）。
6细胞悬浮于15ML MEF生长培养基中，接种到200ML的培养瓶中。
7.24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。
8 E. n8.细胞长满后，先用PBS冲洗，倒掉，加胰酶消化（此步时间不宜过长，作者一般不超过五分钟），按1：5传代9.细胞再次长到覆盖率80-90%左右，将其消化后，常规冻存。
（冻存液要现配）4五、实验结果：六、讨论：1.原代培养，一定要避免污染。
" i+ K1 h# d$ i4 S6 y6 o3 F2. MEF生存能力有限，如果不冻存，体外存活十代左右。
3. 冻存后复苏的细胞只能传代一次，因为这些细胞繁殖能力有限。
4. 消化细胞时间不要过长小鼠胚胎干细胞培养实验步骤1、一般培养——保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代2 、体外分化培养基：包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）体外分化方法注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。
一般培养——维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0. 1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活*。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES：配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM（高糖）马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒*，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：1、从液氮中取出一管细胞；2、将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3、将细胞转移到一15ml Falcon管中；4、加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5、离心3分钟；6、弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7、种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8、孵育。
冻存细胞冻存液：90％HS和10％DMSO步骤：1、1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；2、用细胞刮刀收集细胞；3、将细胞转入15ml 离心管管内并离心3分钟；4、弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10 cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。
）5、分装于冻存管内，每管1ml；6、置－80℃过夜，第二天移入液氮。
Geltin（明胶）包被准备500ml 0.1％geltin溶液1、将0.5 g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。
2、最好在溶液没有冷却的情况下通过0.22 μm滤膜过滤，贮存在4℃。
包被培养板或培养皿1、加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15 cm培养皿加2ml，10 cm培养皿加0.5～1 ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。
）；2、置室温30分钟；3、去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平放或倒扣，以免明胶污染盖子和流出培养板。
细胞传代建议每2天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。
纯化步骤包含在下面的方法中。
1、去除培养液；2、无钙镁PBS（Gibco）洗涤；3、加入胰酶EDTA（Gibco）。
37℃孵育5分钟。
4、加入ES培养基使胰酶失活；5、将细胞转入15 ml离心管中离心3min；6、去除上清，将细胞重悬于2 ml ES培养基，至少吹打10－20次。
如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。
ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。
这样可能会减少细胞的自然分化。
7、将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将保持悬浮）；8、含有细胞的培养基转入geltin包被的组织培养皿。
吹打以确保细胞被分散开（前面已经提到--ES细胞有聚集成团的倾向）9、建议按1：4－1：10的比率传代(ATCC)保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。
当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1来计算传代比率。
体外分化胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。
我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。
细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。
一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。
时间线（总时间为27～34天）第2步；4＋1天第3步；4－10天第4步；4天第5步；10－15天体外向心肌细胞方向分化胚胎干细胞在体外去除LIF情况下会自然向心肌细胞方向分化，小鼠的R1系一般在第7-8天自然出现搏动的心肌细胞，与胚胎发育时间线是完全一致的。
培养基EB配制一20×不含DMEM，FBS，LIF的溶液（该溶液也能用于ES培养基--见前述）。