小鼠胚胎干细胞克隆形成和传代的影响因素_
饲养层与干细胞的体外培养
饲养层与干细胞的体外培养岑妍慧;蓝丽霞【摘要】The culture of stem cells in vitro requires the maintenance of stem cell undifferentiated state and potent proliferative capacity.Therefore, primary or initial culture of stem cells in vitro depends on feeder cells and growth factors secreted by stem cells.Feeder cells can promote the attachment of embryonic stem cells and simultaneously release some cytokines that enhance stem cell proliferation but suppress differentiation.The feeder cells used for the culture of stem cells in vitro vary greatly among laboratories.%干细胞的体外培养要求在保持其未分化状态的同时,还要保持其旺盛的分裂增殖能力,所以在原代或初期培养时,干细胞的体外培养依赖饲养层细胞及其分泌的生长因子,饲养层细胞一方面可促进胚胎干细胞的附着,另一方面可分泌一些促干细胞增殖并抑制其分化的细胞因子,不同实验室在体外培养干细胞过程中所使用的饲养层细胞有所不同,故在此予以综述.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2011(017)009【总页数】2页(P1292-1293)【关键词】饲养层;干细胞;体外培养【作者】岑妍慧;蓝丽霞【作者单位】广西中医学院组织学与胚胎学教研室,南宁,530001;广西中医学院组织学与胚胎学教研室,南宁,530001【正文语种】中文【中图分类】R326干细胞可来源于胚胎、胎儿组织和成年组织，是一类具有自我更新能力、多向分化潜能和保持未分化状态的细胞。
小鼠胚胎干细胞培养
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。
一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM（高糖）马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
细胞克隆实验过程及原理
细胞克隆实验过程及原理细胞克隆实验，听起来是不是有点高大上的样子？别担心，今天我就给大家扒一扒这个看似复杂的实验到底是个什么玩意儿！细胞克隆实验其实就是在实验室里把细胞像复制粘贴一样，生生造出一大堆一模一样的细胞。
说到这儿，你可能会问，为什么要这么做呢？哎，细胞克隆可不是为了让我们在朋友圈里发“我有一模一样的姐妹”那种图啊，而是为了科学研究、医疗应用和一些生物技术的开发。
现在，咱们就一步一步地来看这个过程和原理。
1. 实验准备1.1 材料准备在做细胞克隆实验之前，得准备好一堆材料。
首先，咱们需要细胞源。
可能是小鼠的细胞，也可能是人类的细胞，当然，如果你能找到外星细胞，那也是可以的，哈哈！然后呢，还得准备培养基，简单来说就是细胞的“饭”。
没有好吃的，细胞可不乐意生长啊。
再来就是培养器皿，比如培养皿、试管啥的。
这些都是细胞的“家”，细胞在里头就像人在家里待着一样，舒服得很。
还有一些必要的工具，比如移液管、显微镜，这些就像是科学家的“武器”，帮助我们观察和操作。
1.2 实验环境别忘了实验环境也很重要哦！细胞对环境要求可高了，温度、湿度、pH值都得调得刚刚好，简直比我对房间的温度要求还要严格。
实验室要保持无菌，这就像是在大厨做菜时要保持厨房的干净，细胞才不会被细菌“袭击”。
2. 克隆过程2.1 细胞分离接下来，咱们就进入核心环节——细胞分离。
首先，用一些酶把细胞从组织里分离出来，想象一下就像是把苹果从果皮里挖出来。
分离好的细胞会被放到培养基里，像是在自家的小厨房里吃饭。
经过一段时间，它们就开始在这片“美食”中慢慢繁殖。
2.2 细胞传代等细胞长得差不多了，我们就得进行传代了。
这个过程简单来说就是把一部分细胞移到新的培养皿里，就像是把一些小草莓移植到新的土壤里继续生长。
这样一来，细胞就能在新的地方继续繁殖，越来越多。
随着时间的推移，细胞会不断分裂、复制，最终形成一个细胞克隆群体。
3. 观察与分析3.1 显微镜观察当克隆细胞繁殖到一定数量时，我们就可以用显微镜来观察这些细胞。
动物体细胞克隆的方法、意义、及所遇到的问题
讨论题目：动物体细胞克隆的方法、意义、及所遇到的问题1讨论内容1.1体细胞克隆的方法(1)、供体细胞系的建立(2)、供体细胞的同期化处理(3)、卵母细胞的体外成熟(4)、卵母细胞核的去除(5)、供体核的移植(6)、供体细胞与去核卵的融合(7)、重构胚的体外激活(8)、重构胚的体外发育(9)、胚胎移植受体的同期化处理(10)、胚胎移植(11)、妊娠检查(12)、克隆动物出生(13)、进行DNA亲子鉴定1.2体细胞克隆的意义1、动物体细胞克隆可以复制出的数量巨大的优良个体，因此动物克隆技术可以首先应用于畜牧业育种上2、如果将个体克隆技术用于能够生产特殊医药蛋白的转基因动物，将会产生巨大的经济效益。
3、在理论上直接利用个体克隆技术可以研究细胞发育过程中不同基因的表达规律和调节控制机理，这将对细胞发育生物学的发展产生重要的影响。
4、建立起稳定的动物模型，利于研究人类疾病的发病机理，揭示基因结构和功能间的关系，揭示生命的本质。
5、克隆技术还可用于抢救和保护珍稀动物。
利用胚胎分割、核移植和干细胞培养等克隆技术直接“复制”和繁育珍稀动物。
大熊猫、东北虎、娃娃鱼、扬子鳄等珍稀野生动物都可以通过克隆技术来加以抢救和保护。
6、克隆技术还可以用于医学，为人类遗传疾病的研究提供动物模型，为人类器官移植提供便利。
另外，克隆技术可以运用于转基因技术，以提高转基因效率。
1.3 体细胞克隆所遇到的问题a、克隆将减少遗传变异，通过克隆产生的个体具有同样的遗传基因，同样的疾病敏感性，一种疾病就可以毁灭整个由克隆产生的群体。
可以设想，如果一个国家的牛群都是同一个克隆产物，一种并不严重的病毒就可能毁灭全国的畜牧业。
b、克隆技术的使用将使人们倾向于大量繁殖现有种群中最有利用价值的个体，而不是按自然规律促进整个种群的优胜劣汰。
从这个意义上说，克隆技术干扰了自然进化过程。
c、克隆技术是一种昂贵的技术，需要大量的金钱和生物专业人士的参与，失败率非常高。
2025届高中生物学一轮复习检测案41 动物细胞工程(含解析)
检测案41动物细胞工程[基础巩固练]考点一动物细胞培养与体细胞克隆1．下列关于动物细胞工程的叙述，正确的是（）A.用胰蛋白酶处理动物组织后，可用培养液将分散的细胞稀释制成细胞悬液B．少数细胞在连续培养50代后可获得不死性，是某些基因选择性表达的结果C．根据在高倍镜下观察到基因突变的比例可推知某化学药品的毒性D．PEG诱导动物细胞融合形成的杂种细胞，经动物细胞培养能得到优良动物个体2．[2024·九省联考·贵州]利用动物体细胞核移植技术可培育高产奶牛，流程如图所示。
下列叙述错误的是（）A．犊牛W有母牛X细胞中的线粒体DNAB．犊牛W的遗传性状与母牛X相似度更高C．重构胚的形成可采用电融合的方法D．细胞培养时需添加氨基酸等营养物质3．如图为肾脏上皮细胞培养过程示意图，下列叙述不正确的是（）A．甲→乙过程需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理B．丙过程指细胞在添加血清的合成培养基中进行原代培养C．丙和丁过程均会出现细胞贴壁和接触抑制现象D．丁过程是传代培养的细胞，该过程体现了动物细胞的全能性4．我国科学家首次通过把食蟹猴的胚胎干细胞注射到猪的胚胎中，培育出了“猪—猴嵌合体”仔猪（如图所示），这项研究的最终目的是在动物体内培养人体器官用于器官移植。
下列相关叙述错误的是（）A.胚胎干细胞培养过程中细胞会因接触抑制而停止分裂，需用胰蛋白酶处理后继续培养B．采集的卵母细胞需培养至减数分裂Ⅰ后期才能与获能精子受精，进而获得猪胚胎C．从食蟹猴囊胚期胚胎的内细胞团获取的胚胎干细胞具有发育成各种组织、器官的潜能D．该技术有望将人的胚胎干细胞注入猪早期胚胎内，培育出完全由人体细胞组成的器官考点二细胞融合与单克隆抗体5．如图为单克隆抗体制备过程示意图，图中X、Y细胞分别是（）A．T淋巴细胞、骨髓瘤细胞B．T淋巴细胞、杂交瘤细胞C．B淋巴细胞、骨髓瘤细胞D．B淋巴细胞、杂交瘤细胞6．单克隆抗体在多种疾病的诊断和治疗中发挥重要的作用，下图为利用小鼠制备单克隆抗体的过程，下列有关叙述正确的是（）A．提取脾B淋巴细胞有多种，是因为一种抗原可诱导产生多种B细胞B．诱导动物细胞融合的方法与诱导植物细胞原生质体融合的方法完全相同C．在具有杂交瘤细胞的培养板上滴加相应抗体，出现阳性反应的即为目标细胞D．筛选出的目标杂交瘤细胞可在体外条件或注射到小鼠腹腔内进一步增殖培养7．[2024·九省联考·安徽]单克隆抗体在疾病诊断治疗和病原体鉴定中发挥重要作用。
细胞克隆形成实验注意事项
细胞克隆形成实验注意事项细胞克隆是一种重要的实验技术，可以用来研究细胞生物学、疾病发生机理、药物筛选等方面。
然而，进行细胞克隆实验时需要注意一些细节，以确保实验的准确性和可重复性。
以下是一些细胞克隆形成实验的注意事项。
一、实验前的准备工作1.准备培养基和培养皿选择适合细胞生长的培养基，并在实验前将其预热至37°C。
同时，清洁和消毒培养皿，避免细菌和真菌的污染。
2.校准培养条件保持培养室和实验室的温度、湿度和CO2浓度在适宜值，可以通过温度计、湿度计和CO2计进行监测和校准。
3.准备细胞悬液将需要克隆的细胞悬液均匀搅拌，确保细胞的均一性和活力。
4.准备实验仪器和试剂根据实验需要准备好显微镜、离心机、培养箱、培养皿等仪器，以及细胞传代所需的酶解液、胰酶等试剂。
二、细胞传代前的操作1.检查细胞形态在进行细胞传代前，用显微镜观察细胞的形态和数量，确认细胞悬液的质量和纯度，避免由于细胞的老化或污染导致实验结果的不准确。
2.离心分离细胞将细胞悬液离心分离，去除培养基和杂质，以保证下一代细胞的生长环境和纯度。
3.酶解细胞使用合适的酶解液和酶，对细胞进行酶解，以分离细胞并保持其活力。
4.计数细胞用血细胞计数板或细胞计数仪对酶解后的细胞悬液进行计数，确保每一次传代的细胞数量精确。
5.调整细胞密度根据实验需要，调整细胞的密度，使之适合于进行克隆实验。
三、细胞克隆实验中的注意事项1.选择合适的细胞密度在进行细胞克隆实验时，要保证每个克隆在培养皿中有足够的空间，避免细胞之间的相互影响和竞争。
2.设计合理的对照组在进行细胞克隆实验时，要设计好对照组，以便比较实验组和对照组之间的差异。
3.查看细胞生长状态在进行细胞克隆实验过程中，经常观察和记录细胞的生长状态，包括形态、数量和分化情况等，及时发现并解决问题。
4.避免细菌和真菌污染在进行细胞克隆实验时，要保持实验环境的清洁和消毒，避免细菌和真菌的污染，影响实验结果的准确性。
干细胞生物学试题及答案
干细胞生物学试题及答案一、单项选择题（每题2分，共20分）1. 干细胞的定义是指能够自我更新和分化成多种细胞类型的细胞，以下哪项描述不正确？A. 干细胞具有自我复制的能力B. 干细胞可以分化成多种细胞类型C. 干细胞是完全分化的细胞D. 干细胞存在于所有多细胞生物中答案：C2. 下列哪种细胞不是干细胞？A. 造血干细胞B. 神经干细胞C. 肌肉细胞D. 胚胎干细胞答案：C3. 干细胞的分化潜能是指干细胞能够分化成哪些类型的细胞，以下哪项描述不正确？A. 多能干细胞可以分化成多种细胞类型B. 单能干细胞只能分化成一种细胞类型C. 专能干细胞只能分化成特定类型的细胞D. 胚胎干细胞具有全能性，可以分化成所有细胞类型答案：B4. 干细胞研究中，以下哪项技术不是用于干细胞的分离和纯化？A. 流式细胞术B. 磁珠分离C. 组织培养D. 基因编辑答案：D5. 以下哪种疾病不是干细胞治疗的潜在应用领域？A. 糖尿病B. 帕金森病C. 癌症D. 脊髓损伤答案：C6. 干细胞的微环境，也称为干细胞龛，对干细胞的哪些特性有重要影响？A. 自我更新B. 分化潜能C. 细胞凋亡D. 所有以上答案：D7. 以下哪种细胞表面标记不是造血干细胞的特征？A. CD34B. CD45C. CD133D. CD19答案：D8. 干细胞的体外培养中，以下哪项不是常用的培养基成分？A. 血清B. 细胞因子C. 抗生素D. 植物激素答案：D9. 以下哪种技术不是用于干细胞的基因编辑？A. CRISPR-Cas9B. TALENsC. RNA干扰D. 锌指核酸酶答案：C10. 干细胞的移植治疗中，以下哪项不是评估移植效果的重要指标？A. 移植细胞的存活率B. 移植细胞的分化情况C. 移植细胞的免疫原性D. 移植细胞的形态特征答案：D二、多项选择题（每题3分，共15分）11. 干细胞的来源可以包括哪些？A. 成体组织B. 胚胎C. 诱导多能干细胞D. 胎儿组织答案：ABCD12. 干细胞研究中，以下哪些因素可能影响干细胞的分化？A. 细胞因子B. 细胞外基质C. 机械力D. 温度答案：ABC13. 以下哪些是干细胞治疗的潜在风险？A. 免疫排斥反应B. 肿瘤形成C. 伦理问题D. 技术难度答案：ABC14. 以下哪些是干细胞研究中常用的动物模型？A. 小鼠B. 大鼠C. 斑马鱼D. 果蝇答案：ABCD15. 以下哪些是干细胞研究中的伦理问题？A. 胚胎干细胞的使用B. 克隆技术C. 基因编辑D. 动物实验答案：ABCD三、判断题（每题2分，共10分）16. 干细胞是所有多细胞生物中都存在的细胞类型。
2.2 动物细胞工程(第3课时 动物体细胞核移植技术和克隆动物)
2.2 动物细胞工程第3课时动物体细胞核移植技术和克隆动物一、单选题1.随着生物科学技术的发展，动物的生殖方式变得越来越多样化。
如图表示胚胎工程技术研究及应用的相关情况，供体1是良种荷斯坦高产奶牛，供体2是健康的黄牛，下列相关叙述错误的是（）A. 应用1中获得的良种小牛，遗传物质来源于供体1和供体2个体B. 应用2、3、4所用的受精卵只能来源于体外受精，且精子必需进行获能处理C. 应用3过程中对囊胚阶段的胚胎进行分割时，要注意将内细胞团均等分割D. 应用4中细胞进行定向诱导，可分化形成各种组织和器官，用于器官移植研究2.下列关于动物体细胞克隆和胚胎工程的叙述，正确的是（）A. 克隆羊“多莉”的培育过程中不需要进行胚胎移植操作B. ES 细胞在饲养层细胞上会向不同类型的组织细胞分化C. 排异反应是胚胎工程需要重点克服的难题之一D. 同期发情处理可以使受体的生理状态更适宜来自供体的胚胎着床3.2009年山东省干细胞技术研究中心宣布，成功克隆出5枚人类囊胚。
其中4枚囊胚的供体细胞来源于正常人皮肤纤维细胞，1枚来源于帕金森患者的淋巴细胞，卵细胞通过健康志愿捐献者促排卵获得。
下列相关叙述正确的是（）A. 可以通过显微操作去除卵母细胞中的细胞核，通过核移植后获得囊胚B. 囊胚阶段的细胞处于未分化状态，可从囊胚中获得胚胎干细胞C. 获得的胚胎干细胞可在饲养层细胞上分化成所需要的器官D. 通过该技术可以达到科学家培养克隆人的目的4.下列有关动物细胞工程和胚胎工程的叙述，正确的是（）A. 培养早期胚胎的培养液中含维生素、激素等多种能源物质B. 细胞培养所需气体CO2的主要作用是维持培养液的pHC. 胚胎干细胞在体外培养能增殖但不能被诱导分化D. 体细胞核移植获得克隆动物的难度低于胚胎细胞核移植5.下列有关哺乳动物胚胎工程的叙述，正确的是（）A. 囊胚的内细胞团细胞和滋养层细胞功能上的差异是基因选择性表达的结果B. 胰蛋白酶处理卵裂球获得的细胞可直接移植到同期发情受体的子宫中继续发育C. 胚胎干细胞核移植可得到一群性状完全相同的个体D. 从卵巢中取出的卵母细胞与获能后的精子完成受精作用6.以下技术与应用匹配不正确．．．的是（）A. 核移植技术——培养鲤鲫核质杂交鱼B. 干细胞技术——提供用于移植的细胞或器官C. 细胞融合技术——培育单倍体植物D. 酶的固定化技术——固定α淀粉酶连续水解废水中的淀粉7.进行生物工程设计时，下表各组所选择的实验材料与实验目的配置，不正确的是（）组别实验目的实验材料材料特点1 动物细胞核移植卵母细胞细胞大，细胞质能有效调控核发育2 体细胞诱变育种愈伤组织细胞分裂能力强，易诱发突变3 植物体细胞杂交培育新品种花粉粒易于获取，易于培养4 烧伤患者皮肤细胞移植自体皮肤生发层细胞分裂能力强，且不会引起免疫排斥A. 1组B. 2组C. 3组D. 4组8.中国科学家应用体细胞核移植方法培育了克隆猴“中中”和“华华”。