C57胚胎小鼠神经干细胞的分离、培养与鉴定
小鼠胚胎神经干细胞的体外培养及增强型绿色荧光蛋白基因转染研究
ｃ ｔｃ ｍｉｔ ． ＰＥＧ Ｆ ｙｏ ｈｅ ｓｒ ｙ Ｐ ｗｅ ｅ ｒ ｎｓｅ ｒ ｄ ｎ ｏ ｒ ｔａ ｆｆｅ ｉｔ ＮＳ ｂ Ｎｕｃｅ ｆｃ ｏＴＭ ． Ａｆｅ ｓ ｌｃｅ ｂ Ｇ４１ ｔ ｅ ｏｏ ｅ ｗｉｈ ｈ Ｃｓ ｙ ｌ ｏｅ ｔ ｒ ｔ ｒ ｅｅ ｔｄ ｙ ８．ｈ ｃ ｌｎｉｓ ｔ ｔ ｅ ｂ ｓ ｅ ｐｒ ｓ ｉｎ ｆ ＥＧＦＰ ｒ ｏ ｅ ｖ ｄ ｎ ｓ ｌｃ ｅ ｕ ｉｇ ｌｕ ｒ ｓ ｅｎ ｅ ｅ ｔ ｘ ｅ ｓｏ ｏ ｗｅ ｅ ｂｓ ｒ ｅ ａ ｄ ｅｅ ｔ ｄ ｓｎ ｆ ｏ ｅ ｃ ｃ ｍｉ ｏｓ ｏ ｅ ａ ｄ ｄ ｎ ｉｅ ｗ ｔ ｍｍｕ ｏ ｙ ｏ ｃｒ ｃ ｐ ｎ ｉｅ ｔ ｄ ｉ ｉ ｉ ｆ ｈ ｎ ｃ ｔ—
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基础 研 究 ・
小 鼠胚胎 神经干细 胞的体外培养及增强型绿色荧光 蛋 白基 因转 染研 究
武 强 李 露 斯 范 文 辉 杨 忠
摘 要 目 的 ： 索 小 鼠胚 胎 神 经 干细 胞 （ ｅ ｒｌ ｓ ｍ ｃ ｌ ， Ｓ ｓ 的体 外 培 养 ， 讨 Ｎ Ｃ 作 为 基 靶 细 胞 ， 及增 强 探 ｎ ｕａ ｔ ｅｌ Ｎ Ｃ ） ｅ ｓ 探 Ｓｓ 以
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维普资讯
巾图康复医学杂志，０６ 第 ２ 卷， １ 期 Ｃ ｉ ｓ Ｊ ｒａｏ ｅａｉ ａｏ ｅｉｎ ９ Ｉ 鱼 ！ ， ！ ２０ 年， １ 第 ｏ ｈ ｅｅ ｏ ｎｌｆＲｈｂｉｔｎＭ ｄｃ １ ｎ ｕ ｌ ｉ ｔ ｉ ＿ ． ！ ： ： ！
成年C57小鼠脊髓神经干细胞的培养与鉴定
成年C57小鼠脊髓神经干细胞的培养与鉴定郎兵;孟晋宏;杨浩;刘惠玲;焦西英;游思维;王百忍;鞠躬【期刊名称】《中国神经科学杂志》【年(卷),期】2004(20)5【摘要】目的从成年小鼠脊髓中培养神经干细胞,并对其进行鉴定和诱导分化。
方法成年C5 7小鼠 ,悬浮培养神经干细胞技术。
结果培养 1～ 2周时 ,培养液中即可出现神经干细胞克隆球。
该克隆球具有很强的自我增殖能力,可多次传代。
免疫细胞化学技术证明该克隆球表达大量的神经干细胞特征性的中间丝———巢蛋白(Nestin) ;经 1%胎牛血清诱导后可表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特征性标志物β tubulinIII、胶质纤维酸性蛋白(Gliafibrillaryacidicprotein ,GFAP)和RIP ,提示它们可朝神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞方向分化。
结论本研究结果提示正常成年C5 7小鼠脊髓中含有神经干细胞 ,在体外条件下可以大量增殖。
【总页数】5页(P363-367)【关键词】神经干细胞;巢蛋白;免疫组织化学;细胞培养;脊髓;小鼠【作者】郎兵;孟晋宏;杨浩;刘惠玲;焦西英;游思维;王百忍;鞠躬【作者单位】第四军医大学基础部全军神经科学研究所【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.成年大鼠脊髓神经干细胞的培养与鉴定 [J], 高峰;贺世明;王学廉;高国栋2.C57胚胎小鼠神经干细胞的分离、培养与鉴定 [J], 万丽;易桦林;贝伟剑3.成年小鼠神经干细胞培养、鉴定以及多不饱和脂肪酸含量的测定 [J], 张正卫;俞俊峰;王荣根;阮苗苗;张润洁;方斌;王冠;王盈;戴一凡4.人胎脑组织神经干细胞的分离培养、克隆和分化/EGF和bFGF对成年大鼠神经干细胞增殖和分化的影响/小鼠脊髓重量和脊髓颈膨大截面积的基因组扫描分析[J],5.C57胎鼠、乳鼠及成年小鼠心室肌细胞分离、培养及鉴定 [J], 张玲;段明军;魏琴;陈华;时利;侯月梅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小鼠胚胎干细胞培养
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。
一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM（高糖）马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。
动物克隆 第三章胚胎干细胞分离培养
第三章胚胎干细胞分离培养1981年，Evens等首次发现小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)在体外具有稳定增殖并维持未分化状态及分化全能性潜能的特性，并成功建立小鼠ESCs系[1]。
由于ESCs独特的生物学特性，ESCs方面的研究迅速成为生命科学研究领域的热点之一，1999年－2000年连续两年被评为世界十大科技新闻。
ESCs已成为分子遗传学、发育生物学、细胞工程、组织工程等研究的重要工具，在研究细胞分化机制、临床治疗、转基因等方面有着重要的意义。
随着对干细胞研究的不断深入，人们将逐渐掌握和利用干细胞，还将推动相关学科的发展。
文章综述了ESCs的研究概况、体外分离培养、生物学特性、鉴定方法、影响ESCs分离培养的因素、存在问题以及应用前景等。
1 胚胎干细胞研究概况ESCs的研究最早要追溯到畸胎瘤细胞的发现，但真正意义上的开始却是1981年Evens等首先从延缓着床的胚泡分离培养到小鼠的ESCs，并建立小鼠的ESCs系，之后ESCs研究迅速发展，已在大鼠、仓鼠、猪、牛、水貂、兔、山羊、绵羊、恒河猴和人等多种哺乳动物上建立了类ESCs系[2]。
近几年来，ESCs研究在ESCs来源与培养方法、探索建立和维持ESCs系的条件、定向诱导分化、遗传操作、疾病动物模型的治疗等方面取得了一定的进展。
研究人员利用体细胞核移植技术进行胚胎重建，从克隆胚胎中成功得到小鼠、兔和人等多种哺乳动物ESCs[3-5]；利用孤雌激活技术建立小鼠和非人灵长类孤雌激活胚胎源的ESCs系[6]，这些为ESCs的分离克隆开辟了新的途径。
利用定向诱导分化技术成功将ESCs分化为造血细胞、内皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、胰岛细胞、心肌细胞、成骨细胞，甚至滋养层细胞和生殖细胞等所有3 个胚层的细胞类型[7-13]。
试验表明，人ESCs 能有效治疗心肌梗死、糖尿病、中风等疾病。
国内在ESCs方面的研究起步较晚，但发展迅速，在相关领域做了大量的研究。
C57BL／6-gfp小鼠嗅球NSC培养及定位注射方法的建立
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中华 神 经 外 科 疾 病 研 究 杂 志 （ ｈｎＪＮ ｕｏｕｇＤｓＲ ｓ ２０ ；（ Ｃ ｉ ｅｒｓｒ ｉ ｅ ）０ ９ ８ ２
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文章 编 号 ：６ １ ８７ ２ ０ ） ８—１１— ４ １７ —２９ （ ０ ９ ０ ３ ０
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论著 ・
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
小鼠胚胎中脑神经干细胞分离、培养及分化
小鼠胚胎中脑神经干细胞分离、培养及分化刘兵;刘洪涛;戴冀斌;彭超华;黄娟【摘要】目的:探讨小鼠胚胎中脑分离神经干细胞的体外培养方法,以获取高纯度的神经干细胞,为神经干细胞的深入研究提供试验材料。
方法:无菌条件下分离孕12~13 d小鼠胚胎中脑曲,制成单细胞悬液,碱性成纤维生长因子(bFGF)和B27存在的培养基中培养扩增,通过免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞及子代细胞的分化方向,流式细胞术检测TH阳性神经元比例。
结果:培养的部分细胞体外分裂增殖,同时表达神经干细胞特异性抗原nestin,并向神经细胞和胶质细胞分化并经流式细胞仪检测自然分化为多巴胺能神经元的比例为3.25%。
结论:小鼠胚脑中脑存在具有多分化潜能的神经干细胞,它们能在体外稳定培养、传代和分化。
【期刊名称】《长江大学学报：医学卷》【年(卷),期】2006(000)012【总页数】4页(P)【关键词】神经干细胞;培养;分化;中脑【作者】刘兵;刘洪涛;戴冀斌;彭超华;黄娟【作者单位】长江大学医学院;武汉大学医学院;武汉大学医学院;湖北荆州;湖北荆州;湖北武汉【正文语种】中文【中图分类】Q813神经干细胞(neural stem cells, NSCs)是一类广泛存在于胚胎及成体中枢神经系统的早期未分化细胞，被认为是神经系统的“发源地”[1]。
应用神经干细胞移植的方法修复神经系统脑的损伤与治疗人类神经退行性疾病中更显示出其优越性,其中最具有代表性的就是怕金森病，然而，这种方法在患者中广泛应用的障碍就是胚脑移植的问题。
本试验对小鼠胚胎中脑神经干细胞的分离和培养进行了尝试，为神经干细胞的进一步研究奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料1) 实验动物孕12～13 d昆明小鼠(E12～13 d，SPF级)，由武汉大学医学院实验动物中心提供。
2) 试剂 DMEM/F12培养基，特优级胎牛血清(FBS),B27均购自GIBCO公司；碱性成纤维生长因子(bFGF)购自Peprotech公司；胰酶(Trypsin)、DNA酶1(DNase1)、左旋多聚赖氨酸(PLL)和DAPI购自SIGMA公司。
小鼠胚胎干细胞的鉴定
小鼠胚胎干细胞的鉴定小鼠ES细胞的鉴定主要围绕ES细胞的形态、核型、分化潜能和特异性染色等方面进行。
一、形态学观察小鼠ES细胞的形态特点为圆形或扁圆形，表面平滑，体积较小，核质比大，有一个或多个凸起的核仁结构。
经培养后紧密聚集，细胞之间界限不清，形成岛状，巢状群体生长状态，集落边缘整齐，与滋养层细胞界限分明且色泽深亮，克隆的边缘可以看到比较清晰的单个细胞。
多次传代消化或改变培养基的成分，如降低血清浓度、去除LIF或碱性FGF等某些生长因子时，悬浮培养形成的细胞团开始出现松散，球形的边缘可以清楚地看到圆而大的细胞，细胞团开始自分化。
二、核型分析正常的二倍体核型特征是ES细胞全能性的基础，因此需要对所建立的ES细胞系的核型进行鉴定分析。
【实验材料】1.材料载玻片、镊子、离心管、移液管、吸管、35mm 培养皿（Corning，430165）。
2.试剂Demecolcine（Sigma，D6165）、Giemsa（Sigma，G4507）、NaH2 PO4（Sigma，S6566）、Na2HPO4（Sigma，S5136）、甲醇、冰醋酸。
配制类试剂：①磷酸缓冲液：0.2mol/L NaH2PO4+0.2mol/L Na2 HPO4；②Giemsa染液：8ml磷酸缓冲液+2ml Giemsa贮存液，吹吸混匀；③固定液：甲醇∶冰醋酸=3∶1（现用现配）。
【实验步骤】1.将需要做核型分析的ES传代，通常用一个35mm皿的细胞做核型，在传代后25～40小时向培养皿中加入0.2µg/ml democolcin，继续培养1～2小时。
2.取出培养皿，用标准传代的消化方法将其消化成单细胞悬液，1200r/min离心10分钟，弃上清，注意：上清要吸得彻底些。
3.加入事先预热至37℃的0.56%KCl低渗液4ml，用滴管吹打成单细胞悬液（较剧烈），37℃低渗处理15～20分钟。
4.配10ml固定液，4℃冰箱预冷。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化 ...
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）体外分化方法注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
成年小鼠海马区神经干细胞的分离 培养及鉴定
成年小鼠海马区神经干细胞的分离
朱 欢
培养及鉴定
唐金 熹 李 云 秦琬 莹 王 晓侠 伍 学恒 刘 晓灿 杨 柳 广 西 师范 大学 生命科 学 学院 ，广 西 桂 林 ５ ４ １ ０ ０ ４
摘 要 ： 目的 ：从 成 年 小鼠 海 马 区分 离 出潜 在 的 神 经 干 细 胞 （ ｎ ｅ ｕ ｒ ａ ｌ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ，Ｎ Ｓ Ｃ ｓ ） 亚 群 ， 同 时建 立 一种 简 单 有 效 的成 年 小鼠海马 区神经干细胞 的分离、培养及鉴定的方法。方法：结合酶消化法和机械 吹打法从 Ｃ ５ ７ ／ Ｂ ６小鼠脑 组织海马 区分 离出神 经细胞 ，行 Ｃ Ｄ １ ３ ３和 Ｇ Ｆ Ａ Ｐ抗体 染色，经流式细胞分选仪 分选 出 Ｃ Ｄ １ ３ ３ ＋ Ｇ Ｆ Ａ Ｐ ＋ 细胞 群 ：经无血 清培 养鉴定其体 外 自我更新与增 殖 能力 ： 用免 疫 荧 光 法鉴 定 其 体 外 分 化 潜 能 。结 果 ：从 成 年 小 鼠 海 马 区分 离 出 了一 群 可 以体 外 增 殖 的 Ｃ Ｄ １ ３ ３ ＋ Ｇ Ｆ Ａ Ｐ ＋ ￣胞 群 ， 且 该 群 细 胞 在 体 外 可 以分 化 为 Ｂ…－ ｔ ｕ ｂ ｕ ｌ ｉ ｎ阳性 神 经 元 （ ｎ ｅ ｕ ｒ ｏ ｎ ） 、Ｇ Ｆ Ａ Ｐ阳性 星形 胶 质 细胞 （ ａ ｓ ｔ ｒ ｏ ｃ ｙ ｔ ｅ ）和 Ｍ Ｂ Ｐ阳性 少 突胶 质细胞 （ ｏ Ｉ ｉ ｇ ｏ ｄ ｅ ｎ ｄ ｒ ｏ ｃ ｙ ｔ ｅ ） 。结论 ：Ｃ Ｄ １ ３ ３ ＋ Ｇ Ｆ Ａ Ｐ ＋ ￣胞 群具有体 外增殖 与分化 的能力，是一群真正的神经干细胞亚群 ，并建 立 了稳 定 且 简便 的 分 离 、 培 养 及 鉴 定 成 年 小 鼠 脑 海 马 区神 经 干 细 胞 的 方 法 。 关 键 词 ：神 经干 细胞 ：海 马 区 ；增 殖 ；分 化
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-C57胚胎小鼠神经干细胞的分离、培养与鉴定广东学药学院报ournJa lfoGuang dngo ParmhceutiaalcUn ievrstyiunJ 2．14， 030（3）C 7 5胚小胎神经鼠干胞的分离、培细与养定鉴 12 万丽 1 易，林，桦贝伟剑（1 广．药学院东中医药研究 / 广东省院代性谢病疾中医防治药重实点室验，家国中医药理局管脂高血调肝降脂症重研点究室/ 国家中药管理医局代谢脂级实三室验，东广广 5州10006 ；．2中大学山生科命学院干学胞研究细室，广广州东510 006）培养神经干胞细（NSCs ）并，对其行进鉴定方。
采法用动手法胰蛋白酶消化及法摘：要的体外分目离分离、鼠脑细胞胎，用化的无优血清NS C 培s养基行进养培。
细胞疫免光荧检法测N CSs特异性标记子 3 d分左获右得大未分量化巢呈悬浮状生的长表的达结。
果分离脑的细体胞培外养48 h已部分大壁贴神，经干胞细团第 3 代时，。
少很见到贴细壁胞，几乎是神全球，经神经球周围在存较多刺微。
细表胞达一中种间丝蛋白，即巢蛋白（nes ti）n 。
论结成功分、离鉴定出C57小鼠 NSsC，并在体外可件条进下行传扩增培代养。
关键词：C 57 胎小胚；鼠经干细胞；神胞细培；养蛋巢白中分图类：号Ｒ392 文献志标码 A：d i： 10．o396 9j/．sin．1s060873．8214003．0．22878 （3 214）0 00354340 章文编号：0016-Islaoion，t culurtean d iedtifnciaitnoo f eunalrste mcel sl rfmoC5 e7bmyorin mccieWN Ai1L， IYHual n2 ，iBEI W iejia1n 1．（uGnagdogn TMCKey L abratory ofroM taboelc iisDaees，s Ky eLbarotorayo Modfluaintg Lievrt oTrat HepeyripemlaiS ATM， anC Ldeev 3l Labraotroyo f Liid Mpteboaism SAlTM，CIn stiute oftChinese edMciinla Sicneec，GsuagnongdPha racemtucail UinvesrtyiGuan，gzohu5 1006，0hCin；a 2．St m eCle Ｒlseeacrh Depratmne，t choSlo o fifL Sceeicens， uS nYtasn Ueinersivyt， Guagnzhou， 50006，1China） bsArtatc：Obejtivc Toei slotae cu，turl aned deitnfiy hte eunarlste m cllse（ SCN ）s． Meth od NSsCs for mftal eimce ewe irsloteda bydi sesticon ad nnzeyatmi dcgiestoin a，n ductlrude ni he opttima slreufreem SCN mdeimu． he Tpesifcicb ioamker orfSNC wssa deteted by cmiumnocyotluoresfect assan．y esuＲlst hTe islatedo NSsC dahree dt oth ceutlru elpta ewihit n48 ，and hnstelik clesuetr ofsN CS weresobta iednin th eulcturesus pnseoinin abo u t 3．dOn te 3hth asspgea sf NoSC， asherend cetlsla re arelyrseen， a nd nealryal l erwene rusohperesw th spiinlu． eNsten wasi exprssee idnt ehc ulutrdceels． ClncoulisnoN CS sar secucesfuslyl silaoted an dcutlreu dfomr fetl Ca75mi ec ，adnc olud polifrertae nivitro ． eyKwo rsd C：57 mbeyoricn mci；e nerul stea cemll；s cel cluturel；nest inNCSs）具分有化为经干细胞神（ne uarstemlcle，l神经元、星形质胶细胞少和胶突质细的能胞，力能自。
更我新，并足提以供量大脑组细胞织细的群，，胞SCsN现发已现多种型类的中神经系枢损统后伤激活并被利于有组的损织伤修和功能复复恢。
因400 收2日稿：期2 01［421］此，研究NS Cs 的物学生于对神经统损系修复伤和34［］。
临床用中应，退行病变的性疗治具重有意义要NSsC的来源数量和限是有前存目在的主要题问。
N Ss C体的培养外和增对扩实于其现在潜价值此，［因65 ］。
SCs N的体获外取可过直接通具有从重要用作金项目：基广东省育部产学教研结项目（合202109B1011039 ）；州广科技市计助划项目资（1 1C21307338）3359607，2Em al： 107i515171@9qq ．c m； o通信作要从事中主药药理究研电，： 02话0作简介：者万丽 198（8—），女，士研硕究生，maiE：l biwje200@ a0iyun．lco。
m者贝伟：剑（1 69—） 3，研究，主员要事中从药理研究和新药研发，药男博，士，051 9：6 55 络网版出间：时2 140网出版络地址 ht：pt / ： www．/nkcine．t/ cmk / details 4/．4141．3Ｒ20．4051160．55．091．htm0l3期第等．C57胚胎鼠小神经干细的分离、培胞养鉴与定丽，万355神经组分织离培、养他来其源细干的胞诱分导、永化主要过悬通浮长生贴和生的化SNCs3 种径实途，现壁培养2种方式进行体外扩增。
悬浮神经球（n uersphero aessya，SN A）是 N CS 体外s培养最中常用的方，式该基于 N法SsC 在外无体血清培养中基可依有丝赖裂原分的系维、悬浮成球生长、维自持我［7］更新和分未化态的状特发点建立展来起。
尽管神球经法对相简易单，行不同验室提实出各自的操开腹腔，露两侧暴子，宫用科眼镊住钳宫头子端，顺宫分离至子宫角子剪下处，放入有冰 PS B溶液培养皿，中依次去子宫壁除和膜，胎细仔分离得到组脑织，手动得法到胎鼠脑细。
胞冰 D的MM /EF12 洗涤1遍，加入0．1% （ 0 φ）的胰蛋酶白，在恒培温摇床养MDEM/ F21 终消化。
用止 010上37 ℃消化 30 min， 1 00 0 r /mni 目筛子，过滤收，集于心离中，管离心3 imn，去上，清加入已配制的好NCS 培养基s（含NCsS 2B27、 %0 2gn/ L EGF、 20m g n /m 基 L 础培养、基FGFb）制成单胞悬细液细，计数胞后，之加入6孔板。
3 1。
中原培代养每换天次 1液．．22C 5 胚7 胎小鼠NSCs 的培养和纯化相差显在镜微每下观察天鼠小 SCsN 的贴壁悬及、浮生长作程序但，NSCs 培养对件条和作技术操求要高，不同发育较段脑组织阶的择、细选胞分消化和接种离代方传式、培基成分等细节的养变都会影改 NS响C 的s培养果，结因而如何得获稳、体定增外能力殖和低度成球密力强、能能反复传代的 N够Cs 是NSCsS研［8 究］的基本问题本研究。
从定特育阶发脑段织获取细胞组通过分，离培方养的不法优化断，立从建2．5 1d C57 的孕胚胎鼠脑分中离养培NSCs 方的法。
情和况形变化。
态待细生胞密度达长＞ XX%到长满时，贴壁对分部和浮部分分悬用别0．12 % 5的蛋胰白消化 3 酶inm，开分培，养至第代 3 P3（，）可以到较纯且活得较性好的神干细经胞球。
1．．2 13．．321． 5C 胚7胎鼠的小 SNs 的鉴定C光观察镜倒置微镜显下察不观同间点时神经细胞和干经神球的形态。
11．1料与材方法材料试剂．11．1NSCs 基培础养（基山中学生大科干院细胞中心张雁教授惠赠）； B27（ Gi co 公b司）； FbF （ GroSPecpaTnyT echoGenn eLt．公d司）； EF （ GPrSopecTna yTehcnoeGenLtd．公司）；胰蛋白酶、1．2．32N．CS s 志标蛋 n白sten 表达i 的检测将P 神3经转移至用球 L聚多氨酸包被赖盖的片玻，养培DME/M 1F（2 Hylcoen公司）； PB S、 4% L多赖聚酸、氨（）φ的聚多甲、醛 riTonX100 t （国鼎物技术生有限公司）；山羊清血博奥森（生技物术限有公）司；兔抗巢蛋（ n白etsn）i克多抗隆（体美国 S nata ruzC公）司；抗羊兔 Dy lgith94 （5 aErthx o）； Hocehs33t58、 2片液（封Be yotime公）司。
1．1． 2主仪要器高速冷冻离心机（德国Ep pndore ）f ；水式套CO2 养培（美箱国Shel La 公司 b）；荧倒光置微镜（显国德eZsi s司公）倒；相置差显镜微日（本O ylmusp公司；）B T224S 分天析平［赛多利斯 Sa（troiru）s 科学仪（器北京）有限司公］； P UEＲLAB PUＲLAEBU LTAＲG EM K 超2 Option纯7S 纯机水、5 全0自高压动消毒水锅机 ELGA ）（； HV E H（rayiaam）； CB499WDX冰箱（Haer ）i ；HT10Z3B 恒培养摇温床（上一恒科学海仪有限器公司）。
．1．2 1实动物验C5 7B /L 6小鼠， 18 0，d雌，性自购中山学大实验动中心，生物产可许证号SC KX（粤 201）10029 。
．2 1法方1．2． C157 胎小鼠胚 SNC 的s离分孕将 21． 5 d的 57C 鼠断颈处孕，用死酒精消毒后，之腹沿正中线［9打］至胞大细分部贴壁。
去弃胞培细液，养用 PBS 洗 3 。
遍加4%多聚甲醛定固3 m0in ，加PBS 冲洗 5 mi n× 3 ；0． 2%T irtxo10 0室温膜破1 0inm，P S 洗 B涤5 mi n 3；×5 %的羊山血室温封清闭03mi n P，SB 涤洗 5 mn × 3；i 一抗 nestn i 1 （5∶0 ）4 ℃孵育过夜、抗二 yDLiht g945A ffiniPur Goat enAtiＲabbit gIG （ +HL ）（∶11 00）室温避光孵l h，育oeHcsh33t52 （ 18μg m/）L室温避光复核染15 m ni，P SB冲洗 2 遍，封片，显微镜察观。