免疫共沉淀——研究蛋白质间相互作用的技术
细胞膜蛋白co-ip
百泰派克生物科技
细胞膜蛋白co-ip
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。
其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。
Co-IP是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法，细胞膜蛋白Co-IP可用于验证细胞膜蛋白之间或者膜蛋白与其他蛋白的相互作用。
在膜蛋白Co-IP实验过程中，首先需要根据细胞膜提取原理从细胞裂解液中提取细胞膜，细胞膜提取的原理为：将细胞暴露于阳离子硅胶珠（直径20-50nm），带正电荷的硅胶珠包被并粘附在细胞表面，然后被包被的细胞由带负电荷的聚丙烯酸（PAA）过度包被。
硅胶珠包被的细胞膜比其他细胞器密度要大，可以通过梯度离心被分离。
从细胞膜中提取膜受体蛋白：在2%SDS溶液中煮沸硅胶包被的细胞膜5min以溶解膜蛋白，分离提取溶解的细胞膜蛋白。
分离纯化并富集足够多的样品，之后可采用Co-IP实验来进行细胞膜蛋白之间或者膜蛋白与其他蛋白的相互作用。
百泰派克生物科技针对样品蛋白的提取、表达和纯化的优化方案可确保获得高质量的诱饵和猎物蛋白，为客户提供优质的Co-IP蛋白互作分析服务。
您只需要将您的需求和样品寄给我们，我们会负责项目后续所有事宜，包括样品前处理、蛋白互作实验、质谱分析、质谱原始数据分析。
免疫共沉淀串联蛋白质谱coip-ms
免疫共沉淀串联蛋白质谱（CoIP-MS）是一种用于研究蛋白质相互作用的重要技术。
它通过将特定抗体与靶蛋白质结合，然后利用质谱技术鉴定和分析与该蛋白质相互作用的其他蛋白质，从而揭示细胞内复杂的信号传导网络和蛋白质功能。
在本篇文章中，我们将深入探讨CoIP-MS技术的原理、应用和局限性，以及个人对这一技术的理解和看法。
一、CoIP-MS技术原理1. CoIP原理免疫共沉淀（Co-IP）是一种将特定抗体与靶蛋白质结合的技术。
通过免疫沉淀的方式，来极大程度地富集我们需要的蛋白质。
2. 质谱技术原理质谱技术是一种通过离子化和加速来测定分子质量的技术。
在CoIP-MS中，利用质谱技术鉴定和分析与靶蛋白质相互作用的其他蛋白质。
二、CoIP-MS技术应用1. 蛋白质相互作用研究CoIP-MS技术被广泛应用于蛋白质相互作用的研究中。
通过对一种蛋白质进行免疫共沉淀，然后利用质谱技术鉴定与其相互作用的其他蛋白质，可以揭示信号传导、细胞周期、转录调控等生命活动的分子机制。
2. 蛋白质功能验证CoIP-MS技术也可以用于验证蛋白质的功能。
通过鉴定与某一特定蛋白质相互作用的其他蛋白质，可以初步推测该蛋白质在细胞内的功能和通路位置。
三、CoIP-MS技术局限性1. 验证性由于CoIP-MS技术对蛋白质相互作用的鉴定依赖于抗体的质量和特异性，因此在实际应用中需要进行多次重复实验来验证结果的可靠性。
2. 数据解析CoIP-MS生成的数据量庞大，需要借助生物信息学和统计学的方法来进行数据解析和筛选，因此在数据分析的过程中存在一定的复杂性和技术门槛。
四、个人理解和看法对于CoIP-MS技术，我个人认为它是一种非常有价值的蛋白质相互作用研究技术。
通过CoIP-MS技术，我们可以全面了解蛋白质的相互作用网络和功能，为生命科学领域的研究提供了强有力的工具。
然而，在实际操作中需要注意抗体的选择和数据的解析，以确保结果的可靠性和准确性。
总结回顾：通过本文的详细介绍，我们对免疫共沉淀串联蛋白质谱（CoIP-MS）技术有了更深入的了解。
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上寒风凛冽，又到了一年一度写标书的季节，你开始准备了么？在分子机制的研究中，蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了，研究蛋白互作的方法有很多，今天我们来介绍九种。
1、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）CoIP其实就是两个蛋白相互的IP（免疫沉淀反应）实验，在已知蛋白B和C之间有相互作用的前提下，这种前提一般需要有一个酵母双杂实验或者Pulldown实验来作为支持。
IP就是用来验证蛋白C和蛋白B之间相互作用的。
如果在Agarose珠上的Protean A/G所结合的抗体，可以结合并拉下蛋白B，那用Western Blot即可检测出蛋白C的表达，反之亦然，通过这种相互间免疫共沉淀的实验，就可以明确地验证出，B与C之间的相互作用了。
比如这份标书：PYK2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin？（百度检索题目可查到全文）2、Pull-down实验这个实验跟免疫共沉淀实验很像，不同的是免疫共沉淀是在细胞里进行的，在众多的蛋白里，拉住A蛋白的同时,把B蛋白也给拉出来了，这还不能证明是直接的结合，很有可能是A 拉住了C，而C拉住了B，这样拉住A蛋白的同时也能把B蛋白也给拉出来。
要证明直接的结合就是Pull-down实验。
提纯所要研究的两个蛋白（一般是在BL21等菌种表达提纯），这两个蛋白带上不同的标签（提纯蛋白一般带GST或者HIIS标签），然后将他们放在同一个体系里，使用GST-beads或者NI-beads,把其中一个蛋白拉下来，用WB检测另一个蛋白的存在。
比如这份标书：恶性肿瘤的发生、发展的细胞表观遗传学机制。
（同样可以百度检索到全文）3、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）——共定位将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。
由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。
免疫共沉淀（CoIP）概述,原理,优势,局限性及操作流程
免疫共沉淀（CoIP）概述,原理,优势,局限性及操作流程免疫共沉淀（CoIP）概述及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋⽩-蛋⽩间相互作⽤的经典⽅法，属于免疫沉淀技术的⼀类，常被⽤于鉴定特定蛋⽩复合物的中未知蛋⽩组分。
免疫共沉淀的设计理念是，假设⼀种已知蛋⽩是某个⼤的蛋⽩复合物的组成成员，那么利⽤这种蛋⽩的特异性抗体，就可能将整个蛋⽩复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进⽽可以⽤于鉴定这个蛋⽩复合物中的其他未知成员。
免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第⼀是天然状态，第⼆是蛋⽩复合物。
免疫共沉淀的优势：与其他研究蛋⽩质相互作⽤技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相⽐，免疫共沉淀鉴定的相互作⽤蛋⽩是在细胞内与⽬的蛋⽩发⽣的天然结合，避免了⼈为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋⽩可信度更⾼。
免疫共沉淀的局限性和注意事项：1. 免疫共沉淀是建⽴在蛋⽩复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋⽩组分很可能检测不到；2. 由于蛋⽩质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使⽤某⼀种pull-down抗体，⽆论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到⼀半的⽬标蛋⽩复合物沉淀出来，如有必要最好使⽤多种不同抗体分别进⾏CoIP；3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋⽩复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋⽩复合物成员也会越来越庞⼤；4. 如果使⽤Western Blot的⽅法检测的蛋⽩复合物中的⽬标蛋⽩，则需要在试验前进⾏预测，具有⼀定的冒险性；当然如果将蛋⽩复合物直接进⾏质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较⾼纯度和浓度的蛋⽩复合物样品也⾮易事，并且成本较⾼；5. CoIP鉴定得到的蛋⽩间相互作⽤可能是直接作⽤也可能是间接作⽤，进⼀步区分还需要进⾏GST-Pull down等实验检测；6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使⽤复合物的不同成员分别独⽴进⾏CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使⽤复合物的任⼀成员进⾏CoIP都会得到其他所有成员[1]免疫共沉淀的⼀般操作流程（中英⽂对照）：成⼲扰。
预测蛋白的互作蛋白的方法
预测蛋白的互作蛋白的方法
预测蛋白的互作蛋白的方法主要有以下几种：
1. 免疫共沉淀技术：免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其基本原理是：细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE 及Western blotting分析。
2. pull-down技术：用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-),从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。
通过Pull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。
以上方法仅供参考，建议查阅专业书籍或文献以获取更多关于预测蛋白互作蛋白的更具体的信息。
羧基磁珠免疫共沉淀
羧基磁珠免疫共沉淀羧基磁珠免疫共沉淀是一种用于蛋白质相互作用研究的有效方法。
该技术通过免疫共沉淀实现蛋白质的富集，从而揭示蛋白质间的相互作用关系。
本文将以从简到繁、由浅入深的方式，探讨羧基磁珠免疫共沉淀的原理、应用和前景。
1. 羧基磁珠免疫共沉淀的原理羧基磁珠是一种具有羧基官能团的磁性材料。
在免疫共沉淀中，由于抗体与待测蛋白质之间的特异性结合，将带有特定抗体的羧基磁珠与混合蛋白溶液一起孵育，待测蛋白质将与羧基磁珠上的抗体结合形成复合物，并被羧基磁珠吸附。
通过外部磁场的作用，将带有复合物的羧基磁珠分离出来，获得富集的蛋白质溶液。
这种方法可以有效地富集目标蛋白质并去除其他干扰物质。
2. 羧基磁珠免疫共沉淀的应用羧基磁珠免疫共沉淀广泛应用于蛋白质相互作用的研究中。
通过该方法，可以鉴定蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA或RNA等的相互作用关系。
在生物学研究中，可以利用羧基磁珠免疫共沉淀来鉴定蛋白质的交互伙伴，揭示蛋白质的功能和信号传递机制。
该方法还可以用于筛选潜在的药物靶点或治疗靶点，并在疾病诊断和治疗中发挥重要作用。
3. 羧基磁珠免疫共沉淀的前景羧基磁珠免疫共沉淀是蛋白质研究领域的重要工具，具有广阔的应用前景。
随着分子生物学和生物技术的不断发展，对于蛋白质相互作用的研究需求也越来越高。
羧基磁珠免疫共沉淀的高选择性和敏感性使其成为解析蛋白质相互作用的理想方法。
未来，随着材料科学和生物技术的进一步进展，羧基磁珠的制备和性能将得到进一步改善，从而提高蛋白质相互作用研究的精确性和可操作性。
总结回顾：羧基磁珠免疫共沉淀作为一种用于蛋白质相互作用研究的重要工具，通过抗体的特异性结合和羧基磁珠的磁性特性，实现了对蛋白质的富集和分离。
该方法在蛋白质交互作用、功能鉴定和疾病治疗等领域具有广泛的应用前景。
随着科学技术的不断进步，羧基磁珠的制备和性能将得到进一步优化，推动蛋白质相互作用研究的发展。
对于我个人而言，通过深入学习和理解羧基磁珠免疫共沉淀的原理和应用，我将能够更好地应用该技术，拓宽自己的研究领域，并为相关学科的发展做出贡献。
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)
一原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP 管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A 珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min 变性。
免疫共沉淀原理及实验方法
免疫共沉淀原理及实验方法免疫共沉淀是一种通过使用抗体分子来使特定蛋白质复合物沉淀下来的方法。
在这个过程中，抗体与蛋白质复合物结合，形成抗原-抗体共沉淀复合物。
这种方法可以用于研究蛋白质间的相互作用、检测特定蛋白质的存在以及分离蛋白质复合物等。
1.细胞裂解：将目标细胞或组织加入裂解缓冲液中，破坏细胞膜，使蛋白质释放到溶液中。
2.抗体结合：将特异性抗体加入裂解液中，与目标蛋白质结合。
3.免疫沉淀：将抗原-抗体复合物与免疫沉淀剂（如蛋白A/G琼脂糖或蛋白A/G磁珠）结合，形成免疫复合物。
4.洗涤：通过多次洗涤步骤去除非特异性结合物质，以提高免疫复合物的纯度。
5.去除抗原-抗体结合：使用酸性溶液或高盐浓度缓冲液等方式解离免疫复合物，分离出目标蛋白质。
6. 分析：通过Western blot、免疫印迹、质谱等手段对分离出的蛋白质进行分析。
免疫共沉淀的原理是利用抗体与特定目标蛋白质的结合来将其沉淀下来。
抗体通常是由动物制备得到的，可以选择单克隆抗体或多克隆抗体。
在实验中，抗体可以特异性地结合到目标蛋白质的表位上，形成稳定的免疫复合物。
随后，通过与免疫沉淀剂结合，可以使免疫复合物沉淀下来。
免疫共沉淀这种实验方法在生物医学研究中具有广泛的应用，例如检测蛋白质间的相互作用、鉴定细胞中的蛋白质复合物、研究信号转导通路等。
通过免疫共沉淀可以揭示蛋白质的功能和相互作用网络，深入理解生物学过程中蛋白质的功能和调控机制。
然而，免疫共沉淀实验也存在一些局限性。
首先，抗体需具有高度的特异性和亲合力，以保证免疫复合物的选择性。
其次，免疫共沉淀依赖于抗体与目标蛋白质的免疫反应，在一些情况下可能出现低表达的蛋白质无法被充分沉淀的问题。
此外，非特异性结合和高背景信号也会影响实验结果的准确性。
综上所述，免疫共沉淀是一种基于抗体-抗原相互作用原理的实验方法，可用于研究蛋白质间的相互作用和分离特定蛋白质复合物等。
这种方法广泛应用于生物医学研究领域，对于揭示蛋白质功能和调控机制具有重要意义。
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8)通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带
9)从胶上切下目标带，将其放到微量离心管
中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次3 min 10)用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电 洗脱 11)通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的 肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman 降解测序。
2）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质—
蛋白质相互作用。
3）不能给出动态的结果，同时也还应该排除
细胞在破碎时导致本来没有相互作用的蛋白 质发生凝聚的可能性
4）所得的蛋白质有可能不是直接相互作用的
蛋白质,而是通过第三者间接相互作用的蛋白 质
免疫共沉淀检测蛋白质的原理和常见问题
利用免疫共沉淀（CO-IP）技术、酶联免疫
法，在此方法中,蛋白质及复合物均以天然状 态存在，符合体内实际情况，能更真实的反 映出蛋白质间的相互作用情况，得到的蛋白 可信度高 2）抗原与相互作用的蛋白质以细胞中相类似 的浓度存在,避免了过量表达测试蛋白质所造 成的人为效应。
6 局限性
1）此方法本身具有一定的风险,因为所选择靶
蛋白的相关蛋白在此细胞株中可能没有明显差 异这就需要实验前做好充分的准备,并根据亚 系间不同的生物学行为来正确的选择靶蛋白
3 注意的问题
1）细胞裂解
采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在 的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非 离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细 胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。 不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞 裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的 cocktailer。
2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使
用。 3）使用对照抗体： 单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单 抗 兔多克隆抗体：正常兔IgG
4 应用
通常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结
合产生相互作用。 用于验证确定某种特定蛋白质的新的作用搭 档。
5 优点
1） Co-IP是检测蛋白质间相互作用的经典方
（ELISA）都可以研究抗原和抗体之间的相 互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的 环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而 在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以 通过酵母双杂交进行检测，从而在活细胞的 水平上检测抗原和抗体的免疫反应。
在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min
2)将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，
3)收集上清（约30
ml）并加入30μg的适当抗 体，4℃摇动免疫沉淀物1 h
加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液， 4℃摇动免疫沉淀物30 min 5)用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白ASepharose混合物，再重复洗5次。最后，用 NETN洗一次 6)吸出混合物的液体部分。加入800μl的 1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min 7)将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯 度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳过夜
免疫共沉淀（Co-IP ）
——研究蛋白质间相互作用的技术
0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ级生化专业：毛赟赟
蛋白质相互作用的类型有牢固型互作和暂时型互作 两种。互作力既可以强，也可以弱。 牢固型互作以多亚基蛋白复合体常见，最好通过免 疫共沉淀（Co-immunoprecipitatio）、Pull-down 或Far-western法研究。 暂时型蛋白质相互作用，被认为是涉及到胞内大部 分生物过程，包括蛋白修饰、转运、折叠、信号转 导和细胞周期等，属于开/闭性质，可以通过交联或 标记转移法来研究。胞内研究蛋白质互作的方法除 上述方法外，还有蛋白芯片、核磁共振、质谱、X射线晶体衍射等 。
1 Co-IP的原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整
细胞内存在的许多蛋白质—蛋白质间的 相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X 的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合 的蛋白质Y也能沉淀下来。
免疫共沉淀检测蛋白质的原理和常见问题
2
1)
方法
收获培养的细胞（1×107－1×108）冷 PBS洗涤2次细胞裂解液裂解细胞，冰浴 30min