基因表达的机制

（二）核糖体结合位点

大肠杆菌核糖体结合位点包括下列特征 结构要素：
–SD序列； –翻译起始密码子； –SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱 基组成； –基因编码区5′端若干密码子的碱基序列。
3′
5′
CACUAGG A C U C U C C U A G G A Pu Pu U U U Pu Pu AUG

⑵同步表达相关tRNA编码基因
（四）质粒拷贝数

质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响

解决上述难题的一种有效策略是将重组 质粒的扩增纳入可控制的轨道。
三、外源基因在大肠杆菌中表达的形式
（一）包涵体及其性质
在一定的条件下，外源基因的表达产物在 大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起形 成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵 体。
具有原核细菌无法比拟的真核蛋白 质翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟 、工艺简单、成本低廉
不含有特异性的病毒、不产内毒 素。
二、酵母菌的宿主系统
⑴酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）
分泌型目的蛋白表达系统的构建

绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外 ，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素 ）分泌到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释放 蛋白，它激活定位于内上的磷酸酯酶，导致细菌内外 膜的通透性增大。因此，只要将细菌素释放蛋白编码 基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的 受体细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码 序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体 细胞，并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录 ，则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。
3．SD序列与起始密码子之间的距离的影响
翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合 物结构中的P位。 SD序列位于AUG之前大约七个碱基处。
4．起始密码子及其后续若干密码子的影响

大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三
种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的
1．生物体对密码子的偏爱性 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白 质编码基因，对简并密码子使用频率并 不相同，具有一定的偏爱性。 其决定因素是：


生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体fX174）基因组中， 密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC丰富的 生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并 密码子占90%以上的绝对优势
（二）大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
二、外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 （一）启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合 酶结合并能起始转录的序列，其大小 在20～300个碱基长度范围内，具有 转录目标基因的mRNA的功能。
密码子与反密码子相互作用的自由能 性中等强度规律如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、 UUU、AUA、UAU等使用少如GUG、CAC、UCG、 AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；


细胞内tRNA的含量
外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞 中获得最佳表达的两种策略

⑴外源基因全合成
第一节 基因表达的机制
一、有效表达的三个环节 1.转录起始（关键和限速步骤） 转录 宿主RNA聚合酶 启动子
2.mRNA的延伸与稳定性
非特异性终止:衰减子,抗终止序列 正确终止转录 终止序列 mRNA稳定性与Poly(A)尾有关 载体上添加 Poly(A)掺入信号 宿主RNase缺失,增强mRNA稳定性
（五）整合型外源蛋白

将外源基因整合到染色体的非必需编码 区，使之不干扰宿主细胞的正常生理代 谢。 同源重组：重组对之间需要有同源性。 调节这一过程的蛋白（如大肠杆菌中的 RecA）不是序列专一性的，而是同源依 赖的。经常设计长的同源区域。

四、在大肠杆菌高效表达目的基因的策略



Hale Waihona Puke 1.优化表达载体设计 ⑴启动转录起始的启动子序列 ⑵决定mRNA翻译的SD序列的优化 2.提高稀有密码子tRNA的表达作用 如：Pro CCG CCC CCU和CCA
基因本身的转录效率下降；

如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性 标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其 它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；

过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低 外源基因编码产物的翻译效率
3．以包涵体形式表达目的蛋白的操作

如果未进行特殊设计（如分泌型表达或 融合型表达），外源基因在大肠杆菌中 表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时 ，表达产物一般倾向于形成包涵体。因 此，以包涵体形式表达目的基因操作的 关键就是选择高表达的载体。
（三）分泌型异源蛋白的表达


在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞 中的定位可分为两种形式：即以可溶性或 不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中； 或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质 ，甚至穿过外膜进入培养基中。 蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分 泌的前提条件。
1．分泌表达形式的优点
⑴目的蛋白稳定性高， 重组人胰岛素原若分泌到细胞周质中，其 稳定性大约是在细胞质中的10倍 ⑵目的蛋白易于分离 ⑶目的蛋白末端完整，N端的甲硫氨酸残基 可在信号肽的剪切过程中被有效除去。
2．分泌表达形式的缺点
相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋 白分泌机制并不健全。外源真核生物基 因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达， 少数外源基因既便能分泌表达，但其表 达率通常要比包涵体方式低很多，因此 目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组 大肠杆菌尽管有，但并不普遍。
第三节 外源基因在酵母菌中的表达


一、酵母菌作为表达外源基因受体菌的 特征 1．酵母菌的分类学特征 酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方 式进行无性繁殖的单细胞真核生物。
2． 酵 母 菌 表 达 外 源 基 因 的 优 势
全基因组测序，基因表达调控机 理比较清楚，遗传操作简便。 能将外源基因表达产物分泌至培 养基中
（二）以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点
1．包涵体表达形式的优点： 包涵体的水难溶性及其密度远大于其 它细胞碎片和细胞成分。 大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对 异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁 。
2．包涵体表达形式的缺点
包涵体变性复性操作的技术难题，尤其 当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时 ，体外复性蛋白质的成功率相当低，一 般不超过30%。
SD序列
核糖体小亚基 上的16S-rRNA
mRNA
起始密码
原核生物mRNA与核糖体结合的分子机制
1．SD序列的影响 SD序列与16S rRNA的碱基互补性
–一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越
强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程
度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱基互
补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要
。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一
个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降
低
2．SD序列与起始密码子之间的序列的影响
SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最 高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的 50%和25%。紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始 也有影响，对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言 ，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果 用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20 倍


3.提高外源基因mRNA的稳定性 减少核酸外切酶可能对外源基因的切割 作用 改变外源基因mRNA的结构，使之不易被 降解



4.提高外源基因表达产物的稳定性 使用蛋白水解酶缺陷宿主 分泌型载体 对外源蛋白中水解酶敏感序列修饰和改造 融合蛋白 5.优化发酵过程 工艺：选用合适的发酵罐 生物方面 ⑴O2 PH.T.培养基成分 ⑵表达条件 先成长后表达 ⑶表达量 菌体密度X 单菌表达水平



4．目的蛋白溶解性好，由于受体蛋白的 存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好 的空间构象，且大多具有水溶性和一定 的生物活性。 5．目的蛋白需要回收，融合蛋白需要裂 解和进一步分离，才能获得目的蛋白。 在实际生产中，产品主要的成本往往就 在该步骤。
（四）寡聚型异源蛋白的表达

随着重组质粒拷贝数的不断增加，受体 细胞内的大部分能量和原料被用于合成 所有的重组质粒编码蛋白，而细胞的正 常生长代谢却因能量受到影响。
融合蛋白 分泌蛋白表达系统 包涵体表达系统 使用蛋白水解酶基因缺陷型受体细胞
5.目的基因的沉默


1）位置效应 甲基化程度高，转录活性低的异染色质上 2）转录水平基因沉默 启动子甲基化和外源基因的异染色质化
重复序列(repeat sequences)可导致自身甲基化

3）转录后水平基因沉默 共抑制 (cosuppression)是转录后水平基因沉默的一
（三）融合型异源蛋白的表达



融合蛋白:将外源基因与受体菌自身的蛋白质 编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读 框架进行表达。 在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白 部分位于N端，异源蛋白位于C端。 通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割 位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外 从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白。
50%而UUG只及AUG的25%。

从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列