环保组织固定液(浓缩型)
免疫组化组织细胞的取材、固定、切片操作方法及要点
免疫组化组织细胞的取材、固定、切⽚操作⽅法及要点从⼤体标本上切除适量的组织材料进⾏研究就是取材。
取材不仅在免疫组化⽽且在常规病理检查中也⼗分重要。
⽤于免疫组化的组织⼀般取材⼤⼩为1．OcmXl．OcmX0．2cra。
取材时应剔除脂肪和钙化，否则会影响切⽚，出现假阳性或假阴性结果。
组织标本包括动物标本、⼿术活检标本、⼫体解剖标本及细胞标本等，有关各种标本的取材⽅法分述如下。
⼀、动物的致死法及取材(⼀)致死法(1)空⽓栓塞法向动物静脉内注⼊⼀定量的空⽓，使动物很快死亡。
⼀般适⽤⼤动物，例如兔、⽝、猫等动物。
(2)⿇醉法可将浸有⼄醚或氯仿(三氯甲烷)的棉球连同动物⼀起放⼈密闭容器内进⾏⿇醉，也可⽤4％戊巴⽐妥作静脉注射，或⽤20％氨基甲酸⼄酯做腹腔注射。
适⽤于⿏等⼩动物。
(3)断头法⽤剪⼑剪去动物的头部，待⾎液流出后⽴即取材。
适⽤于⼩动物。
(4)去头法⽤重物猛击头后部或将动物头后部猛撞桌沿。
(5)股动脉放⾎法动物⿇醉后，切开股动脉放⾎致死。
(⼆)取材注意事项(1)最好在动物⼼脏还在跳动时⽴即取材，并迅速投⼊环保组织固定液内。
脏器的上⽪组织易变质，争取在死后半⼩时内取材完毕，否则免疫组化染⾊时会产⽣背景染⾊。
(2)切取组织使⽤的⼑、剪要求锋利，避免来回挫动组织。
因动物组织质脆，因此夹取组织时切勿⽤⼒过重，以免挤压损伤组织。
⼆、⼫体解剖的取材⼫体解剖的取材应根据实际需要进⾏，⼀般取材部位和数量如下。
(1)⼼和⼤⾎管右⼼室⼀块，左⼼室⼀块，主动脉⼀块，取材部位可在距主动脉瓣5cm处。
(2)肺右下叶⼀块，切成正⽅形；左下叶⼀块，可切成长⽅形。
(3)肝右叶⼀块，切成正⽅形；左叶⼀块，切成长⽅形。
(3)脾⼀块。
(4)胰⼀块。
(6)肾两肾各⼀块，包括⽪质、髓质和肾盂。
右肾⼀块切成正⽅形，左肾⼀块切成长(7)膀胱⼀块。
(8)肾上腺左、右各取⼀块。
(9)消化道⾷管⼀块，胃窦部⼀块，⼩肠⼀块，淋巴结⼀块，直肠⼀块。
(10)⾻脊椎⾻⼀块。
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。
如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
就拿温度来说，可以有4 度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
2、免疫组化最大的优势是定位和定性。
相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。
尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。
免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。
前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。
如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。
当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。
我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。
各种组织冰冻切片、取材,染色等具体操作方法(连载一 脑、肠、眼球)
各种组织冰冻切片、取材，染色等具体操作方法(连载一脑、肠、眼球）1.做脑组织的冰冻切片在前期的处理过程中很重要，因为脑组织非常软。
不但要做前固定，最好是做全身灌注固定后，如果不做全身灌注固定，很难取出一个完整的大脑组织。
再段头取脑置4度4％多聚甲醛（或西奈山环保组织固定液）中后固定24小时，然后依次置入剃度PB蔗糖溶液脱水，剃度可以设为15%，20%，30%分别过夜沉底即可。
设剃度脱水是为了避免组织块冰晶的产生。
冰晶在组织片上表现为圆形或椭圆行的空洞，影响实验结果。
在做切片时可以做简单的HE染色即可分辨出是否有冰晶。
防止冰晶的另一实验注意点是在做切片前的包埋过程，要求速冻，一般放-20度下15分钟即可，温度高如室温或者4度是达不到速洞效果的，温度太低如放在液氮罐中又导致组织块的碎裂。
而且产生冰晶。
2.如果想要作出满意的漂亮的实验结果，特别是免疫双标共聚焦，那就要求更高，实验的每一步都要很严格，不是我说法夸张，是因为做共聚焦要避免自发荧光的问题，而实验的每一步都可能产生自发荧光，比如4％多聚甲醛灌注液，PB蔗糖等都可以产生让我们头痛的自发荧光问题，根据我的实验经验，国产的多聚甲醛作实验很容易产生自发荧光，难以避免，不过据我导师讲，他在国外做共聚焦不存在这些问题，所以我个人认为你不妨先做单标试试看，能避免自发荧光，那最大的难题就解决了。
西奈山环保组织固定液可以降低自发荧光背景。
3.是否做漂片还是贴片的问题，脑组织两种方法都可以，唯独共聚焦例外，做共聚焦要求片子一般为30-50um，厚片才能达到三维重建的效果。
一般的贴片文献上提到的是20-30um用漂片，此法要求抗体用量较大，最好买国外原装的浓缩液。
不过我做的脑片切过4um的做一般的普通免疫荧光可以。
楼上的几位同仁说得不错。
就我们实验室的操作方法以及个人的体会说上几点：1.如果灌注固定较好的话，完全可以省去后固定这个步骤。
神经组织常规的固定液为4%的多聚甲醛，如果在其中再加入0.25-0.5%的戊二醛增加其固定时的交联作用，那么固定的效果就会更好些，脑或脊髓标本就会更硬些；我们一般用1000ml多聚甲醛固定至少2小时。
AAF 固定液(70%)说明书
AAF 固定液(70%)说明书
本产品仅供体外研究使用，不得用于临床诊断
产品简介： 固定的目的在于保存细胞和组织的原有形态结构，固定剂能阻止内源性溶酶体酶对自身组织 和细胞的自溶、抑制细菌和霉菌的生长，固定剂通过凝固、生成添加化合物等使蛋白质内部 结构发生改变，从而使酶失活，固定剂对细胞核细胞外成分发生物理改变，固定液主要分为 醛类固定液、汞类固定液、醇类固定液、氧化剂类固定液、苦味酸盐类固定液等，较为常用 的是醛类中的福尔马林、醇类中的乙醇。
注意事项： 1、AAF 固定液对人体有一定的损害，请在通风好的环境下小心操作，避免吸入。 2、组织取材的厚度不同，固定时间也不同，对组织恰当的选材有利于固定液的渗透；常规 活检组织比较适合的厚度为 2～4mm，一般不超过 6mm。 3、固定液的容量应足够，一般固定液与组织块的体积比率应大于 10:1；如果容积不够大， 可以在固定期间更换 1～3 次固定液。 4、温度对固定的影响很明显，提高温度可以加速固定作用，但温度不宜过高。
AAF 固定液(70%)又称 FAA/AFA 固定液(70%)，又称万能固定剂，主要由 70% 乙醇(A)、5% 乙酸(A)、5%甲醛(F)组成，可用于植物年老或较坚硬的组织的固定，不用于植物单细胞及丝 状藻类等幼嫩材料的固定，可防止材料的过度收缩，固定柔软幼嫩材料时宜用 50%乙醇代替 70%乙醇，FAA 固定剂可兼做保存剂。该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用 途。
产品组成：
产品名称 AAF 固定液(70%)
规格 500ml
保存条件 RT
说明书 1份
有效期 1年
操作步骤(仅供参考)： 1、取新鲜组织入 AAF 固定液，置于室温固定 1~12h。 2、常规石蜡切片因固定不佳导致染色效果不满意时，可在染色前再用 AAF 固定液固定 5min，染色效果会有明显提高。
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。
如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
2、免疫组化最大的优势是定位和定性。
相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。
尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。
免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。
前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。
如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。
当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。
我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。
失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。
环保组织透明液(二甲苯替代品)
二甲苯替代品——环保组织透明液华越洋----------------------------------------------------------------------- 环保组织透明液是华越洋研发的新型绿色环保试剂，它能代替二甲苯应用在细胞学和组织病理学领域的制片和染色过程中，是一种全方位取代二甲苯，对动、植物或人体局部进行观察及保存而制作显微玻片标本时所需的无毒透明剂，具有以下优点：无毒性：从根本上改善了制片的劳动条件；可以不在通风柜中操作。
天然材料：以特制多种无色的生物提取油作为主要原料，并加入吸水剂，表面活性剂，抗氧化剂等经催化加氢而得。
全替代：可溶解石蜡和中性树胶与乙醇互溶，其化学极性与二甲苯完全一致。
作用柔和：不易引起制片材料收缩变形、硬化脆化，可提高切片的完好率。
应用范围广：适用于植物、动物和人体等方面的显微制片；在石蜡切片法中，除可透明材料外，还可作为溶解石蜡和封固树胶的溶剂。
特别适用于脱水机。
不仅能用于常规染色法，也适用于特殊染色法和组织化学技术。
1 为什么要开发二甲苯的替代剂？二甲苯是一种极为广泛地应用在病理制片和染色中的传统苯环芳香烃溶剂，世界卫生组织已宣告其对中枢神经系统的毒性。
试验和临床研究都表明吸入二甲苯蒸汽导致中枢神经系统(CNS)抑郁症状，如头痛、头晕、恶心和呕吐,二甲苯经微核试验呈阳性反应，对人体还有致癌作用。
二甲苯是伤害医生的元凶，让整个病理科充满刺激味的元凶。
2 华越洋环保组织透明液应用在组织制片和染色时，操作步骤必须要修改吗？可以不修改传统的等级酒精脱水和二甲苯透明程序，用华越洋组织透明液直接替代二甲苯组织透明后浸蜡。
但是，为了充分地发挥新型试剂的优越性，脱水和透明步骤可以简化减少等级酒精脱水步骤。
3 华越洋环保组织透明液的脱水透明效果如何？处理后的组织形态学比较标准一致，不会影响后续的组化特染、免疫组织化学染色和分子病理学的分析要求。
4 实验室如何处置使用过的华越洋组织透明液？尽管华越洋组织透明液并无毒性，但实验室处置还应按照化学试剂和相关有机废物类的规则要求进行处理，因为使用过的试剂中会含有人体组织的脂肪和其它的代谢产物等。
冰冻切片详细说明
冰冻切片详细说明切片技术最早期是从冰冻切片开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切片弥补了石蜡切片和火棉胶切片之不足，石蜡切片和火棉胶切片需时太久，且在制片中要使用许多化学试剂，石蜡切片还需要加温过程，因而某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。
冰冻切片过程较简单，无须经过上述步骤，组织中的水分起着包埋剂的作用，组织经固定或不固定即可进行冰冻切片，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染色方法和组织化学方法，特别是酶的活性十分理想的切片方法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切片也很重要。
一、直接冰冻切片法冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。
组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。
1．恒冷箱切片就是将组织在恒冷箱的切片机切片。
目前恒冷箱切片机的品种较多。
此种切片适用于科研和教学上的连续切片。
要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。
2．甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装制，其冷却速度比较快，属于开放式，作一般常规冰冻切片用。
3．二氧化碳冰冻法将组织用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。
打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，将二氧化碳关闭，即可切片。
若组织冷冻过硬则切片易碎；组织冷冻硬度不足，则切片呈粥糜状，需用间歇方法继续冷却。
硬度一般在刚开始解冻时最合适，应迅速切片。
4．半导体致冷冰冻切片法将组织置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏水，调好切片机的厚度。
⑶移至25%明胶溶液内浸6-24h。
⑷25%明胶包埋，连同包埋器放入冰箱内使明胶迅速凝固，取出后在空气中蒸发10min 。
⑹蒸馏水洗后，置冰冻切片机或滑动式切片机切片。
切片可保存于10%甲醛液中。
⑺依检查目的而进行染色，染色后一般不经乙醇脱水及二甲苯透明，而用下述明胶溶液或其他类似的明胶溶液封片：果糖26g,明胶1.1g，钾矾0.75g，麝香草酚水溶液1.15ml。
环保封片胶使用说明
环保封片胶
（无毒，无二甲苯）
华越洋的环保封片胶是取代二甲苯，直接封片的理想选择。
科室类别：
实验/化验/病理科
环保封片胶说明：
环保型产品，取代二甲苯，彻底清除封片过程中对操作人员带来的危害。
可与各种常用透明剂配合使用，直接封片(湿封)。
干燥固化迅速，固化后的折光率优于其他封片胶。
病理切片可长期保存，染色不褪色。
储存条件：
贮存常温，阴凉
华越洋其他环保即用型试剂/耗材：
无毒环保组织固定液——即用型，浓缩型外源RNA酶清除剂
中性环保速干胶
无毒环保透明剂
环保快速抗酸染液。
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环保组织固定液(浓缩型)
简介：
固定的目的在于保存细胞和组织的原有形态结构，固定剂能阻止内源性溶酶体酶对自身组织和细胞的自溶、抑制细菌和霉菌的生长。
固定液分为醛类固定液、汞类固定液、醇类固定液、氧化剂类固定液、苦味酸盐类固定液等，较为常用的是醛类中的福尔马林、醇类中的乙醇。
Leagene 环保组织固定液(浓缩型)主要环保型组织固定液以植物多糖和聚乙烯醇为主要原料配制，不含甲醛等有害物质，属于无毒环保型固定液，加入3体积95%的乙醇后使用。
对于常规石蜡切片固定后形态结构清晰、背景对比度高。
在免疫组化、分子病理技术等领域，效果优于甲醛类固定液，多数抗体无需抗原修复处理，可减少因固定产生的假阳性现象。
固定标本的组织形态学与甲醛固定相同，组织细胞结构清晰，无空泡化和核固缩等缺陷。
Leagene 环保组织固定液的优点是为无色、无刺激性和无毒性挥发成分，不含甲醛。
该固定液可全面替代甲醛成为病理组织细胞实验室的常规组织细胞固定液，最大限度地减少了对病理科和外科等相关人员的健康危害和环境污染，主要用于病理组织学常规制片染色、传统组织细胞化学染色、免疫组织细胞化学和原位分子杂交等其它分子病理学新技术。
该固定液适合于绝大多数组织和细胞的固定，是免疫组织化学和培养细胞固定中最常用的固定液之一，它能较好的保护组织和细胞的形态结构以及核酸。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 按实验具体要求操作，一般应加入3体积95%的乙醇后使用。
2、 一般标本固定时间控制在1～4h/mm 。
3、 大标本应适当延长固定时间。
4、 固定好的组织，可在福尔马林固定液(10%)或70%乙醇中长期保存。
注意事项：
1、 一经开启，储存过久固定效果易下降。
2、 避免过度延长固定时间，否则引起生物大分子过度交联。
取材厚度不同，固定时间也不同。
3、 固定液的容量应足够，一般固定液与组织块的体积比率应大于10:1。
编号 名称 DF0106 DF0106 Storage 环保组织固定液(即用型) 500ml 5L RT 使用说明书 1份
4、温度对固定的影响很明显，提高温度可以加速固定作用，但温度不宜过高。
5、取出新鲜组织后，应及时固定，无法及时固定时，应保存于生理盐水中及时送检。