小鼠胚胎干细胞(mES)、小鼠iPS细胞培养Protocol
中图版选修3 胚胎工程 作业 (2)
1.3胚胎工程考题演练中图版选修31.(2015·淄博模拟)控制哺乳动物的性别对于畜牧业生产有着十分重要的意义。
目前，分离精子技术是有效的性别控制方法。
例如：牛的X精子的DNA含量比Y精子的高出4%左右，利用这一差异人们借助特殊仪器将它们分离开来，再通过胚胎工程技术就可培育出所需性别的试管牛(如图所示)。
根据以上信息回答下列相关问题：(1)图中过程①是通常采用____________________技术，在这个过程中____________的精子与卵细胞结合形成受精卵，为获得更多的卵细胞需要给良种母牛注射适宜剂量的____________________。
(2)过程②中受精卵培养发育至__________时期，再经________________到代孕母牛，从而获得后代。
(3)若希望同时获得多个性状相同的个体，可以使用______________________技术。
(4)动物“生物反应器”是转基因动物技术中最诱人的部分之一，例如，将人胰岛素基因导入母牛的体内，并使之在乳腺中特异性表达出人胰岛素。
在培育转人胰岛素基因奶牛过程中，常选用的受体细胞是______________________，导入目的基因常用的方法是__________________________。
【解题指南】(1)知识储备：体外授精、胚胎移植、胚胎分割移植、基因工程。
(2)解题关键：准确识别图示过程中体外授精和胚胎移植是解题的关键。
【解析】(1)人工采集的卵子与精子不能够直接受精，精子需要经过获能处理，为获得更多的卵细胞需要给良种母牛注射适宜剂量的促性腺激素。
(2)在体外受精卵需发育至囊胚时期，再经胚胎移植到代孕母牛继续发育，从而获得后代。
(3)若希望同时获得多个性状相同的个体，可以使用胚胎分割移植技术。
(4)动物基因工程中常选用的受体细胞是受精卵，转化的方法常用显微注射法。
答案：(1)体外授精获能促性腺激素(2)囊胚胚胎移植(3)胚胎分割移植(4)受精卵显微注射法2.(2015·济宁模拟)以下是科学家采用不同方法培育良种牛的过程，a～h为操作过程，请据图回答有关问题：(1)“试管牛技术”的操作流程是______________(填字母)。
小鼠干细胞实验报告
一、实验目的本研究旨在探讨小鼠干细胞的生物学特性及其在组织再生和疾病治疗中的应用。
通过体外培养和观察小鼠干细胞，分析其增殖、分化和迁移能力，为干细胞在临床治疗中的应用提供理论依据。
二、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）小鼠脾脏、骨髓等组织；（2）DMEM/F12培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素；（3）小鼠成纤维细胞；（4）表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子；（5）流式细胞仪、细胞培养箱、倒置显微镜等。
2. 实验仪器：（1）流式细胞仪；（2）细胞培养箱；（3）倒置显微镜；（4）超净工作台；（5）离心机。
三、实验方法1. 小鼠干细胞分离（1）取小鼠脾脏、骨髓等组织，用眼科剪剪成1mm³大小的组织块；（2）将组织块放入DMEM/F12培养基中，加入Ⅰ型胶原酶，37℃消化1小时；（3）用200目尼龙网过滤，收集细胞悬液；（4）用离心机离心，弃去上清液，用DMEM/F12培养基重悬细胞。
2. 小鼠干细胞体外培养（1）将细胞悬液接种于培养瓶中，放入细胞培养箱，37℃、5%CO2条件下培养；（2）每3天更换一次培养基，观察细胞生长情况。
3. 小鼠干细胞表型鉴定（1）用流式细胞仪检测细胞表面标记，如CD29、CD44、CD45等；（2）用倒置显微镜观察细胞形态。
4. 小鼠干细胞增殖实验（1）取对数生长期的干细胞，以1×10⁵个/孔的密度接种于96孔板；（2）每24小时更换一次培养基，观察细胞增殖情况；（3）计算细胞增殖倍数。
5. 小鼠干细胞分化实验（1）将干细胞接种于培养皿中，加入表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，诱导细胞分化；（2）观察细胞形态和生物学特性，如神经细胞、成骨细胞等。
6. 小鼠干细胞迁移实验（1）将干细胞接种于培养皿中，加入细胞迁移实验试剂；（2）观察细胞迁移情况，记录细胞迁移距离。
四、实验结果1. 小鼠干细胞分离成功，细胞生长旺盛，呈梭形、椭圆形等；2. 表型鉴定结果显示，小鼠干细胞表面表达CD29、CD44、CD45等干细胞标记；3. 小鼠干细胞增殖实验结果显示，细胞增殖倍数为10倍；4. 小鼠干细胞分化实验结果显示，细胞可分化为神经细胞、成骨细胞等；5. 小鼠干细胞迁移实验结果显示，细胞迁移距离为1.5mm。
《2024年小鼠新型胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言随着生物医学技术的不断发展，干细胞研究在生命科学领域中扮演着越来越重要的角色。
其中，胚胎干细胞（ESC）作为一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞类型，已成为研究各种生物过程和疾病模型的热门研究对象。
本文旨在探讨小鼠新型胚胎干细胞系的建立过程及其在科研领域的应用价值。
二、材料与方法1. 实验材料本实验所需材料包括小鼠胚胎、培养基、生长因子等。
所有材料均需经过严格的质量控制，确保实验结果的可靠性。
2. 方法（1）胚胎获取与处理：从特定品系的小鼠中获取早期胚胎，并进行必要的处理，如去透明带等。
（2）干细胞培养：将处理后的胚胎置于特定培养基中，添加生长因子等必要成分，进行干细胞培养。
（3）干细胞系建立：通过细胞克隆、筛选等方法，建立新型胚胎干细胞系。
（4）细胞鉴定与表型分析：通过分子生物学技术对新型胚胎干细胞系进行鉴定，包括基因型、染色体稳定性等方面的分析。
三、实验结果1. 胚胎处理与干细胞培养结果经过适当的处理后，胚胎在特定培养基中成功附着并开始发育。
在适宜的条件下，干细胞得以增殖并形成克隆。
2. 新型胚胎干细胞系的建立通过细胞克隆、筛选等步骤，成功建立了新型胚胎干细胞系。
该细胞系具有自我更新能力和多向分化潜能，为后续研究提供了可靠的细胞来源。
3. 细胞鉴定与表型分析结果通过分子生物学技术对新型胚胎干细胞系进行鉴定，结果显示该细胞系基因型稳定，染色体无异常，具有较高的纯度。
此外，该细胞系在体外分化实验中表现出良好的分化潜能。
四、讨论1. 小鼠新型胚胎干细胞系建立的意义建立小鼠新型胚胎干细胞系对于研究生物学、医学等领域具有重要意义。
首先，该细胞系可用于研究小鼠胚胎发育过程及机制，为人类胚胎发育研究提供参考。
其次，该细胞系可分化为多种细胞类型，为疾病模型研究、药物筛选等领域提供可靠的细胞来源。
此外，该细胞系还可用于基因编辑、基因治疗等方面的研究。
2. 小鼠新型胚胎干细胞系的优点与挑战（1）优点：新型胚胎干细胞系具有自我更新能力强、分化潜能高、基因型稳定等特点，为科研工作者提供了可靠的细胞来源。
小鼠胚胎干细胞体外发育分化模型
小鼠胚胎干细胞体外发育分化模型2004年3月第12卷第1期中国实验动物ACTALAB0RAT0RlUMAN1MAL1SSC1ENT1AS1N1CAMarch.2o()4V01.13No.1小鼠胚胎干细胞体外发育分化模型刘民,李柏青,李厚达(1.蚌埠医学院,蚌埠市233003,2.扬州大学畜牧兽医学院)【摘要】胚胎干细胞(Embryonicstemcell,EScel1)是多潜能性细胞,它在体外既可维持不分化而无限增殖,又能参与胚胎发育分化为各种类型细胞和组织而形成器官;小鼠Es细胞可供的数量大,在体外培养条件可进行精确调控,实验比较经济加上现代基因及其他生物操作等技术,因此小鼠Es细胞体外发育分化系统被广泛地作为模型系统加以利用.小鼠Es细胞体外发育分化研究为推动其他哺乳类动物以及人的Es细胞研究,从而将更好地进行细胞,组织工程实验为人类细胞组织和基因治疗服务创造了有利条件.本文将Es 细胞体外发育分化情况加以概述,以便更好地开展ES细胞体外研究.【关键词】小鼠;胚胎;干细胞;体外发生,分化【中图分类号】Q813.1【文献标识码】A【文章编号】1005—4847I2004)01—0057—07胚胎干细胞(Embryonicstemcell,EScel1)来源于早期胚胎,它在体外既可维持不分化而无限增殖,又能参与胚胎发育分化为各种类型细胞和组织而形成器官,因此被称为多(潜)能性细胞….自从1981年(Martin,Evans等)成功地分离培养出未分化小鼠Es细胞以来,人们纷纷利用Es细胞体外特性开展了多方面研究:(1)利用ES细胞体外培养,分化和定向诱导分化实验,开展胚胎学,发育生物学,遗传学及细胞,组织工程学研究;(2)利用ES细胞建立的基因打靶技术生产转基因动物,从而开展生物学及遗传学等基础医学各方面的研究;(3)在定向诱导分化实验基础上,开展药理,毒理学研究以及建立药物筛选模型.由于小鼠可提供的ES细胞数量大和对ES体外培养条件可进行精确调控,实验比较经济加上现代基因及其他生物操作等技术,因此小鼠Es细胞体外发育分化系统被广泛作为模型系统加以利用;小鼠Es细胞体外分化研究推动了其他哺乳类动物以及人的ES细胞实验的开展,为进行细胞,组织工程研究提供人类细胞组织和基因治疗作服务创造了有利条件.本文将Es细胞体外发育分化情况加以概述,以便更好地开展ES细胞体外研究.[基金项目]安徽省教育厅教育基金(2001kj173).[作者简介]刘民(1963一),男,高级实验师;研究方向:胚胎干细胞研究.1ES细胞体外培养体系小鼠Es细胞体外培养目前必须使用分化抑制物来实现分化抑制,从而保证细胞多能性.分化抑制物有三种:饲养层,条件培养基和分化抑制因子.它们可单独使用或前两者分别与后者共同使用.最常用是MEF饲养层加LIF.见表1.表1ES细胞的分化抑制物Tab.1TheinhibitorsofEScellsdifferentiation分化抑制物分类Typesofinhibitors分化抑制物名称lnhibitors饲养层细胞Feedercells条件培养基细胞Conditionedmediumcells分化抑制因子DifferentiationinhibitivefaCt0(P)MEF～,STO一,HEF,UEBRLBRL一,HBL一5637,PSA—APCIO一6R,LIF一,D1A,H1LDA,1L-6系成员注:(1)一表明最常用(2)(P)MEF一小鼠(原代)胚胎成纤维细胞;0一建系的MEF;HEF一同源胎儿成纤维细胞;UE一子宫上皮细胞;BRL一大鼠肝细胞;HBL-5637--人膀胱癌细胞株;PCIO一6R—LIF转染的COS细胞; PSA—A,T3一分别为一种小鼠的胚胎癌细胞;L】F一白血病抑制因子;lL.6一白介素一6Note:(1)"frequentlyused小鼠Es细胞体外培养除要抑制其分化外,还要给予适当营养物质和生长因子促进其增殖.常用ES细胞培养基和添加物见表2.58中国实验动物2004年3月第12卷第1期AetaLabAnimSciSin,March,2004,V o1.12No.1表2常用Es细胞培养基和添加物Tab.2TheeOllllllOnusedmediumandadditive种类内容TypesContents基础培养基DMEM一.MEN,TCM一199.F一12.DMEM和F Basicmedium一12混合使用一血清一,非必需氨基酸一,2巯基乙醇一,核苷酸,丙酮酸钠,多种生长因子(IGF,EGF,添加物FGF,SCF等)AdditiveseFLim一,non—essentialamin0acid.8一mereaptoeth—anol,nueleotide,Napyruvate,IGF,EGF,FGF,SCF注:(1)**表明最常用.(2)IGF一胰岛素样生长因子;EGF一表皮生长因子;FGF～成纤维生长因子;ScF一干细胞生长因子.Note:(1)**frequentlyused2小鼠ES细胞体外分化模型2.1小鼠ES细胞体外自发分化模型2.1.1方法撤除Es细胞培养体系中分化抑制物将细胞制成单细胞悬液,或采用悬浮法或悬滴法,促使ES细胞聚集,分化和生长,形成类胚体(embryoidbody,EBs).2.1.2此模型重演了早期胚胎的发育此模型在许多方面重演了早期胚胎的发育:(1)聚集的外层细胞分化为原始内胚层,模仿了体内显露于囊胚腔ICM细胞形成原始内胚层;而且原始内胚层进一步发育产生一个由内脏和体壁系组成的外层.(2)聚集的内层细胞先保留多能分化能力,以后经历增殖,分化和选择编程性死亡而形成一个由单细胞组成成腔的原始外胚层.(3)许多来自三个胚层的终末分化细胞出现后形成新的中胚层;表现为Oct4表达的缺乏和早期分化标志(markers) (如:brachyuryandgoosecoid)的正调节.类胚体分化的细胞类型和结构就中间细胞群的形成和基因表达的变化明显相似于体内事件.类胚体腔的形成可作为啮齿类胚胎前羊膜腔形成及其他广泛实体组织结构腔的形成模型.2.1.3开展的研究人们用这自发分化模型开展了以下研究:(1)上胚层细胞选择编程性死亡和细胞存活与内脏内胚层表达的可扩散"死亡信号"以及相关于内胚层和原始外胚层之间的胞外基质"幸存信号"之间的协同作用.END一2,一个类内脏内胚层细胞系,它分泌因子能诱导聚合的P19EC细胞分化;这说明内脏内胚层起着一种结构分子作用.多能细胞聚合后分化分析支持了由小鼠体内基因表达和基因敲除分析而推断出的结论:即内脏内胚层在多能细胞成熟和特化过程中具有指导性作用;而且可能成为进行信号分子鉴定及其功能的研究系统.使用这种方法已推断出BMP在成腔过程中起信号传递作用.(2)多能细胞生物学研究:可观察其发育行为,基因表达分布情况,发育潜能短暂变更情况,信号传递和调节等. (3)基因表达和分化潜力水平研究.(4)研究早期哺乳动物胚胎发育的典型特征:发育的可塑性:多种多能细胞状态可相互转化以适应环境的变化.加入外源LIF能抑制类胚体内原始外胚层分化和形成,显然LIF是抑制了相关于原始外胚层形成的基因表达的转换而不影响原始内胚层的形成.在促进和阻滞多能细胞成熟的信号之间的相互作用也许提供一个弹性信号通讯环境,可能表明发育的可塑性,即异常发育或环境损害的胚胎具有恢复能力.(5)LIF的生物鉴定.Es细胞自我更新依赖于旁分泌信号,这个信号因子就是LIF.LIF直接连接到异二聚体受体复合体上;而异二聚体复合体包含二个跨膜糖蛋白: gpl30andLIFR;撤走LIF,gpl30信号传递作用就会丢失,从而导致ES细胞分化为各种各样类型细胞. 2.2小鼠ES细胞体外诱导分化模型2.2.1诱导分化神经元和神经胶质模型神经系统发育十分复杂,人们对其了解甚少.因此Es细胞到成熟神经元和神经胶质发育线似乎难以重现,但是事实证明这条通路可以重建.早期就报道过EBs由许多细胞组成,其中就有少量神经样细胞.后来人们用简单方法——加入视黄酸及其他方法诱导出大量神经细胞.2.2.1.1方法(1)bFGF细胞因子诱导法自发分化形成EBs;在标准培养液中培养4d,接着转到有贴壁附着层而无血清培养液培养体系中,几天后,有大量细胞死亡,许多幸存细胞是叠集的上皮细胞;再加bFGF 后这些细胞增殖并分化为神经元和神经胶质. (2)RA诱导法依RA浓度及作用,培养时间不同有多种形式ES细胞形成EB后,继续培养4d,接着加入RA培养4d,用胰酶消化聚集体形成单层细胞接种于有贴壁附着层上,几天后大量神经样细胞出现.大约40%是神经元,它们位于一层扁平细胞之上;这层扁平细胞粘附于基底层,许多是神经胶质细胞.大量培养ES细胞形成EBs,加入RA培养2d,中国实验动物2004年3月第12卷第1期ActaLabAnimSciSin.March.2004.V o1.12.No.159接着在无RA但有贴壁附着层上培养,4～5d后便出现神经细胞.悬滴培养法培养ES细胞形成EBs,加入RA(10一～10mol/L)培养2d,接着去除RA悬滴培养2d,再在贴壁附着层上培养2d后出现神经细胞.所有EBs加入RA其神经元形成率为100%,而所有未加RA的其形成率15%.(3)2一巯基乙醇诱导法在无血清而有2.巯基乙醇的条件下,Es细胞可不形成类胚体而直接诱导分化为神经元.2.2.1.2诱导分化的神经元和神经胶质细胞所具有的特征Bain等1995报道这些神经细胞不仅表达专一性的神经微丝M和l3微管蛋白,还有钠,钾,钙离子通道的特征.分化的神经细胞还表达神经7一氨基丁酸,甘氨酸和NMDA受体等不同物质以及神经细胞之间形成功能性联系.甚至在体外诱导分化早期的类胚体中检测到神经元和神经胶质细胞的共同前体细胞的专一性标志巢蛋白(nestin).Fraichard等,19958实验观察到O抗原和神经胶质纤维酸性蛋白,它们分别是星形和少突胶质细胞的标志子;而Bain等1995表明神经胶质纤维酸性蛋白质的mRNA在分化细胞培养液中表达而未分化细胞培养液中没有表达;Angelov等1998:03则观察有细胞带有星形胶质,少突胶质和小胶质标志子的表达.2.2.1.3用Es细胞神经分化模型开展的和可能开展的研究Es细胞体外神经分化模型可研究神经细胞和神经胶质的发育功能,探索体外可能产生的多能前体细胞以及从细胞分子水平回答体外神经分化通路机制.这种工作目前仍处于初期阶段.目前主要进行基因表达研究,基因打靶突变基础上基因功能分析以及基因诱捕试验筛选特异性基因.Bain等1996;Li等1998通过实验说明:早期神经发育调节基因Wnt.1和MASH1在未分化Es 细胞中不表达,在培养4d无RA的Ebs中也不表达;在培养4d后Ebs中添加RA,则2d内诱导Wnt. 1表达,4d内诱导MASH1表达,而Wnt.1和MASH1 表达后才启动更高级(包括中间神经丝)分化标志子和GAD(GAD65,GAD67)基因.SOX2是一个编码DNA结合蛋白,在早期神经板选择性表达的基因.u等1998通过构建一个带有新霉素基因而无启动子的SOX2基因进行了Es 细胞基因打靶实验.在体外4./4+(无RA培养EBS4d,有RA培养EBS4d)方案,Es细胞神经分化后,用新霉素选择获得神经前体细胞纯培养.分析选择性表达基因发现有许多调节基因(如SOX.1, Pax6,Pax3,Mashl,deha1)在前体细胞中表达.因此这些实验说明体外模型的基因表达次序与胚胎中相似;体外经历前体状态也相似于体内通路. Rohwedal等1998131用基因打靶突变实验说明缺乏B.整合蛋白加速神经分化;Kawai等1998:43进行GD3合酶基因突变,发现分化有缺乏b.系列神经苷脂的神经细胞同时伴随有其他许多种细胞,这与神经分化必须有神经苷脂家系相矛盾.Dinsmore,1996用RA诱导了Es细胞分化为表达GABA的神经细胞,并用这种细胞植入具有亨廷顿舞蹈病大鼠模型体内,具有神经功能并存活6 周.Brustle等1996移植Es细胞诱导分化的神经前体细胞入胎大鼠脑内,在大鼠生后几周检查发现植入的细胞被广泛整合到中枢神经系统(CNS),而且分化为神经元,星形胶质细胞和少突神经胶质细胞.因此分化的神经细胞可进一步为CNS损伤提供治疗学研究.2.2.2脂肪细胞分化模型2.2.2.1方法(1)RA和脂肪生成激素诱导法:EBs形成后第2天至第5天用全反式RA(浓度为:10mol/L)处理, 接着去除RA培养,第7天EBs出现大量增长时用脂肪生成性激素处理(Ins:85nmol/L+T3:2nmol/L, 胰岛素十三碘甲腺原氨酸),一直到第20天脂肪细胞过量增长,此时在EBs中心有明显的脂肪细胞克隆.(2)DMSO和脂肪生成激素诱导法:EBs形成后培养液中加入0.1%二甲基亚砜(DMSO)并每天更换培养液悬浮培养三天;接着转入明胶处理培养板中贴壁培养,用脂肪生成性激素处理(Ins:85nmol/L +T3:2nmol/L,),10—15d后分化为脂肪细胞.此法以及用其他激素替代RA法生成脂肪细胞较少.2.2.2.2分化的脂肪细胞表现特征Es细胞分化形成的脂肪细胞高度表达脂肪特异性基因如:PPARr和adipsin;而且是成熟性和具有功能性,它显示出对胰岛素生脂活性和对肾上腺素激活剂的解脂活性.2.2.2.3开展的研究中国实验动物2004年3月第12卷第1期ActaLabAnitaSciSin,March,2004,V ol12.No.1(1)分析EBs中PGC一1基因表达,来探讨白和褐脂肪母细胞前体之间的关系.在脂肪细胞决定期内用10MRA处理EBs,导致W AT(白色脂肪组织)特异性基因高度表达(如:PPARr和adipsin)而BAT(褐色脂肪组织)特异性基因UCP一1基因没有表达进一步研究发现BA T中高度表达PPARr的辅激活剂PGC.1,而W AT中不表达PGC.1.因此推论PGC.1是UCP.1基因的关键性调节基因,当它异位在W AT中表达就把白色脂肪细胞变成褐色脂肪细胞.(2)分析Ebs发育过程中终末分化关键性调节基因.利用分化培养系统与未分化ES细胞遗传操作(如:基因诱捕,基因功能缺失和基因功能获得)提供一个有效的工具,来鉴定新的相关于脂肪早期定型的调节基因.在Ebs定向分化过程中,人们分析研究脂肪代谢相关调节基因PPARs和C/EBPs发现:PPAR和C/EBPq表达程度低,PPAR.强烈表达;C/EBP.在维持脂肪细胞分化表型起重要作用,而PPARs和c/EB可能是脂肪前体细胞最终分化为脂肪细胞的激发剂.人们利用同源重组,基因打靶技术建立lif-/.ES细胞来观察是否能进行脂肪分化,发现缺乏LIF表达并不能阻止脂肪组织发育;而LIF.R突变的Es细胞其脂肪分化能力大为减少,这说明LIF.R在脂肪发育中起重要作用.(3)分析鉴定干细胞向脂肪和肌细胞发育的决定因子Es细胞自发分化过程中有骨骼肌出现;但骨骼肌细胞和脂肪细胞是由同一间充质细胞前体分化而来.加,而且表明两者体外发育程序是相互排斥的.因此体外研究两者发育分化通路就能分析鉴定其干细胞决定因子.2.2.3ES细胞诱导血生成最早报道Es细胞形成类胚体中血岛样结构有红细胞和巨噬细胞组成.随后,许多实验者相继报道Es细胞体外分化产生血细胞,髓细胞和淋巴细胞等一系列造血系统的细胞.从多种研究中得出重要结论:胚胎造血细胞系统发育的分子机制和细胞等事件在Es细胞体外分化系统中存在.2,2,3.1ES造血分化方法(1)用半固体培养基中排列法用半固体培养基中排列法能成功地让Es细胞分化为嗜中性粒细胞,肥大细胞,巨噬细胞和红细胞系.(2)使用辅助细胞系共培养法OP9细胞系(来自op/op小鼠,缺乏巨噬细胞克隆刺激因子)辅助Es细胞分化产生红细胞,骨髓和淋巴系细胞;利用骨髓基质细胞或其他条件培养液让Es细胞分化为造血干细胞.可参考(4)(3)添加外源造血生长因子诱导法使用添加外源造血生长因子来诱导Es细胞分化.AnzaiH1999,2001.体外诱导小鼠胚胎干细胞产生A一6造血干细胞,A一6造血干细胞在bFGF作用下分化形成红细胞样细胞;与st一2基质细胞共同培养形成颗粒细胞和吞噬细胞;A一6造血干细胞在于细胞因子作用下产生骨髓细胞.(4)共培养系统结合A—MuLV转染法:产生B淋巴细胞系造血分化共培养系统:Es细胞一直接种在OP9[BM(基础代谢)基质细胞系]细胞系单层上,每3d换液1次;第5天100%ES细胞形成类中胚层克隆,用0.25%胰酶消化形成的单细胞悬液预先接30分钟,再把非粘附性细胞重新在新的OP9层上;第6～7天出现小簇,圆滑的造血细胞;第8天轻轻洗下粘附不紧的细胞(多是造血潜力细胞,未洗下的是中胚层细胞和不分化的Es克隆)并种在新的OP9层上;第10～12天造血克隆大量增殖,第19天CD45细胞大量出现.B淋巴细胞产生:在造血分化共培养系统中,第5天开始加入人Flt.3L(Flt一3配体),其终浓度为5n ITll(或鼠Flt一3L,终浓度为20ng/m1);第8天以后不用胰酶消化传代,而用70m滤网过滤成单细胞传代;第15天后可产生sIgM+B细胞.EAB(ES—derivedAbelson?transformedpre—Bcells)细胞系产生:在B淋巴细胞产生的基础上,第8天加入5ng/mlIL一7到培养体系中;第15天以后转染A. MuLV(Abelson小鼠白血病病毒)(病毒液中带有IL一7),转染2～4h后再加入新鲜的带有IL.7的OP9培养基;5d后换液去除Flt一3L但仍保留IL.7;产生CD45R+CD24+IgM.EAB细胞系.2,2,3,2血细胞生成是一个十分复杂的过程,其中未分化细胞至少有8个系组成,每个系都有明确的功能,形态学细胞和动力学特征,在此不一一叙述ES细胞分化为各种细胞的特征.2.2,3,3Es造血分化模型开展的研究(1)开展造血干细胞生物学研究造血干细胞(haematopoieticsterncells,HSC)生物中国实验动物2004年3月第l2卷第1期ActaLabAnimSciSin.March.2004.V ol12.No.I61学研究是一个十分活跃研究领域,ES细胞分化模型结合现代技术(如转基因技术)为HSC的休眠,自我更新和分化特性深入研究提供一个新手段.HSC其根本功能是具有造血多系种群恢复能力.人们利用过继转移等方法研究表明ES细胞衍生的细胞能够具有短期和长期多系造血能力:因此,利用这个体外模型研究早期造血定向,分析HSC基因功能和筛选有关造血定型基因都具有重要作用.(2)开展血细胞生成过程中基因功能分析利用现代基因打靶和转基因技术以及ES细胞基因操作的便利开展血细胞生成过程中基因功能分析.DNA连接酶1无效突变的小鼠在子宫内死亡,移植其胎肝HSC到非转基因条件性成年小鼠可以研究这个基因在造血中发育作用.使用ES细胞的"三明治"夹心和四倍体胚胎细胞技术可提高ES细胞衍生HSC数量,从而便于HSC移植研究造血基因功能.GATA因子涉及血细胞生成控制.体外ES细胞无效突变GATA1,红细胞发生在早期受阻碍而其他谱系仍能产生;GA TA2基因体外无效突变,而ES细胞能产生红细胞和一些骨髓系,而在控制多能祖细胞数量和肥大细胞分化起作用.缺乏转录因子SCL的小鼠在发育早期死亡,没有明显卵黄囊生血活性;SCL无效ES细胞其体外分化证明了缺乏造血基因表达.其他基因突变的影响也可在ES细胞分化早期血细胞生成的效果上检验.因此靠体外ES细胞造血分化模型进行早期定型分子生物学研究是十分容易.(3)血细胞分化基因的鉴定根据Es细胞体外分化模型掌握造血分化时间过程,从而能够检查分化基因的表达以及鉴定其他的相关基因.常使用扣除杂交法和基因诱捕法来鉴定候选基因以及进一步剖析早期血细胞生成周围事件.2.2.4内皮细胞与血管的发生模型2.2.4.1方法(1)血管生成素因子混合物诱导法撤除LIF后ES细胞自发分化为特殊的,依赖于时间图式表达标志子的内皮细胞,在第l1天达到最大分化.EBs中增加血管生成素因子混合物:红细胞生成素(erythropoietin),IL.6,FGF一2,VEGF等可极大增加内皮细胞数量.但是这一系统不能分化为纯内皮细胞而混有其他类型细胞.(2)致癌和抗性基因转染筛选法以及免疫磁性选择法来获得(永生)纯内皮细胞系具体方法为:撤除LIF和饲养层细胞,ES细胞先短时间胰酶消化,并用含有10f~g/ml胰岛素,450/~mol/L单硫代甘油(monothioglycero1)IMDM混合液中止消化以促进ES 细胞分化形成EBs;然后ES细胞培养在有内皮细胞生长因子混合培养液中(添加:人的50ng/mlVEGF,2U/ml红细胞生成素,100ng/mlbFGF;鼠的10ng/mlIL一6)以促进血管分化.在类胚体形成后第8～11天收集用胶原DNA酶消化EBs,接着①直接用PmT (polyomamiddleT,PInT)(一个致癌基因)载体转染,收集新霉素抗性克隆和培养而形成无限增殖性细胞系;②免疫磁性选择:用PECAM(plateletendothelial celladhesionmolecule,PECAM)mAbs(monoclonalanti—bodies)磁珠选择内皮细胞,再用或不用PmT载体转染形成标记有PECAMmAbs不同细胞系.2.2.4.2分化的内皮细胞特征分化的内皮细胞内有特殊的标志子有PECAM (plateletendothelialcelladhesionmolecule),Flk一1,tie一1,tie一2,vascularendothelial(VE)cadherin,MECA. 32,andMEC一14.7.它们依一定程序表达.这十分相似体内胚胎内皮细胞的发育.分析细胞系表达了内皮细胞标志子包括生长因子受体和粘附分子:整合蛋白(integrin)a,PECAM,CD34,JAM等等;与来自卵黄囊和9.5d胚胎的内皮细胞比较其形态学,功能行为上特征说明ES分化所建立的细胞具有内皮细胞特征.2.2.4.3可能开展的研究此模型可能成为一个有用的工具:分析内皮分化步骤以及制作研究遗传上改变的内皮细胞.2.2.5ES分化软骨细胞模型2.2.5.1方法:基因诱捕法¨构建质粒载体ROSA~3一geo转染Es细胞,在允许分化的条件下培养Es细胞,使未分化的ES细胞有能力捕获未激活的ROSA基因并在体外条件下诱导分化为软骨细胞.具体方法是将这种ES细胞先自发形成EBs;再在培养液中用小牛血清替代胎牛血清并添加lt~mol/L地塞米松(dexamethasone),每2～3d更换1次培养液;50d后这样分化的细胞用阿尔辛蓝染色证明细胞间存在Ⅱ型胶原因而具有软骨细胞特征.2.2.5.2软骨细胞分化模型可开展的研究62中国实验动物2004年3月第12卷第1期ActaLabAnimSciSin.March.2004,V01.12.N0.1ES细胞诱导分化为软骨细胞条件比较复杂,因而成功率很低.此模型可研究其发育通路,分析其分子机制,寻找其决定基因.3ES细胞体外分化模型发展趋势和应用前景3.1ES细胞体外分化模型存在的问题ES细胞在体外培养的条件从理论上讲不可能与胚胎中多能细胞条件完全相一致;因此,ES细胞的体外分化通路和机制也难以完全相同于体内胚胎细胞的发育.目前,人们进行ES细胞体外分化研究大多局限于混合型细胞的诱导,对同一种类型细胞的诱导其使用的诱导剂,诱导方法也因人而异;同时人们也很少考虑诱导物质的副作用;被诱导分化的细胞只能短期培养或原代培养.所以,ES细胞体外分化模型的发展仅仅是刚刚起步,有许多问题需要解决,有很长路需要走.3.2ES细胞体外分化模型发展趋势ES细胞体外分化模型发展趋势:(1)混合型细胞分化向单一型细胞分化.人们利用现代技术进行精确ES细胞分化微环境控制和技术线路最佳设计,从而完善ES细胞向单一分化方向发展.(2)寻找分化为各种不同类型细胞的祖细胞(或前体细胞).ES细胞体外可分化为各种类型功能性细胞,因此,ES细胞体外分化必定与体内发育一样要经历一定的前体细胞阶段,那么极可能成为前体细胞理想模型.(3)ES体外分化的细胞向无限增殖系发展.利用转染技术是一大方向,目前已有成功.(4)ES细胞体外分化模型向功能性发展,从而向更为复杂分化过程迈进.目前人们已开始研究功能性细胞,组织分化研究,如分泌Ig的B细胞分化,血管的发生,神经肌肉相互作用和突触发生,分泌胰岛素类胰岛组织的分化等等,这是人类利用的目的.(5)从大小鼠ES细胞体外分化模型向其他哺乳类动物以及人的ES细胞体外分化模型发展.小鼠ES细胞体外分化模型建立最多,研究最多,因此利用此成果向其他哺乳动物以及人的ES细胞分化广泛研究是一大趋势.3.3ES细胞体外分化模型应用前景从众多实验研究中可以看出,Es细胞体外发育分化能够基本模拟或者重现体内复杂的发育过程, 因此ES细胞体外分化模型可广泛用于发育生物学和分子细胞生物学研究.研究发育图示,早期发育调控机制;研究基因功能,筛选有用的基因等.小鼠ES细胞体外分化模型给人类ES细胞研究开辟了道路,让人类憧憬着能够产生特定的细胞,组织乃至器官用于细胞,组织工程以及移植医学.如果科学家最终能够成功诱导和调控体外培养的胚胎干细胞正常的分化,这一技术将有可能在以下领域发挥作用:。
ips干细胞技术原理
IPS干细胞技术原理一、引言I P S（诱导型多能干细胞）干细胞技术是近年来生物科学领域的一项重大突破。
该技术被广泛应用于再生医学、疾病模型建立以及药物筛选等领域。
本文将介绍I PS干细胞技术的原理，以及其在科学研究和医疗实践中的应用。
二、什么是I P S干细胞技术I P S干细胞技术是一种通过基因转化，将成体细胞重新变回能够分化成多种细胞类型的多能干细胞的方法。
该技术的先驱者是日本科学家山中伸彦（S hi ny aY am an a ka），他于2006年首次成功地将小鼠成纤维细胞转化为多能干细胞，开创了I PS干细胞技术的新纪元。
三、I P S干细胞技术的原理I P S干细胞技术的原理是通过基因转导，将有特定基因表达的细胞重新编程成类似于胚胎干细胞的状态。
这种细胞状态具有潜在的分化能力，可以进一步分化为各种不同类型的细胞。
在实验中，通常使用的是外源转录因子来重编程成体细胞，包括O ct4、S o x2、K lf4和c-My c等。
这些转录因子能够调控基因的表达，将细胞的基因表达模式重新调整，使其回到早期胚胎发育阶段的状态。
四、I P S干细胞技术的优势1.避免伦理争议：与胚胎干细胞不同，I P S干细胞技术使用的是成体细胞，避免了对胚胎的损害和伦理上的争议。
2.个体特异性：利用患者自身的细胞进行转化，生成的I PS细胞具有与患者本身完全相匹配的基因组，有效避免了免疫排斥的问题。
3.模拟疾病过程：通过将患者体内的细胞转化为IP S细胞，可以模拟出患者体内疾病的发生和发展过程，为疾病的研究提供了重要工具。
五、I P S干细胞技术的应用领域5.1再生医学I P S干细胞技术在再生医学领域具有巨大潜力。
通过将患者的细胞转化为IP S干细胞，可以获得与患者本身相匹配的组织和器官细胞。
这些细胞可以用于组织工程和器官移植，为缺失或受损的组织提供替代。
5.2疾病模型建立利用IP S干细胞技术可以将患者的细胞转化为特定细胞类型，如神经元、心肌细胞等，从而建立疾病模型。
《小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言在生命科学研究领域，小鼠作为重要的实验动物模型，其胚胎干细胞（ESC）的研究对于理解生物发育机制、疾病治疗以及药物研发等方面具有重要意义。
近年来，二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立为小鼠胚胎干细胞研究提供了新的方向。
本文旨在详细介绍小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立过程及其在科学研究中的应用。
二、材料与方法1. 材料本实验所需材料包括小鼠卵母细胞、受精卵、培养基、生长因子等。
所有材料均需经过严格的质量控制，确保实验的准确性。
2. 方法（1）卵母细胞的获取与培养：从成年小鼠中获取卵母细胞，在体外培养至成熟阶段。
（2）孤雌激活：通过化学或电刺激等方法激活卵母细胞，使其进行孤雌发育。
（3）胚胎干细胞的培养与筛选：将发育至一定阶段的胚胎置于特定的培养基中，通过添加生长因子等物质，促进干细胞的增殖与分化。
随后，通过遗传学和形态学等方法筛选出二倍体孤雌胚胎干细胞。
（4）细胞系的建立与鉴定：对筛选出的二倍体孤雌胚胎干细胞进行扩增，建立稳定的细胞系，并对其进行鉴定，确保其具有多能性和二倍体特性。
三、实验结果1. 卵母细胞的成熟与孤雌激活经过体外培养和激活，卵母细胞成功发育至成熟阶段，并成功进行了孤雌激活。
在显微镜下观察，卵母细胞呈现出正常的发育形态。
2. 胚胎干细胞的增殖与分化将发育至一定阶段的胚胎置于特定培养基中，添加生长因子等物质后，胚胎干细胞开始增殖与分化。
在显微镜下观察，干细胞呈现出典型的集落状生长形态。
3. 二倍体孤雌胚胎干细胞的筛选与鉴定通过遗传学和形态学等方法，成功筛选出二倍体孤雌胚胎干细胞。
通过基因检测和细胞核型分析等方法对筛选出的细胞进行鉴定，确保其具有多能性和二倍体特性。
四、讨论小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立为生命科学研究提供了新的工具。
该细胞系具有多能性、二倍体特性以及稳定的遗传背景等特点，为研究生物发育机制、疾病治疗以及药物研发等领域提供了重要的实验材料。
文献阅读——从小鼠胚胎和成年纤维细胞培养多功能干细胞的诱导由因子决定
文献阅读——从小鼠胚胎和成年纤维细胞培养多功能干细胞的诱导由因子决定原作者：Kazutoshi Takahashi（高桥俊）Shinya Yamanaka （山中伸弥）发表于：Cell Volume 126, Issue 4, 25 August 2006, Pages 663–676一研究介绍：分化的细胞可以通过核转移到卵母细胞，或者通过胚胎干细胞被重新编程到胚胎形态。
原作者证明了从小鼠胚胎或成纤维细胞培养诱导多功能干细胞是通过引入4个因子，即Oct3/4, Sox2, c-Myc,和Klf4决定。
指定的iPS（诱导的多功能干细胞）细胞，能显示出ES细胞的形态和生长特性，以及表达ES细胞标记基因。
皮下移植iPS细胞到裸鼠会造成含有多种来自三个胚层组织的肿瘤。
这些数据表明，多功能干细胞可以直接从通过加入几个决定因子到成纤维细胞培养物中获得。
胚胎干细胞具有无限增值的能力，并且同时保持着多功能性以及分化成三个胚层的能力，所以它可以用来治疗某些疾病。
为了规避伦理问题，因此从患者自身的细胞中提取多功能干细胞。
未受精的卵子和胚胎干细胞中具有赋予体细胞全能性的因子。
研究调查了几个转录因子，得出通过组合选定的因素能够产生多功能干细胞。
二论文选题与分析：研究人员把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。
这证明了细胞的分化不是单向的。
也许最终能够实现直接从病人体细胞中获得多能性细胞的建立。
为减少器官移植的免疫排斥反应的解决提供了可能途径。
其研究过程中开发的检测筛选干细胞的系统也为实验研究提供了新的检测方法三研究思路与技巧：原作者设计了几个实验，并且得到了如下现象与结果：（1）、选定了24个候选基因，通过对G418的抗性检测。
《小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言小鼠胚胎干细胞（Mouse Embryonic Stem Cells, mESCs）的研究对于生物医学领域具有深远的意义。
近年来，关于小鼠二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立与发展受到了广大研究者的关注。
本论文主要阐述如何通过科学的实验设计与操作，成功建立小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系，并对其生物学特性进行详细分析。
二、材料与方法1. 材料实验所需小鼠孤雌激活卵母细胞、胚胎培养基、培养箱、显微操作设备等。
2. 方法（1）孤雌激活卵母细胞的获取与培养；（2）孤雌胚胎干细胞的诱导分化与筛选；（3）二倍体孤雌胚胎干细胞的建立与鉴定；（4）生物学特性的分析。
三、实验过程1. 孤雌激活卵母细胞的获取与培养通过超排技术获取小鼠的孤雌激活卵母细胞，在胚胎培养基中培养至成熟。
2. 孤雌胚胎干细胞的诱导分化与筛选将成熟的卵母细胞进行体外受精或激活，诱导其分化为胚胎干细胞。
通过特定的筛选方法，筛选出具有干细胞特性的细胞。
3. 二倍体孤雌胚胎干细胞的建立与鉴定将筛选出的干细胞进行基因组检测，确保其具有二倍体染色体组。
通过形态学、生长特性、分化能力等多方面的鉴定，确认其为二倍体孤雌胚胎干细胞。
4. 生物学特性的分析对建立的二倍体孤帕胚胎干细胞进行生长曲线测定、多能性检测、基因表达分析等，以了解其生物学特性。
四、结果与讨论1. 结果成功建立了小鼠新型二倍体孤帕胚胎干细胞系，具有稳定的生长曲线和良好的多能性。
通过基因组检测和生物学特性分析，证实了其具有二倍体染色体组和良好的生物学特性。
2. 讨论（1）在孤帕激活卵母细胞的获取与培养过程中，需要优化培养条件和方法，以提高卵母细胞的成熟率和质量。
同时，通过改进体外受精和激活方法，可进一步提高胚胎干细胞的诱导效率和质量。
（2）在筛选和鉴定过程中，应采用多种方法和技术，如形态学观察、生长曲线测定、基因组检测、多能性检测等，以确保筛选出的细胞具有理想的二倍体孤帕胚胎干细胞特性。
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小鼠胚胎干细胞（mES细胞）、小鼠iPS细胞培养Protocol
MEF细胞铺制：
1. 在T25培养瓶中加入0.2%明胶，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱至少放置
15min以上。
2. 吸除0.2%明胶，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。
一般地，一个T25培
养瓶中加入5ml MEF完全培养液。
3. 按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用KM-r P3 MEF或CF-1 P3 MEF；小鼠iPS使用ICR-r
P3 MEF，复苏MEF细胞若干支。
将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
4. 将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，
离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1 × 106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后至于37℃细胞培养箱。
24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。
5. 复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全培养液吸
除，加入2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液待用。
复苏：
1. 将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中是之迅速融解，
取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml小鼠胚胎干细胞，小鼠iPS细胞完全培养液的15
ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。
3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液2 ml，
吹打悬浮。
4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免起泡。
5. 转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。
6. 每天更换小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液。
传代：
1. 一般在复苏后第2-3天传代，视克隆大小和密度而定。
2. 吸除废液。
3. 用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
4. 加入1.0 ml的0.25%胰酶（含EDTA）至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖底面，置于37℃
培养箱内消化细胞。
5. 在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（一般需要1-2 min）。
6. 加2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液终止消化。
7. 多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。
8. 加入足量的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液，吹打混匀，细胞悬液分装到铺
好MEF细胞的T25培养瓶中。
一般地，一个T25培养瓶加入5-6 ml培养液。
9. 放入37℃培养箱内培养。
10. 每天换液。
传代比例：1:4 - 1:7
冻存：
1. 按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。
2. 以1000 rpm，离心5 min，弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液，悬浮细胞。
3. 按每支存管内加入500 ul细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、冻存日期等
基本信息。
4. 将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。
冻存液配方
小鼠胚胎干细胞完全培养液或小鼠iPS完全培养液60%，ES级FBS 30%，DMSO10%。
附：小鼠胚胎干细胞与MEF细胞分离的简易方法（差速贴壁法）：
1. 培养中的小鼠胚胎干细胞，按传代的操作方法将细胞用胰酶消化并吹打成单细胞悬液后，
加入适量的提前温育好的小鼠胚胎干细胞完全培养液重悬细胞，吹打混匀，细胞悬液分装到无MEF细胞的培养皿或培养瓶（一般地，一个T25培养瓶中培养的小鼠胚胎干细胞，在一个10 cm培养皿中进行差速贴壁。
不要事先铺明胶，如铺明胶则细胞贴壁速度过快无法有效分离小鼠胚胎干细胞与MEF细胞）中。
2. 培养皿或培养瓶置于37℃培养箱内静置1小时。
3. 1小时后，绝大部分MEF细胞已贴在培养皿或培养瓶底面，而大部分小鼠胚胎干细胞仍
然悬浮在培养液中。
4. 收取培养液，进行后续实验。