凯氏定氮法
凯氏定氮法课件
2NH4Cl + 4H3BO3
(注: NCOC, Nitrogen containing organic compounds )
整个过程分三步：消化、蒸馏与吸收、滴定
1. 消化
要预防暴沸
<1>加硫酸钾 作为增温剂，提升溶液沸点， 纯硫酸沸点 340℃，加入硫酸钾之后能够提升 至400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提 高沸点，但效果不如硫酸钾。
凯氏定氮法
测定蛋白质含量旳措施 凯氏定氮法
双缩脲法
Folin－酚试剂法
紫外吸收法
• 其中： • 凯氏定氮法——最常用旳，国内外应用普遍。
凯氏定氮法
• 凯氏定氮法可分为全量法、微量法及经改 善后旳改良凯氏定氮法。
微量法：取消化液旳10%加碱蒸馏
常量法：取消化液旳全部加减蒸馏。
（一）常量凯氏定氮法
(NH4)2SO4 检验
⑩蒸馏前加NaOH要足量，溶液应变为深蓝色或 黑褐色↓（Cu（OH）2、CuO、铜氨离子），如 颜色不变可能碱不够 。
⑾蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗 管口，再蒸1分钟后关掉热源．不然可能造成吸 收液倒吸。
⑿H3BO3吸收液旳温度不应超出40℃，不然对 NH3旳吸收作用减弱而造成损失。
原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分 解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中 旳有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏， 使氨蒸出。
① 用H3BO3吸收后再以原则HCl滴定或H2SO4溶液滴定。 根据原则酸消耗量能够计算出蛋白质旳含量。
② 也能够用过量旳原则H2SO4或原则HCl溶液吸收后再ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ以原则NaOH滴定过量旳酸。
马铃薯含非蛋白氮多。
总结凯氏定氮法
注意事项： 在蛋白质测定过程中应注意与采用氨试剂的检测项目 时间错开，确保环境空气中无氨气的存在，否则将影响蛋白质的测定 结果，使最终结果偏高。 三、结果计算：
X4（干基）= (V1 - V0)×0.014×C×6.25 W（1-水分%）×0.1 ×100……… (4)
式中： X4 W V1 V0 C 0.014 6.25 试样的干基蛋白质含量， （%） ； 试样质量， （g） ； 滴定样品所消耗盐标准溶液体积， （mL） ； 滴定空白所消耗盐酸标准溶液体积， （mL） ； 盐酸标准溶液的浓度， （mol/L） ； 1mL1mol/L 盐酸溶液相当于氮的质量， （g） ； 氮换算为蛋白质的系数。
c·2%的硼酸溶液：2g 硼酸加蒸馏水定容至 100mL； d·浓硫酸： e· 复合催化剂： 硫酸钾或硫酸钠 97g 和无水硫酸铜 3g 的混合物； f·混合指示液：0.1%的甲基红乙醇溶液 20mL 与 0.2%溴甲酚绿 乙醇溶液 30mL 混合摇匀。 二、 分析步骤 a·消化：称取混匀的样品 3g（精确至 0.001g） ，放入干燥的凯 氏烧瓶中（避免样品粘在瓶颈内壁上） ，加入混合催化剂 10g，硫酸 25mL，轻轻摇动烧瓶，使样品完全湿润。然后将烧瓶以 45 角斜放在 支架上，用电炉缓慢加热，当瓶内泡沫消失后强热至沸。待瓶壁不附 有炭化物时，且瓶内液体为澄清浅绿色后，继续加热 30min 使其完全 分解（以上操作应在通风橱内进行） 。 b·蒸馏：将消化好并冷却至室温的样品溶液全部转移到 100mL 容量瓶中， 用蒸馏水定容到刻度摇匀。 向 100mL 接受瓶中加入 20mL2% 硼酸溶液和 2～3 滴混合指示液，将接收瓶置于冷凝管下口，使下口 浸入到硼酸接收液中。再吸取 10mL 定容后的样品液，沿小玻璃杯移 入反应室，并用少量的蒸馏水冲洗小玻璃杯，塞紧棒状杯塞。向小玻 璃杯中加入 20～30mL40%的氢氧化钠溶液（过量） ，慢慢提起棒状杯 塞，使氢氧化钠缓慢流入反应室（防止反应室气体从杯塞处外泄） ， 立即塞紧棒状杯塞，并在小玻璃杯中加入蒸馏水使之密封。通入蒸汽 5min，降低接收瓶位置使冷凝管末端离开液面后再继续蒸馏 1min， 用少量蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液并入接收瓶，取下接收瓶。 c·滴定：用 0.01mol/L 的盐酸或硫酸标准溶液滴定接收瓶瓶中 的液体，使之刚刚出现灰紫色即为终点，记录所消耗 0.01mol/L 的盐 酸或硫酸标准溶液的体积（mL） 。
凯氏定氮法
凯氏定氮法中文名称：凯氏定氮法英文名称：Kjeldahl determination定义：测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
原理蛋白质是含氮的有机化合物。
食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。
含氮量*6.25=蛋白含量.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4作用下，硝化生成（NH4）2SO4凯氏定氮法反应式为：2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4（其中CuSO4做催化剂）2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中反应式为:(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量反应式为：(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3试剂所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
2.1 硫酸铜。
11.凯氏定氮法名词解释
凯氏定氮法名词解释
凯氏定氮法是一种常用的蛋白质测定方法，其原理是通过测定样品中氮元素的含量来推算蛋白质的含量。
以下是关于凯氏定氮法中涉及的主要步骤的名词解释：
1.样品处理：在凯氏定氮法中，需要对样品进行前处理，即将样品中的蛋白质转化为氨基酸。
这一步通常是通过在样品中加入硫酸和催化剂，然后在高温下进行消化反应来实现的。
消化反应可以将样品中的有机物质转化为硫酸铵，同时将蛋白质转化为氨基酸。
2.蒸馏：在消化反应完成后，需要进行蒸馏操作。
蒸馏的目的是将样品中的氨气从消化液中分离出来，以便后续的吸收和滴定操作。
在蒸馏过程中，需要使用特殊的蒸馏装置和高温炉，以确保氨气能够完全从消化液中逸出。
3.吸收：蒸馏出来的氨气需要被吸收液吸收。
通常使用的是硼酸溶液作为吸收液，因为它具有较高的吸收效率和较低的挥发性。
在吸收过程中，氨气与硼酸反应生成硼酸铵，然后通过滴定操作可以测定硼酸铵的量，从而计算出样品中氮元素的含量。
4.滴定：滴定操作是凯氏定氮法中的最后一步，也是最关键的一步。
在这一步中，使用标准酸溶液对已经被吸收的硼酸铵进行滴定，从而确定硼酸铵的量。
通过与标准酸溶液的对比，可以计算出样品中氮元素的含量，进而推算出蛋白质的含量。
以上就是凯氏定氮法中的主要步骤和相关名词解释。
该方法具有准确度高、适用范围广等优点，被广泛应用于食品、药品、环境等领
域中的蛋白质测定。
凯氏定氮法
凯氏定氮法凯氏定氮法（英语：Kjeldahl method，全称凯耶达尔定氮法，简称凯氮法）是分析化学中一种常用的确定有机化合物中氮含量的检测方法。
这种方法是由凯耶达尔于在1883年发明。
凯氏定氮法是分析有机化合物含氮量的常用方法。
要测定有机物含氮量，通常是设法使其转变成无机氮，再进行测定。
一、原理：凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。
为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、氧化汞、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类类提高沸点，但效果不如硫酸钾。
硫酸铜起催化剂的作用。
凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、钼酸钠等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜。
使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化。
消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化钠，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接受瓶内，硼酸接受氨后，形成四硼酸铵，然后用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。
滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。
在滴定过程中，滴定终点采用甲基红-次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定。
测定出的含氮量是样品的总氮量，其中包括有机氮和无机氮。
以蛋白质为例，反应式如下：消化：蛋白质+ H2SO4→（NH4）2SO4+ SO2↑+ CO2 ↑+ H2O蒸馏：（NH4）2SO4 + 2NaOH→ Na2SO4+ 2 H2O + 2NH3 ↑2NH3 + 4H3BO3→（NH4）2B4O7+ 5H2O滴定：（NH4）2B4O7+ 2HCl + 5H2O→2NH4Cl + 4 H3BO3蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量[约在14％~18％，平均为16％（质量分数）]。
凯氏定氮法
2.4 注意事项
（1） 所用试剂应用无氨蒸馏水配制。加
指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈 酸性。 （2） 若样品含脂肪或糖较多时，应注意 发生的大量泡沫 应加入少量辛醇或液体 石蜡，或硅消泡剂，防止其溢出瓶外， 并注意适当控制热源强度。 （3） 若样品消化液不易澄清透明，可加 入300g/L2~3ml 过氧化氢后再加热。
消化反应方程式如下： 2NH2(CH)2COOH＋13H2SO4 ＝(NH4)2SO4＋6CO2＋12SO2 COOH＋ ＋16H2O 浓硫酸具有脱水性: 浓硫酸具有脱水性:使有机物脱水后被炭化为碳、氢、 氮。 硫酸又具有氧化性: 硫酸又具有氧化性:将有机物炭化后的碳化为二氧化 碳，硫酸则被还原成二氧化硫 2H2SO4 ＋C ＝2SO2＋ 2H2O ＋CO2 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫， 氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。 H2SO4＋2NH3 ＝ (NH4)2SO4
③ 滴定 滴定：取下接受瓶，以0.01000mol/L盐酸标 准溶液滴定至微红色为终点。
(V1 − V0 ) × c × 0.014 × F (5) 结果计算： W = ×100% V2 m× 100
式中W—蛋白质的质量分数，%； V0—滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V1—滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V2—蒸馏时吸取样品稀释液体积，mL； C—盐酸标准液的浓度，mol/L； 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； F—蛋白质系数； m—样品质量，g。
② 蒸馏 在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性， 在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性， 加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下： 加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下： 2NaOH＋ (NH4)2SO4＝ 2NH3↓＋ Na2SO4 ＋ 2H2O OH＋
凯氏定氮法
常量法 原理：
样品中含氮有机化合物经浓硫酸加消化，硫酸使有机物脱 水； 同时有机物炭化生成炭；
碳将硫酸氧化C成CO2自身还原为SO2 ；
2H2SO4+C=2SO2+2H2O+CO2
SO2使氮还原为氨，本身则氧化为SO3； 在反应过程中生成的氢，又加速氨的形成； 生成物中水和SO2逸去，氨与硫酸结合生硫酸铵留在溶液 中。 H2SO4+2NH3=(NH4)2SO4
有关加入K2SO4 CuSO4说明：
(1)、K2SO4的作用：提高溶液沸点从而加快 有机物分解（较其他硫酸盐效果好） 原理： K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO2
• 但加入过多硫酸钾会导致体系温度过高， 引起生成的（NH4)2SO4热解造成N损失。 • （NH4)2SO4=NH3+NH4HSO4 • NH4HSO4=NH3+SO3+H2O
NH3+H2O
3、吸收与滴定
• 加热放出的氨用硼酸吸收，待吸收完后， 用盐酸标准液滴定
NH3 + H5BO3 NH4+ + H2BO3-
H2BO3- + H+
H3BO3
以上离子方程式说明:硼酸是弱酸，盐酸为强酸， 强酸制弱酸，且不影响指示剂显色结果
凯氏定氮法—原理小结
消化
• 2NH2+H2SO4+2H＝(NH4)2SO4 • （其中CuSO4做催化剂）
• • • • •
重要试剂的作用： 浓H2SO4：脱水、氧化 CuSO4溶液：催化剂（加速有机物氧化） 消化指示剂 K2SO4溶液：提高溶液沸点
（ ） 仪 器
凯氏定氮法原理
凯氏定氮法原理
凯氏定氮法（Kjeldahl method）是一种常用的确定有机物中氮含量的化学测定方法。
其原理是将样品中的有机氮化合物经过一系列化学反应转化为无机氮化合物，再以标准化的方法测定生成的无机氮化合物的氮含量。
具体的步骤如下：
1. 取一个已知质量的样品，在水中溶解或者研磨成细粉末。
2. 将样品转移到凯氏消解瓶中，加入适量的浓硫酸。
3. 使用适当的消解器对样品进行消解。
在这个过程中，硫酸将有机氮化合物氧化为氨。
4. 将消解瓶中的溶液加热，使硫酸与氨反应生成硫酸铵。
H2SO4 + 2NH3 → (NH4)2SO4
5. 硬蒸发：将反应产物溶液转移到蒸发皿中，连续加热使溶液蒸发，直至生成块状固体。
6. 汲取蒸发皿中的固体，转移到蒸发烧杯中，加入适量的蒸馏水。
7. 加入酚酞指示剂，用稀氨水滴定生成的硫酸铵溶液，直至溶液呈现由粉红色到淡红色的变化。
8. 记录滴定过程中用掉的氨水体积，根据滴定液的浓度计算出氨的摩尔浓度。
9. 根据反应平衡关系计算出样品中有机氮化合物的质量，从而确定氮的含量。
凯氏定氮法主要适用于测定含氨基的有机化合物，如蛋白质、碱性氨基酸等的氮含量。
这种方法的优点是准确性高，并且适用范围广。
然而，它的操作步骤较为繁琐，消耗时间较长，且需要使用一些具有腐蚀性的试剂，需注意安全操作。
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凯氏定氮装置仪器使用->凯氏定氮装置凯氏定氮仪由蒸汽发生器、反应室、冷凝管三部分组成（见下图）。
凯氏定氮蒸馏装置示意图1.电炉2.蒸气发生器3.安全管4.橡皮管5.碱液室6.反应室7.加样口8..安全管9.冷凝管10.接受瓶 11.棒状玻塞12.夹子仪器原理：含氮有机物与浓硫酸共热，有机物中所含氮转变成氨，并与硫酸结合为硫酸氢铵和硫酸铵，用氢氧化钠碱化后，释出氨，随水蒸馏出，用硼酸溶液或定量的酸吸收后，用标准酸液或标准碱液滴定，用空白试验校正。
使用方法：1. 定氮仪的构造和安装蒸汽发生器包括一个电炉(1)及一个3～5升容积的烧瓶(2).蒸汽发生器借橡皮管(4)与反应室相连。
反应室上边有二个小烧杯，一个叫加样口(7) 上面有棒状玻塞(11)供加样用；一个叫碱液室(5) 盛放液。
样品和碱液由此可直接到反应室 (6)中。
反应室中心有一长玻璃管，其上端通到反应室外层，下端靠近反应室的底部。
反应室外壳下端底部有一开口，连有橡皮管和管夹 (12)，由此放出反应废液。
反应所产生的氨可通过反应室上端气液分离器 (8)经冷凝管 (9)通入收集瓶 (10)中。
反应室与冷凝管之间由橡皮管相连。
2. 样品的处理固体样品随机取一定量研磨细的样品放入恒重的称量瓶中，置于105℃的烘箱中干燥4h用坩锅钳将称量瓶取出放入干燥器内，待降至室温后称重，随后继续干燥样品，每干燥1h，称重一次，恒重即可。
血清样品取人血（或猪血）放入离心管中，于冰箱中放置过夜。
次日离心除去血凝块，上层透明清液，即为血清。
吸出1ml血清加到50ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀备用。
3. 消化取3支消化管并编号，在1、2号管中各加入精确称取的干燥样品0.5～1g，加催化剂6.4g，浓硫酸10ml和2粒玻珠，在3号管中各加相同量的催化剂和硫酸（若样品是液体时，还要加与样品等体积的蒸馏水）作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。
摇匀后，将瓶口上放一小漏斗，再把烧瓶斜置铁筐内放在通风厨内的电炉上消化。
通常消化需要1～3h（对于那些赖氨酸含量较高的样品需要更长的间）。
直到消化液由淡黄色变成清晰的淡蓝绿色，消化即告成功。
为了保证消化彻底，再继续加0.5h。
消化完毕，取出消化管冷却至室温。
加入20ml蒸馏水，无损的转入100ml溶量瓶中，用蒸溜水定容至刻度，混匀，作为试样分解液。
4. 蒸馏取3个100ml锥形瓶，分别加入2％硼酸20ml，混合指示剂2滴，溶液呈紫红色，用表面皿覆盖备用。
(1) 洗涤、加样：先煮沸蒸汽发生器，器中盛有2／3体积的用几滴硫酸酸化过的蒸馏水，样品杯中也加入2／3体积蒸馏水进行水封。
关闭夹子 (12)使蒸汽通过反应室中的插管进入反应室，再由冷凝管下端逸出。
在冷凝管下端放一空烧杯以承受凝集水滴。
这样用蒸汽洗涤5min左右，在冷凝管下口放一个准备好的盛有硼酸-指示剂的锥形瓶，位置倾斜，冷凝管下口应完全浸泡于液体内，继续用蒸汽洗涤1～2min，观察锥形瓶中的溶液是否基本上不变色，若不变色，则证明蒸馏器内部已洗涤干净。
下移锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管口约1cm，继续通蒸汽1min。
(2) 加样前先撤火，务必打开夹子 (12) (这是本实验的关键，否则样品会倒抽到反应室外，准确移取试样分解液10ml，打开样品杯的棒状玻塞，将样品放入反应室，用少量蒸溜水冲洗样品杯后也使之流入反应室，将夹子(12)夹紧。
盖上玻塞，并在样品杯中加蒸馏水进行水封。
将装有硼酸-指示剂的锥形瓶放在冷凝管口下方，打开存放碱液杯下端的夹子，放10ml 40％氢氧化钠溶液于反应室后，立即上提锥形瓶，使冷凝管下口浸没在锥形瓶的液面下，目的是保证放出的氨全部被硼酸吸收。
5. 滴定全部蒸馏完毕后，用0.0100mol／L 标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，直至硼酸-指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点。
6. 计算粗蛋白质= (V２－V1)×c×0.0140×6.25m×V′/V×100% 式中：V2——滴定试样时所需标准酸溶液体积(ml)。
V1——滴定空白时所需标准酸溶液体积(ml)。
c——盐酸标准溶液浓度(mol/L)。
m——试样质量(g)。
V——试样分解液总体积(ml)。
V′——试样分解液蒸馏用体积(ml)。
0.0140-与1.00ml盐酸标准溶液［c HCl)=1.0000mol/L］相当的、以克表示的氮的质量。
6.25——氮换算成蛋白质的平均系数影响凯氏定氮法测定粗蛋白准确性应注意的细节问题发布时间： 2009-11-24 11:00:30 被阅览数： 227 次来源：国家饲料网摘要阐述了影响凯氏定氮法测定粗蛋白准确性应注意的一些细节问题，并进行了相关分析，且提出了相应的解决办法。
关键词凯氏定氮法；粗蛋白；测定；准确性；问题随着饲料行业的飞速发展，饲料原料及其饲料产品的价格也居高不下。
而粗蛋白的检测是评定饲料原料及其产品的重要指标之一，目前常用的为凯氏定氮法，即国家颁布的《饲料中粗蛋白的测定方法》(GB1996-6432)。
但是该方法也存在着测定过成较复杂、费时等缺陷，测定时除严格按照规定程序操作外，还需要一定的实验技巧和实践经验。
因此有很多饲料企业在实际操作过程中总是出现各种问题，导致检测结果异常而不知如何去分析。
下面，笔者以GB/T6432—1994为准，针对影响凯氏定氮对测定结果标准性应注意的细节问题和大家共同探讨。
1 试剂的配制粗蛋白测定中所用的化学药品如浓硫酸、盐酸、氢氧化钠、硼酸、硫酸铜、硫酸钾(硫酸钠)、硫酸铵、蔗糖等均为化学纯，标定盐酸标准溶液用的无水碳酸钠为基准试剂。
在配制试剂前一定要用PH试纸或酸度计检测一下蒸馏水是否为中性，所用的烧杯、试剂瓶等配液设备清洗干净。
1.1 盐酸标准溶液的配制配制的盐酸标准溶液尽量为低浓度，一般C(HCl)=0.02～0.05mol·L-1。
低浓度虽然用量大，但可减少操作误差和读数误差。
配制盐酸标准溶液一定要严格按照标准操作进行，基准无水碳酸钠已定于270～300℃灼烧至恒重，称准至0.0001g，做4～6个平行样，去掉最高值和最低值后取平均值，同时还要做空白试验。
盐酸标准溶液的配制量尽量不要太多、使用时间太长，防止水分蒸发和盐酸挥发而影响其浓度的准确性。
1.2 其他试剂的配制400g·L-1氢氧化钠溶液、20g·L-1硼酸溶液、混合指示剂(1g·L-1甲基红乙醇溶液与5g·L-1溴甲酚绿乙醇溶液等体积混合)等主要是在称量时要做到快、准、稳，再就是防止使用时间太长，特别是混合指示剂不要超过3个月。
2 试样的选取和制备2.1 采样饲料原料及产品的容积和质量往往很大，因此所采集的样品必须具有代表性，否则，即使一系列的分析工作非常精密、准确，其意义都不大，有时甚至会得出错误的结论，所以应采用正确的采样方法。
采样应从具不同代表性的区域取几个样点，然后充分混合为整个饲料的代表样品，然后再从中分出一小部分作为分析样品。
在采样过程中应做到随即、客观，避免受人为和主观因素的影响。
还有一点应该注意，就是所采集的样品必须具有一定数量。
其采集数量的多少应视饲料原料和产品水分含量、颗粒大小、均匀程度以及平行样的数量而酌情定夺。
2.2 分样所采集的样品往往较多，而检测时所用试样往往较少，因此要对所采集的样品进行缩分。
在多数饲料公司以及检测机构中一般采用方便简单的四分法。
有条件的单位可采用分样器进行分样。
2.3 粉样饲料的样品一般为颗粒状，所以要对所分得的试样进行粉碎。
粉碎所用的设备一般为咖啡磨或植物样本粉碎机，试样粉碎后一般过40目筛，且一定要把粉碎后的试样及粉碎机中残留的部分清扫后充分混合均匀，避免粉碎的试样分级而影响分析结果的准确性。
对于一些不易粉碎的粗饲料如秸秆渣等在粉碎机中会剩留极少难以通过筛孔，这部分一定不要丢掉，应尽力弄碎后一并均匀混入样品中，避免引起分析误差。
2.4 称样试样的用量标准中规定为0.5～1g，为保证分析结果的准确性，在分析过程中应根据试样蛋白质含量的高低来决定所称试样的重量，如浓缩料、鱼粉、玉米蛋白粉、豆粕等高蛋白的试样可控制在0.5～1g之间，玉米、秸秆、苜蓿等低蛋白、粗饲料试样可适当增加到2～3g左右，以增加测定结果的准确性。
还应注意一点，在称量时尽量用电子分析天平，准确到0.0001g且无损地放入凯氏烧瓶或者消化管中。
3 消化3.1 催化剂及其用量在环境污染小、价格便宜、催化效果好的前提下，目前催化剂多为硫酸铜和无水硫酸钾(或无水硫酸钠)。
其添加量不同公司差异较大，其中硫酸铜:无水硫酸钾(或无水硫酸钠)主要有1:9、1:10、1:15和1:17等，国标为0.4g硫酸铜和6g无水硫酸钾(或无水硫酸钠)，比例为1:12。
若添加量加大，消化液易结块不易转移；添加量减少，消化时间加长或者消化不完全。
建议大家按国标执行为好。
亦可根据自己的经验以及试样的多少、消化的难易程度、蛋白含量的多少自行调整。
3.2 硫酸的用量浓硫酸的用量应视试样的重量、含水量及其所含蛋白高低而适当调整。
对于体积大重量轻的粗饲料、高蛋白饲料或者含水量较高的试样、淀粉含量多的精料,应适当加大浓硫酸的用量，多为15ml左右。
这是由于此类样品，浓硫酸在对其脱水和碳化是消耗量加大，当加入的浓硫酸量不足或者刚刚够试样脱水和碳化时就会出现烧干现象。
反之则需加入10ml左右。
若通风柜的排风量较大时应适当多加浓硫酸2ml左右，以防止浓硫酸的蒸发而是其浓度降低，试样消化不完全从而导致所测得的数值偏低。
3.3 消化温度刚开始时以低温(200～300℃)加热，待试样焦化泡沫消失后，逐步缓慢提高温度(360～410℃)。
起初低温加热是为防止试样起泡沫，而溢出烧瓶外或碳化后的颗粒粘附于烧瓶壁，导致消化不完全，所测结果偏低。
对于富含脂肪或者在消化过程中易发泡的样品，可在消化前滴加少量消泡剂，如辛醇、液体石蜡等。
3.4 消化时间消化时间也是许多文献一直在探讨的问题，也有许多快速消化法的研究。
其消化时间的标准为消化呈透明蓝绿色后，在加热消化15min。
根据苏军等研究表明，消化液澄清后再继续消化30min为宜。
此试验只是针对于蛋白含量低于蚕蛹的样品，而对于蛋白含量高于蚕蛹的样品，如进口鱼粉、血粉、羽毛粉等并未进行试验性研究。
因此我个人认为，可根据试样的重量、蛋白含量的多少以及消化的难易程度而适当调整消化液澄清后的消化时间。
对于所称试样质量较多、蛋白含量高于蚕蛹或者难消化的试样，消化液澄清后继续消化的时间可控制在45min～2h不等，具体时间化验工作者可根据自己的工作经验而自行定夺。
3.5 消化液的转移及定容消化结束后，把凯氏烧瓶从电炉上取下，放在小铁筐内冷却。