小鼠胚胎干细胞(ES细胞)阿建系和维持过程中的问题及对策

［T U #］ 索以及细胞、 组织和器官的修复与移植等领域 。由于在
［2 U !!］ ， 根据我们的经验， 建系率偏低有以下几种原 !"V 左右
因造成， 对此， 我们也提出了具体的解决办法。 <,< 胚胎收集 经常出现的问题是在显微镜下用玻璃毛细管吸胚时， 由 于不易掌握吸气的力度， 造成液流上窜， 冲胚液和毛细管壁 的张力附着容易造成胚胎丢失。解决办法是： 增加毛细管细 端直径至 /"" 找准胚胎在培养皿中的位置， 仅靠溶液 8 左右， ! 的虹吸现象即可将胚胎吸出， 得胚率达 !""V 。 <=> 选择离散 ?53 的时机 这是影响建系率的关键因素之一。一般认为小鼠胚胎 接种到培养孔 T U W 天时， 离散 ’() 比较合适。我们认为， 应该按以下的方法确定适宜的离散 ’() 的时机： 接种 T 天左 右 大多数贴壁胚的 ’() 增殖形成一紧密排列的、 呈圆柱状
［!， /， +］ 能和种系嵌合能力的细胞系 。
可行、 有效的。
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!" 细胞系的建立
无论用 哪 种 品 系 的 小 鼠 建 立 %& 细 胞 系， 建系率均在
涉及医学和生物工程的许多领域， %& 细胞的用途很广， 如广泛用于克隆动物制作、 转基因动物生产、 动物医学模型 建立、 真核细胞基因表达与调控的研究、 细胞分化机制的探
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专论与综述
小鼠胚胎干细胞 （ !" 细胞） 建系和维持过程中的问题及对策
孟国良， 汤富酬， 滕 路， 尚克刚
（北京大学生命科学学院， 北京 !""#$!）
摘
要： 总结了十多年来我们从事 %& 细胞建系和培养工作的经验和教训， 提出了研Байду номын сангаас工作中存在的问题以及解决
干细胞研究方面取得了突破性进展， 干细胞研究被美国 《科 学》 杂志评为 !222 年度世界十大科学成果之首。 上述各个研究领域的前提和工作基础是建立和维持具 有多方向分化潜能和正常二倍体核型的 %& 细胞系。然而， 总结 !" 多年来在小鼠胚胎干细胞方面的研究工作， 我们发 现在 %& 细胞建系和培养过程中存在着建系率低、 具有正常 核型的 %& 细胞系比率低以及参与种系形成的 %& 细胞系比 率低的 “三低” 问题。为此， 我们提出了自己的看法和解决这 些问题的对策， 反复验证的结果说明， 我们改进后的方法是
万方数据
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孟国良等： 小鼠胚胎于细胞 （ $% 细胞） 建系和维持过程中的问题及对策
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结构的细胞团， 此时不必立即分胚， 因为 这时的 !"# 对酶相 当敏感， 离散 !"# 后出现 $% 集落的可能性小， 应继续观察 在 !"# 增殖到足够大、 又没有分化迹象时 !"# 的增殖情况， 再分胚， 分胚后出现新 $% 集落的可能性增大。 !"# 离散增殖的 $%& 这一步有两个关键点， 即 !"# 的转移方法和消化时间。 当 !"# 增殖到可以离散的程度时， 先用钝头毛细管将其挖 出。用毛细管吸取时， 最容易丢失大而生长快的增殖 !"# ， 因其外围粘性较大， 附着力强， 易附着管壁； 解决办法： 加大 毛细管末端口径， 通过虹吸先自然吸入少量培养液， 再以适 宜的力度吸取 !"# ， 这样做， 不容易丢失 !"# 。由于 !"# 个 体差异很大， 很难确定消化时间， 不同的人在建系时所用的 消化时间差异很大 （ & ’ () 分钟） 。如果消化一定时间后 再吹打 !"# ， 容易消化过度， 造成细胞大部分或全部死亡。 解决办法： 将 !"# 放入稀释一倍的酶液中， 即开始用约 ( + , 直到 !"# 裂解为几个大小不 !"# 直径的毛细管轻缓吹打， 一的细胞团块时， 迅速加入终止液或直接转入 , 孔板中。注 意： 此步骤若将 !"# 消化吹打分散为单个细胞， 接种后很难 出现新的 $% 集落； 在轻缓吹打过程中， 最容易丢失细胞， 可 用装上 ) 效果很好。 - 吸头的微量加样器替代， ! !"’ () 集落的离散 离散的 !"# 重新接种后， 可以出现各种细胞集落， 主要 包括 , 种类型的细胞： 滋胚层细胞集落， 内皮样细胞集落， 上 皮样细胞集落和 $% 样细胞集落。挑选生长良好、 没有分化 离散 $% 集落时， 迹象的 $% 集落进行扩增。用口叼管吸取、 往往容易丢失大而形态好的 $% 集落。为了避免集落丢失， 这一步完全可以用装上 ) 获得率 - 吸头的微量加样器替代， ! 这一步将 $% 集落消化为若干细胞个细 可达 (../ 。注意： 胞团即可， 不要分散为单个细胞， 原因同上。 !"* 建系过程中的分化问题 有些 $% 集落离散后重新接种容易分化， 分化与未分化 集落并存。原因： 对分化抑制剂的量要求较高。以前出现这 种情况时， 总是将这种培养物弃之不要， 实为可惜。解决办 法是： 加大饲养层密度和 0!1 含量， 进行亚克隆， 可以得到生 长快、 集落形态良好的 $% 细胞系。
这些问题的方法和对策， 并对一些常规性的操作步骤进行了改进。同时， 对某些尚不明确的问题进行了讨论， 提出 了我们的看法和建议。研究工作表明， 我们采取的对策和方法是可行、 有效的。 关键词： 内细胞团 （ ’()） ； 多方向分化潜能； 正常二倍体核型 %& 细胞； 中图分类号： *#!+ , ! - ! 文献标识码： . 文章编号： （/""!） "/0+ 1 2$$/ "+ 1 "/2/ 1 "+
［(*］
遗传操作时， 可以彻底去掉原来的饲养层， 用含 8./ 9: ; （大鼠心脏细胞条件培养基） 的 $% 细胞培养基进行培养， "# 可以在 (. ’ *. 代内维持其未分化状态和正常二倍体核型。 通常， 我们采取的卓有成效的培养条件是： #$ 饲养层 < $% 细胞培养基 （(...=0!1 + >-） 或 #$ 饲养层 < 含 8./ 9: ; "# 的 $% 细胞培养基。这两种培养组合具有显著抑制 $% 细胞 的未分化状态和维持正常二倍体核型的作用。 9: ; "# 与 但具有独特的促进 $% 细胞贴壁生长、 形成集 0!1 作用一致，
万方数据 ［(&］ 并在一定代次内维持其二倍体核型 。在进行 $% 细胞的
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-% 卷
变。温度变化、 酶的作用、 血清更换、 饲养层改变、 分化抑止 因子的使用与否、 传代操作以及冻存复苏等体外不稳定的环 境因素和未知因素造成了染色体变异和基因突变。在这些 因素的作用下， 传代培养的 !" 细胞不断进行着生存选择， 我 们认为， 一些变异的细胞可能更有利于体外生存。为了尽可 能减少 !" 细胞培养过程中染色体和基因的变化， 上述诸多 因素在培养 !" 细胞时必须考虑在内。 为了降低温度变化对 !" 细胞的影响， 可以把培养基、 酶、 每 次 换 液 或 传 代 前， 将其温育至 #$" 等 分 装 成 小 份， 胰酶消化 !" 细胞时， 待贴壁饲养层细胞及 !" 细胞集 %&’ ； 落出现裂隙之前， 吸取酶液， 残液消化至出现裂隙， 轻轻弹振 培养皿底部待细胞开始脱落时即可加入培养基吹打； 每次尽 可能多做、 多冻存一些 (! 细胞备用， 以保持 (! 使用的一 致性； 传代操作时， 除了尽可能减少温差、 胰酶等的不良影响 外， 操作手法尽可能轻缓， 不可过于激烈； 换液时， 最好采用 半换或三分之二换液的方式换液， 以维持细胞生长环境的相 对稳定性。 为保持 !" 细胞最大 !" 细胞冻存是一个关键性的环节， 的存活率， 应尽可能采用慢冻快融的方法， 与成体细胞相比， 冻存时冷冻速度不宜过快。从冻存开 !" 细胞耐受性很差， 始， 温度下降速度保持在 )’ * %’ + 每分钟为宜， 当温度下降 到 , -.’ 左右时， 下降速度可增至 , /’ + 每分钟， 到 , )..’ 左右时， 可迅速冻入液氮中。每个 !" 细胞系都可以通过实 验确定其适宜的温度下降速度， 首先确定下降冻存细胞的速 度、 冻存细胞与液氮面的距离和温度三者的关系， 冻存技术 熟练后， 仅按下降时间和下降距离就可获得理想的冻存效 果。我们在实际冻存时是按以下的程序进行的： 将要冻存的 再放入 , -.’ 冰箱， 继 !" 细胞置入 0’ 冰箱放置一段时间， 而存放在 , 1.’ 低温冰箱内， 然后放到液氮面上方 , )..’ 左右的地方， 最后冻入液氮中。究竟在每一温度环境中放置 多长时间， 根据我们的经验， 不同的 !" 细胞系是有差异的， 须经严格的实验确定。 !"# 参与形成种系嵌合的 $% 细胞系的比例低 到目 前 为 止， 仅 有 % 个 !" 细 胞 系 可 以 进 入 种 系
［(,， ()］ 落典型的特点 。目前， 我们已用 9: ; "# 建立了一个
来源于 ")8?0 + @A 的 $% 细胞系， 并得到了来自该细胞系的嵌
［(@］ 合鼠 。
+4+
传代培养过程中容易出现的问题及解决办法 在 $% 细胞培养中， 常常出现不正常集落， 如： 划格型、 刺
突型、 网络型、 边缘分化型、 铺展型、 弥散型等， 除了弥散型可 以逆转为典型集落外， 其它均为 $% 集落分化的前兆。原因： 饲养层状态差或制作饲养层的胚胎细胞代数太久， 造成细胞 分泌 0!1 的量下降； 传代时间间隔过长； $% 细胞密度过低， 血清更换； 取生长旺盛的 #$ B: 值变化过大等。解决方法： 制作饲养层， 尽可能用 ( ’ & 代的 #$ 细胞， 最好不用满瓶后 进入老化状态的 #$； 控制 $% 细胞接种密度， 以 (4 ) 天 ’ * 天左右传一代为宜； 建系和维持 $% 细胞所用血清应为同一 批次； 注意观察培养液 7: 变化， 及时换液 （最好半换或三分 之二换液） 及传代。 +"# () 细胞系的特异性 例如， 有的 不同的 $% 细胞系所表现的特异性差别很大， 二倍体核型也很难维持； 有的则很不容 $% 细胞系极易分化， 易分化， 二倍体核型容易维持； 大多数 $% 细胞系则介于二者 之间。不同的 $% 细胞系具有不完全相同的特征和营养要 求， 它们对饲养层的质量、 密度， 抑制因子补加量的多少， 血 清的质量以及其它营养状况和环境条件都有不同的需要。 建议： 每个 $% 细胞系都应建立适合其生长的最佳条件， 维持 一个 $% 细胞系的条件不能用于另一个细胞系。 +"’ 血清对 () 细胞的影响 血清对 $% 细胞的贴壁生长、 集落形态有重大影响， 由于 血清更换造成的问题有： 细胞贴壁少， 生长缓慢； 集落弥散型 或网状， 分不清单个集落； 或集落平展暗淡， 没有折光性， 丧 失立体感。解决办法： 一般而言， 每个 $% 细胞系依赖于建系 时所用的血清批次， 若更换血清， 则应以该细胞系为供试细 胞， 在含有待测血清的培养基上进行传代培养 （ 3 ’ (. 代） 和 克隆测试， 测试合格的血清只适用于该细胞系。若用于其它 则仍可能出现以上情况。 $% 细胞系， +"* 染色体变异和基因突变 在建系和维持 $% 细胞过程中， 另一个问题就是具有正 常二倍体核型的 $% 细胞系比例低， 在所建的 )* 个细胞系 中， 只有 )./ 的细胞系具有正常的二倍体核型 （ 2 3./ ） ， 具 有正常核型的 $% 细胞系在传代培养过程中也会发生核型改