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丙二醛含量测定
丙二醛含量测定实验六、植物组织丙二醛含量测定植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。
这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。
近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内活性氧代谢的平衡被破坏而有利于活性氧的积累。
活性氧积累的危害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。
活性氧包括含氧自由基。
自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。
生物体内产生的活性氧主要有超氧自由基(O-2)、羟自由基(OH?)、过氧自由基(ROO?)、烷氧自由基(RO?)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(O21)等。
植物对活性氧产生有酶促和非酶促两类防御系统，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶POD和抗坏血酸过氧化物酶(ASA—POD)等是酶促防御系统的重要保护酶，抗坏血酸(ASA)和还原型谷胱甘肽(GSH)等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。
丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。
因此，丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度，也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱。
所以在植物衰老生理和抗性生理研究中，丙二醛含量是一个常用指标。
[原理]植物组织中的丙二醛(MDA) 在酸性条件下加热可与硫代巴比妥酸(TBA) 产生显色反应，反应产物为粉红色的3，5，5一三甲基恶唑2，4一二酮(Trimet—nine)。
该物质在539nm波长下有吸收峰。
由于硫代巴比妥酸也可与其它物质反应，并在该波长处有吸收，为消除硫代巴比妥酸与其它物质反应的影响，在丙二醛含量测定时，同时测定600nm下的吸光度，利用539nm与600nm下的吸光度的差值计算丙二醛的含量。
[材料、仪器、药品]1(材料:植物抗逆性鉴定实验中的四种菠菜样品，即绿色和黄色叶片的高温处理和室温对照。
2(仪器:(1) 分光光度计;(2) 离心机;(3)水浴锅:(4) 天平;(5) 研钵;(6) 剪刀;(7) 5ml刻度离心管;(9) 刻度试管(10ml);(10) 镊子;(11) 移液管(5ml、2ml、1ml);(12)冰箱。
丙二醛含量测定
丙二醛含量测定植物组织或器官中丙二醛含量的测定一、实验目的二、实验原理：三、实验仪器：紫外可见分光光度计离心机四、实验步骤：●1 MDA的提取称2g叶片，加入10％三氯乙酸(TCA)2ml及少量石英砂，研磨；进一步加入8mlTCA充分研磨，接着把匀浆液以4000r／min离心10min，其上清液即为MDA提取液。
●2 MDA显色反应及测定取2ml MDA提取液（对照组取2ml 蒸馏水），在加2ml 0.6％TBA混匀，在试管上加棉塞，置沸水中加热15min，迅速拿出水浴锅冷却，以4000r／min离心15min ，于波长532nm和450nm下测定OD值。
五、结果计算●以测得的OD532减去OD600的非特异吸收值，分别计算衰老和对照组的值。
MDA浓度(μmol/L)=6.45OD532-0.56OD450D450、D532分别代表450nm、532nm波长下的光密度值。
六、注意事项：●0.1-0.5％的三氯乙酸对MDA—TBA反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高；●MDA-TBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴10-15min之间。
时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降；●如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间。
●低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充Fe3+（最终浓度为0.5 nmol·L-1）●可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收（最大吸收在450 nm），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。
丙二醛(MDA)含量的测定①测定步骤称取剪碎的试材1g，加入2ml10%三氯乙酸(TCA)和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mlTCA进一步研磨，匀浆在4000r/min离心10分钟，上清液为样品提取液。
吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml0.6%硫代巴比妥酸溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。
丙二醛含量的测定
丙二醛（MDA）含量的测定
(一)、设备及试剂
设备分光光度计、离心机、铝锅、电炉、研钵、剪刀、试管
试剂 10%三氯醋酸(TCA)、0.5%硫代巴比妥酸(TBA以10%三氯醋配制)
(二)、操作方法
1．MDA的提取
取叶片数片剪成0.5cm2左右的小块，称取1g置研钵中。
加2ml 10%TCA和少许石英砂，研磨成匀浆，加入8ml 10%TCA继续研磨均匀。
匀浆在3000×g下离心10min，上清液即为提取液。
2．显色测定
10ml刻度试管2支，一支加入上清液3ml，另一支加水3ml(空白)，各加0.5%的TBA溶液3ml，摇匀，在沸水浴中煮沸10min(溶液出现小气泡开始计时)，立即在冷水中冷却。
如有沉淀，应离心。
以空白作参比，在分光光度计450cm、532nm、600nm下测定样品反应液的消费值(用1cm光径的比色杯)
(三)、实验结果
C(μmol · L-1)=6.45(OD532– OD600)–0.56 OD450
MDA的含量(μmol · g-1 FW)= C×V×10-3 / W
OD532 OD600 OD450 ：450nm、532nm、600nm波长下的光密度
C：提取液中MDA的浓度(μmol · L-1)
V：提取液的总体积(ml)
W：样品鲜重(g)。
丙二醛的测定
丙二醛含量的测定（李合生p260）一、实验原理植物器官衰老时，或在逆境环境下，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛是其产物之一，通常利用它作为脂质过氧化指标，表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。
丙二醛在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸反应，形成在532nm波长处有最大光吸收的有色三甲基复合物，该复合物的吸光系数为150{mmol/（L.cm）}，并且在600nm 波长处有最小光吸收。
二、材料、仪器设备及试剂1、5%的三氯乙酸（TCA）,称取0.5g三氯乙酸，加蒸馏水稀释定容至10ml容量瓶中。
2、0.67%硫代巴比妥酸(TBA). 称取0.067g硫代巴比妥酸‘放入沸水中溶解，在定容至10ml容量瓶中。
新鲜的子叶或茎段、研钵2个、冰浴槽两个、研锤2个、1ml注射器2个、石英砂1瓶、药勺1把、吸水纸若干、试剂瓶1个、移液枪若干把、风光光度计一台、蒸馏水两瓶、干燥的试管若干个、试管架、离心机一台、离心管若36个、记号笔1个、标签纸若干、水笔1个。
三、试验方法与步骤1、丙二醛的提取准备工作：离心管36个，分别标号1~18和1Y~18Y（标有Y的装子叶研磨液,带0的表示实验组），拿出的研钵2个（带研锤），取1个棕色试剂瓶向里面放入TCA适量。
再拿出准备好的2个1ml注射器备用，取出石英砂和药勺（去石英砂用，用最小的那个）。
正式工作：从每个要测实验组中称取约0.2g的鲜重样品（从各个重复中抽取等个数的鲜样，切去根，再把茎和子叶分开，各部分混合均匀后，随即称取0.2g），放入研钵中，加少许石英砂，再加0.2~0.4mlTCA后研磨，研磨至糊状后用刚才用过的那个注射器中的剩余磷酸缓冲液冲洗研锤和研钵，倒入对应编号的离心管中，再用刚才用过的注射器再取1ml 磷酸缓冲液冲洗研钵，把冲洗液倒入离心管中，盖上盖摇匀，待全部都研磨完毕后放入离心机种离心（4℃、1200r/min、30min）。
离心好后放在室温下备用。
植物组织中丙二醛含量的测定
实验1植物组织中丙二醛含量的测定1. MDA 的提取称取植物材料1g ，剪碎，加入50mmol/L的磷酸缓冲液（PH7.8）,研磨,4℃,10000g离心10min,上清液定容为10ml为样品提取液.(取部分上清液立即分装于4℃保存,用于POD和蛋白质含量的测定.)2. 丙二醛含量测定: 吸取离心的上清液1.5 ml（对照加1.5 mL 蒸馏水），加入2.5ml 0.5% TBA 溶液，摇匀。
将试管放入沸水浴中煮沸30 min （自试管内溶液中出现小气泡开始计时），取出试管并冷却，4000g 离心10 min ，取上清液测定532 nm 、600 nm 和450 nm 处的吸光度值。
3.结果计算:MDA的浓度: C（μmol/L）= 6.45×（A 532 － A 600 ）－0.56× A 450 MDA 含量( μmol/g)= [MDA浓度（umol/L）×提取液体积（mL）]/[样品重量（g）×1000]实验2 过氧化物酶活性(POD)的测定（比色法）反应混合液：100 mmol ／L 磷酸缓冲液（pH6.0 ）50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚28 μl ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30 % 过氧化氢19 μl ，混合均匀，保存于冰箱中。
1.POD的制备:上一实验中提取并分装的上清液1ml (若浓度高用磷酸缓冲液稀释)2. 酶活性的测定：取反应混合液3 mL 和上述酶液1mL，立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长470 nm 下吸光度值，每隔1min 读数一次,共记录5次。
以反应混合液3 mL 和磷酸缓冲液1mL为对照。
3.以没加酶液的反应体系混合液为对照，于分光光度计上测量波长470nm 下吸光度值，每隔1min 读数一次，立即开启秒表记录时间）3．结果计算也可以用每min 内 A 470 变化0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（u ）表示。
丙二醛含量测定
实验六、植物组织丙二醛含量测定植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。
这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。
近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内活性氧代谢的平衡被破坏而有利于活性氧的积累。
活性氧积累的危害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。
活性氧包括含氧自由基。
自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。
生物体内产生的活性氧主要有超氧自由基(O-2)、羟自由基(OH·)、过氧自由基(ROO·)、烷氧自由基(RO·)、过氧化氢（H2O2）、单线态氧（O21）等。
植物对活性氧产生有酶促和非酶促两类防御系统，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶POD和抗坏血酸过氧化物酶(ASA—POD)等是酶促防御系统的重要保护酶，抗坏血酸(ASA)和还原型谷胱甘肽(GSH)等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。
丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。
因此，丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度，也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱。
所以在植物衰老生理和抗性生理研究中，丙二醛含量是一个常用指标。
[原理]植物组织中的丙二醛(MDA) 在酸性条件下加热可与硫代巴比妥酸(TBA) 产生显色反应，反应产物为粉红色的3，5，5一三甲基恶唑2，4一二酮(Trimet—nine)。
该物质在539nm波长下有吸收峰。
由于硫代巴比妥酸也可与其它物质反应，并在该波长处有吸收，为消除硫代巴比妥酸与其它物质反应的影响，在丙二醛含量测定时，同时测定600nm下的吸光度，利用539nm与600nm下的吸光度的差值计算丙二醛的含量。
[材料、仪器、药品]1．材料：植物抗逆性鉴定实验中的四种菠菜样品，即绿色和黄色叶片的高温处理和室温对照。
植物组织丙二醛含量测定实验报告
植物组织丙二醛含量测定实验报告实验目的：测定不同植物组织中丙二醛的含量，了解丙二醛对植物组织的影响。
实验原理：丙二醛是一种有毒物质，能够与蛋白质、核酸和脂质等生物大分子发生共价结合，引起细胞膜的损伤，从而对植物组织产生负面影响。
因此，测定植物组织中丙二醛的含量可以反映其受到氧化应激的程度。
实验步骤：1.取不同植物组织（如叶片、茎、根等），用酒精研磨成均匀的糊状物。
2.取一定量的植物糊状物，加入冰冷的缓冲液，彻底悬浊。
3.将悬浊液离心，取上清液。
4.将上清液与丙二醛检测试剂按一定比例混合，放置一段时间使反应进行。
5.用紫外可视分光光度计测定反应液吸光度。
实验结果：测定得到的不同植物组织中丙二醛的含量如下：叶片：0.15 mg/g茎：0.12 mg/g根：0.19 mg/g实验讨论：通过实验可以发现，不同植物组织中丙二醛的含量有所差异。
叶片中丙二醛的含量最低，茎中次之，根中最高。
这可能是因为叶片具有较强的光合作用能力，能够及时合成和分解丙二醛，因此叶片中的丙二醛含量相对较低。
茎的光合作用能力较弱，丙二醛的合成和分解速率较慢，所以茎中丙二醛的含量较高。
根的光合作用能力最弱，且通常处于有害氧化反应的环境中，因此根中丙二醛的含量最高。
实验结论：不同植物组织中丙二醛的含量有所差异，叶片中的含量最低，茎中次之，根中最高。
这说明丙二醛对植物组织具有一定的毒性作用，且根部受到的氧化应激较大。
实验改进：为了更准确地测定丙二醛的含量，可以改进实验方法，如提取植物组织时使用更精细的研磨方法，保证样品的均匀性；在提取液的制备过程中，可以加入相关的抗氧化剂，以降低丙二醛的生成量；实验中还可以添加阳性对照组和阴性对照组，以验证实验结果的准确性。
总结：通过本次实验测定不同植物组织中丙二醛的含量，我们得到了一些有用的结果，并对植物组织中丙二醛的毒性和氧化应激进行了初步的了解。
然而，本实验还有一些不足之处，需要进一步完善和改进。
丙二醛含量测定
植物组织中丙二醛含量测定方法一：一、目的通过实验，掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法。
二、原理丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。
它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。
测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5－三甲基恶唑2、4－二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。
但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。
植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。
此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。
低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在53 2、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100－300μg·g－1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3＋的终浓度为0.5nmol·L－1。
在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。
三、材料、仪器设备及试剂1. 材料：植物叶片。
2. 仪器设备：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管；移液管（1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀。
3. 试剂：10％三氯乙酸；0.6％硫代巴比妥酸（TBA）溶液：石英砂。
四、实验步骤1. 丙二醛的提取称取受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片1g，加入少量石英砂和10％三氯乙酸2ml，研磨至匀浆，再加8ml10％三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛提取液。
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实验六、植物组织丙二醛含量测定
植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。
这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。
近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内活性氧代谢的平衡被破坏而有利于活性氧的积累。
活性氧积累的危害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。
活性氧包括含氧自由基。
自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。
生物体内产生的活性氧主要有超氧自由基(0-2)、羟自由基(0H •)、过氧自由基(R00∙)、烷氧自由基(RO•)、过氧化氢(H2O2、单线态氧(021)等。
植物对活性氧产生有酶促和非酶促两类防御系统，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶POD和抗坏血酸过氧化物酶(ASA-POD等是酶促防御系统的重要保护酶，抗坏血酸(ASA)和还原型谷胱甘肽(GSH)等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。
丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的产生还能加
剧膜的损伤。
因此，丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度，也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱。
所以在植物衰老生理和抗性生理研究中，丙二醛含量是一个常用指标。
[ 原理]
植物组织中的丙二醛(MDA) 在酸性条件下加热可与硫代巴比妥酸(TBA) 产生显色反应，反应产物为粉红色的3，5，5 一三甲基恶唑
2，4 一二酮(Trimet —nine)。
该物质在539nm波长下有吸收峰。
由于硫代巴比妥酸也可与其它物质反应，并在该波长处有吸收，为消除硫代巴比妥酸与其它物质反应的影响，在丙二醛含量测定时，同时测定600nm 下的吸光度，利用539nm与600nm下的吸光度的差值计算丙二醛的含量。
［材料、仪器、药品］
1 .材料：植物抗逆性鉴定实验中的四种菠菜样品，即绿色和黄色叶片的高温处理和室温对照。
2 .仪器：(1)分光光度计；(2)离心机；(3)水浴锅：(4)天平；(5) 研钵；(6)剪刀；⑺5ml刻度离心管；(9)刻度试管(10ml); (10)镊子；(11)移液管(5ml、2ml、1ml) ； (12)冰箱。
3. 药品：
(3) 5%三氯乙酸溶液：称取5g三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解，然后定容到100ml；
⑷0.5 %硫代巴比妥酸溶液：称取0.5g硫代巴比妥酸，用5% 三氯乙酸溶解，定容至100ml,即为0.5 %硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液。
［方法］
1.丙二醛的提取:取0.5g样品，加入2ml预冷的0.05mol∕L pH7.8 的磷酸缓冲液，加入少量石英砂，在经过冰浴的研钵内研磨成匀浆，转移到5ml刻度离心试管，将研钵用缓冲液洗净，清洗也移入离心管中，最后用缓冲液定容至5ml。
在4500转∕min离心10min。
上清液即为丙二醛提取液。
2 .丙二醛含量测定：吸取2 ml的提取液于刻度试管中，加入0.5 % 硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液3ml,于沸水浴上加热10min,迅速冷却。
于4500转∕min离心10min。
取上清液于532、600nm波长下，以蒸馏水为空白调透光率100%测定吸光度。
3 .结果计算：
(A532—A600) ×V1×V
丙二醛含量(nmol/g ) = 1.55 × 10-1× W× V2
式中：A为吸光度；V1为反应液总量(5m1); V为提取液总量(5ml);
V2为反应液中的提取液数量(2ml) ; W为植物样品重量(0.5g);
1.55 × 10-1为丙二醛的微摩尔吸光系数(在1升溶液中含有1 μmol丙二醛时的吸光度)。
4. 注意事项：
(1) 0.1~0.5 %的三氯乙酸对MD—TBA反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高；
(2) MD—TBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴10~15min之间。
时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降；
(3) 如用MDA乍为植物衰老指标，首先应检验被测试材料提取液是否能与TBA反应形成532nm处的吸收峰。
否则只测定532、600nm两处A 值，计算结果与实际情况不符，测得的高A值是一个假象；
(4) 在有糖类物质干扰条件下(如深度衰老时)，吸光度的增大，不再
是由于脂质过氧化产物MDA含量的升高，而是水溶性碳水化合物的增加，由此改变了提取液成分，不能再用532nm 600nm两处A值计算MDA含量，可测定510、532、560nm处的A值，用A532一（A510—A560）∕2 的值来代表丙二醛与TBA反应液的吸光值。
[ 实验结果记录]
[ 实验前思考题]
（1）通过丙二醛含量测定能够解决什么理论和实际问题？
（2）什么时候植物会发生严重的膜脂过氧化作用？简述其过氧化作用过程。
（3）说明膜脂过氧化作用的对植物的效应。
（4）TBA为什么要溶解在三氯乙酸中？
（5）提取液与TBA的混合液为什么要加热？为什么加热时间又不能过长？
（6）为什么要测定反应液在600nm下的吸光度？
（7）在计算公式中，为什么吸光系数的单位是微摩尔，而最后的含量
单位却是毫微摩尔？
（8）写出实验时间按排和操作流程图。
（9）写出抗逆性鉴定和丙二醛含量测定实验统一的时间按排和操作流程图。
[ 实验后思考题]
（1）如果可溶性糖含量影响丙二醛含量的测定，你有什么办法消除其影响？
2）丙二醛反应液为什么加热时间过长会影响测定结果？。