第一章 分子生物学的基本操作幻灯片_
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Ligase
限制酶的发现——细菌的限制与修饰现象
2020/8/4
2020/8/4
酶类
重组DNA实验中常见的主要工具酶
功能
限制性核酸内切酶(II型) DNA连接酶
识别并在特定位点切开DNA 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子
DNA聚合酶I（大肠杆菌） 反转录酶 多核苷酸激酶
2020/8/4
1972 - Paul Berg,
Produced first recombinant DNA using EcoRI
EcoRI recognition sites
EcoRI cuts DNA into fragments
λ phage DNA
Sticky end
The two fragments stick together by base pairing
这就是基因克隆，或分子克隆 。
2020/8/4
分子克隆的载体---具备自主复制 能力的DNA分子 （vector），如 病毒、噬菌体和 质粒等小分子量 复制子都可以作 为基因导入的载 体。
2020/8/4
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后， 能有效地吸收λ噬菌体DNA。
第一章 分子生物学的基本操作幻灯片
分子生物学研究从20世纪中叶开始高速发展的 最主要原因——
现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和 基因工程技术的进步。
基因操作
2020/8/4
DNA分子的切割与连接 核酸分子杂交
凝胶电泳
细胞转化 核酸序列分析 基因的人工合成 基因的定点突变
PCR扩增
• 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。
Stanley Cohen &
Annie Chan
Plasmid pSC101
Heat killed S cells mixed with living R cells
Living S cells in blood sample from dead mouse
Results
2020/8/4
1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA侵染细菌实验
2020/8/4
2. 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复 制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；
2020/8/4
Rosalind Franklin
X-ray source
Crystallized DNA
Photographic film
Maurice Wilkins 1953- Franklin & Wilkins
Description of the structure of DNA
Francis Crick & James Watson
外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍 与性状表达的过程.
基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具有 跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于 毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力。
2020/8/4
1.1 重组DNA发展史-------
三大成就 ：
1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是 DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
Second replication
2020/8/4
Matt Meselson
Conservative Model
Semiconservative Model
3. 50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成 功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。
2020/8/4
Jacob and Monod
2020/8/4
1958 -Matthew Meselson & Franklin Stahl proved that DNA replication in bacteria follows the semiconservative pathway
Parent cell
Frank Stahl
First replication
Recombinant
2020/8/4
DNA
DNA ligase
SV40 DNA
仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行 DNA的切割和重组远不能满足基因研究的需要。
DNA片段在体外不具备自我复制能力，要想得到足够量 和足够纯度的DNA，必须将它们连接到具备自主复制能力 的DNA分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样 能够摄取质粒DNA。
从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。
2020/8/4
1973 - Boyer, Cohen & Chang
Transform E. coli with recombinant plasmid
Kanamycin resistance gene
末端转移酶 DNA外切酶III λ噬菌体DNA外切酶 碱性磷酸酯酶
按5'到3'方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口
按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链 把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记 实验或用来进行DNA的连接 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸 从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸 从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
1928 Frederick Griffith &1944 Oswald Avery
Transformation of Streptococcus pneumoniae
Bacterial Strain
Living
Living
S cells
R cells
capsule
Injection
Heat killed S cells
两大技术保证：
1.DNA的体外切割和连接
1962年Arber 发现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了 DNA 连接酶 DNA ligase covalently links源自文库two DNA strands
3’
5’
Restriction enzyme
Ligase
5’
2020/8/4
3’
Restriction enzyme
限制酶的发现——细菌的限制与修饰现象
2020/8/4
2020/8/4
酶类
重组DNA实验中常见的主要工具酶
功能
限制性核酸内切酶(II型) DNA连接酶
识别并在特定位点切开DNA 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子
DNA聚合酶I（大肠杆菌） 反转录酶 多核苷酸激酶
2020/8/4
1972 - Paul Berg,
Produced first recombinant DNA using EcoRI
EcoRI recognition sites
EcoRI cuts DNA into fragments
λ phage DNA
Sticky end
The two fragments stick together by base pairing
这就是基因克隆，或分子克隆 。
2020/8/4
分子克隆的载体---具备自主复制 能力的DNA分子 （vector），如 病毒、噬菌体和 质粒等小分子量 复制子都可以作 为基因导入的载 体。
2020/8/4
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后， 能有效地吸收λ噬菌体DNA。
第一章 分子生物学的基本操作幻灯片
分子生物学研究从20世纪中叶开始高速发展的 最主要原因——
现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和 基因工程技术的进步。
基因操作
2020/8/4
DNA分子的切割与连接 核酸分子杂交
凝胶电泳
细胞转化 核酸序列分析 基因的人工合成 基因的定点突变
PCR扩增
• 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。
Stanley Cohen &
Annie Chan
Plasmid pSC101
Heat killed S cells mixed with living R cells
Living S cells in blood sample from dead mouse
Results
2020/8/4
1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA侵染细菌实验
2020/8/4
2. 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复 制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；
2020/8/4
Rosalind Franklin
X-ray source
Crystallized DNA
Photographic film
Maurice Wilkins 1953- Franklin & Wilkins
Description of the structure of DNA
Francis Crick & James Watson
外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍 与性状表达的过程.
基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具有 跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于 毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力。
2020/8/4
1.1 重组DNA发展史-------
三大成就 ：
1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是 DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
Second replication
2020/8/4
Matt Meselson
Conservative Model
Semiconservative Model
3. 50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成 功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。
2020/8/4
Jacob and Monod
2020/8/4
1958 -Matthew Meselson & Franklin Stahl proved that DNA replication in bacteria follows the semiconservative pathway
Parent cell
Frank Stahl
First replication
Recombinant
2020/8/4
DNA
DNA ligase
SV40 DNA
仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行 DNA的切割和重组远不能满足基因研究的需要。
DNA片段在体外不具备自我复制能力，要想得到足够量 和足够纯度的DNA，必须将它们连接到具备自主复制能力 的DNA分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样 能够摄取质粒DNA。
从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。
2020/8/4
1973 - Boyer, Cohen & Chang
Transform E. coli with recombinant plasmid
Kanamycin resistance gene
末端转移酶 DNA外切酶III λ噬菌体DNA外切酶 碱性磷酸酯酶
按5'到3'方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口
按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链 把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记 实验或用来进行DNA的连接 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸 从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸 从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
1928 Frederick Griffith &1944 Oswald Avery
Transformation of Streptococcus pneumoniae
Bacterial Strain
Living
Living
S cells
R cells
capsule
Injection
Heat killed S cells
两大技术保证：
1.DNA的体外切割和连接
1962年Arber 发现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了 DNA 连接酶 DNA ligase covalently links源自文库two DNA strands
3’
5’
Restriction enzyme
Ligase
5’
2020/8/4
3’
Restriction enzyme