电泳法和高效毛细管电泳法
药物分析：常用定量分析法与应用——电泳法
由于电泳法具有灵敏度高、重现性好、检测范围广、操作简便并兼备分离、鉴定、分析等优点，故已成为生物技术及生化药物分析的重要手段之一。
现就该方法基本原理，分类和应用概要介绍如下。
（一）电泳法的基本原理和分类在电解质溶液中，带电粒子或离子在电场作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。
电泳分离是基于溶质在电场中的迁移速度不同而进行的。
一个离子在电场中的移动速度为（公式）（式中解释）根据电泳的分离特点及工作方式，电泳可分为三大类：（l）自由界面电泳：在二根U形管里的溶液中，同种分子的构型及荷电情况基本一致，在电场影响下，它们逐渐密集而与其他电泳迁移率不同的物质之间形成明显的界面。
（2）区带电泳：在电泳过程中，应用各种不同的惰性支持介质，在电场作用下，使具有不同泳动速度的组分形成各自区带的电泳。
根据所用的支持物不同可分为：纸电泳法、醋酸纤维素薄膜电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和十二烷基硫酸纳（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳法。
（3）高效毛细管电泳：是在一根内径约50μm的毛细管中，在高压电场下进行样品分离分析的一种新型电泳技术。
（二）常用电泳法的类型及其应用1．纸电泳法纸电泳法是用滤纸作为支持介质的一种电泳法，其操作要点如下：（1）缓冲液的选择：应根据供试品的理化特性，需要的电泳速度和分辨力，选择适宜的缓冲液、pH值和离子强度。
（2）滤纸的裁剪：滤纸可按需要裁成与电泳槽相当的长方形或长条形，样点的间距为2～3cm，滤纸长度视电源输出最高电压及所需的电场强度而定，电压恒定时，所需场强越大，滤纸裁得越短。
（3）点样方法：分干点法与湿点法。
干点法是将供试品溶液点于滤纸上，吹干，再点，反复数次直至点完规定量的供试品溶液，然后用喷雾器将滤纸喷湿，点样处最后喷湿。
干点法能浓缩供试品，适用于稀的供试品溶液。
湿点法是将滤纸全部浸入缓冲液中，湿润后，取出，用滤纸吸干多余的缓冲液，滤纸点样部分需用架子架起，点的次数不宜过多，稀的供试品溶液应预先浓缩。
电泳技术在药物分析中的应用
美国药典：
1985版起开始将电泳收载入附录,并对凝胶电泳的原理、影响因素作 了详细的说明,NF22 册又增加了DESK电泳。
中国药典：
1990 年版二部首次收载入附录中，1995 年版 、2000 年版、2005 年版将电泳中的五种电泳技术(纸电泳法、醋酸纤维素薄膜电泳法、 琼脂糖凝胶电泳法,聚丙烯酰胺凝胶电泳法、SDS2聚丙烯酰胺凝胶电 泳法、免疫电泳法在附录中规定下来,并对高效毛细管电泳也作了详 细的说明。
应用：《中国药典2005版三部》中人血白蛋白、人免疫球
蛋白、乙型肝炎人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、破 伤风人免疫球蛋白、2000版中人胎盘蛋白、人胎盘血免疫 球蛋白中的蛋白质纯度测定。 临床检验中已经广泛用于血清蛋白,血红蛋白,球蛋 白,脂蛋白,糖蛋白,甲胎蛋白,类固醇及同工酶、尿蛋白等 的分离分析以及免疫电泳等中 ，用于疾病的诊断。
聚丙烯酰胺凝胶电泳:
4.琼脂糖电泳
琼脂糖电泳：是用琼脂糖作为电泳支持介质的一 种方法。一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶 孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛 效应。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段， 尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离 DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高 达107bp的DNA片段。 应用：判断扩增片断的大小；回收扩增片断，用 于转印 进行Southern印迹 用于中药材的鉴别真伪、分辨优劣，中药材 指纹图谱的研究等。
高效毛细管电泳法:根据离子在缓冲液中迁移的速 度与电场呈正比原理,将凝胶电泳解析度和快速液 相色谱技术溶为一体,是继高效液相色谱法出现后 分析科学领域的又一次革命。 特点：“三高二少”，即具有高灵敏度、高效快 速、高分辨率,用量少、成本低等优点,可方便地 连续洗脱样品。
高效毛细管电泳法原理
高效毛细管电泳法(简称CE)是一种应用电泳原理的分离技术,适用于分离和测定小分子有机化合物和生物大分子,如氨基酸,肽,核酸和蛋白质等,因其操作简便,分离速度快,分辨率高,样品耗费小等优点而广泛应用于分析技术领域.
其原理主要是利用电荷作用力和电流作用力共同作用于被分离物质,在快速流动的毛细管内进行分离,不同的物质根据其理化性质差异,在电场力的作用下,快速分离并达到最终的分析结果.
具体分离过程可分为三步:1.预处理:通过对样品进行一些必要的化学或物理处理,如蛋白的
脱盐,核酸的降解等,使之达到最佳测定条件.2.分离和检测:样品被注入高压,在毛细管内被电场引导向阳极(或阴极)并被快速分离,经过检测器检测,得出分析结果.3.定量分析:基于标准品,定量分析被分离物质的浓度.
在实际应用中,高效毛细管电泳法可通过改变分离毛细管的材料、加入胶体、调整电场强度等方式,进一步提高分离效率和分辨率,并能够与其他分析技术结合使用,如质谱法、光谱法等.
综上,高效毛细管电泳法是一种快速、高效、准确的分离技术,具有广泛的实际应用价值,在
企业管理和生物学等领域都有着广泛的应用前景.。
毛细管电泳法
毛细管电泳法概述毛细管电泳法是一种分离和测定化合物的方法，主要通过在毛细管中施加电场，利用化合物在电场作用下的电荷性质和分子大小来实现分离。
毛细管电泳法具有快速、高效、高分辨率、高灵敏度和易于自动化等特点，广泛应用于生命科学、化学分析和药物研发等领域。
原理毛细管电泳法的原理基于化合物在溶液中的电荷性质和分子大小。
在毛细管中施加电场后，带正电荷的化合物（称为阳离子）会向负极移动，带负电荷的化合物（称为阴离子）会向正极移动。
此外，较小的分子会比较大的分子更快地移动。
毛细管电泳法通常涉及两种类型：区域电泳和溶剂前移电泳。
区域电泳区域电泳是毛细管电泳法中常用的方法。
在区域电泳中，毛细管中的电场强度不均匀，其中一个区域的电场强度较弱，另一个区域的电场强度较强。
样品被注入到电场强度较弱的区域，然后通过施加电场使样品向较强的电场区域移动。
不同化合物的迁移速度取决于它们的电荷和分子大小，因此可以实现化合物的分离。
溶剂前移电泳溶剂前移电泳是另一种常用的毛细管电泳法。
在溶剂前移电泳中，毛细管中的电场强度是均匀的。
样品被注入到毛细管中，然后施加电场使样品移动。
不同化合物的迁移速度取决于它们在溶剂中的溶解度和电荷性质，因此可以实现化合物的分离。
仪器和操作步骤进行毛细管电泳法需要一些特定的仪器和材料，如毛细管电泳仪、毛细管、高电压电源、样品注射器、电解质缓冲液等。
下面是一般的操作步骤：1.准备工作：检查仪器是否正常工作，准备所需的电解质缓冲液和样品。
2.毛细管准备：将毛细管切割为适当长度，并连接到毛细管电泳仪。
3.缓冲液填充：将电解质缓冲液注入毛细管的两端，确保整个毛细管都充满缓冲液。
4.样品注射：使用样品注射器将待分离的样品缓慢而均匀地注入到毛细管中。
注射点距离电极一定距离。
5.施加电场：从高电压电源上施加适当的电场，在实验过程中保持稳定电场。
6.记录结果：观察样品的迁移情况，根据需要调整电场强度和时间，记录分离结果。
高效毛细管电泳法原理
高效毛细管电泳法原理1. 引言高效毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE）是一种分离和检测样品成分的高效分析技术。
它基于电荷移动的原理，利用电场作用将带电样品分子按照电荷大小和大小排列分离。
本文将介绍高效毛细管电泳法的原理以及相关的基本概念。
2. 原理高效毛细管电泳法的分离原理主要包括电迁移、电渗流和扩散。
2.1 电迁移电迁移是指在电场作用下，带电离子向电极迁移的现象。
根据离子迁移速率的不同，可以将不同种类的离子分离开来。
在高效毛细管电泳中，利用气泡塞（例如墨水）将离子解进行填充到毛细管中，然后施加电压，使带电离子向电极移动。
2.2 电渗流电渗流是指随着离子迁移而产生的流动。
由于电场作用下毛细管内壁带有固定电荷，会在离子迁移的同时引起流体流动。
这种电渗流可加速离子的迁移速度，提高分离效率。
2.3 扩散扩散是指分子由于热运动而发生的自由扩散。
在高效毛细管电泳中，离子在电场作用下会发生迁移，而扩散则会限制离子迁移的速率。
通过控制毛细管的尺寸和填充材料，可以优化扩散效应，进一步提高分离效率。
3. 工作步骤高效毛细管电泳法的工作步骤主要包括样品进样、分离和检测。
3.1 样品进样样品进样是将待分析的样品注入到毛细管中的过程。
常用的进样方式包括静态进样和动态进样。
在静态进样中，样品通过注射器或微量移液器直接注入到毛细管中。
在动态进样中，利用高压电泵将样品以一定的流速进样到毛细管中。
3.2 分离分离是利用电场作用将样品中的成分分离开来的过程。
通过在毛细管两端施加电压，带电的离子根据电荷和大小进行迁移，从而实现分离。
根据需要可以调节电场强度、温度和 pH 等因素来优化分离效果。
3.3 检测检测是对分离后的样品进行定性和定量分析的过程。
常用的检测方法包括紫外光检测、荧光检测、电化学检测等。
通过对分离后的样品在检测器中发生的特定物理或化学反应进行检测，并根据峰面积或峰高来定量分析样品中的成分。
第七章 毛细管电泳法
特
点
近似通用，常规应用 灵敏，但试样通常要衍生 高灵敏度，价格昂贵，要衍生化 通用性 选择性，灵敏度高，微量 仪器复杂，可获结构信息， 质量灵敏度高 灵敏度高，操作有特殊要求
放射
10-9－10-11
第七章 高效毛细管电泳 分析法
high performance capillary electrophoresis,HPCE
电场强度
第7章 毛细管电泳
7－1 毛细管电泳的原理
2 电泳和电渗
1. 2.
电渗流的意义
3.
电泳过程中，伴随着电渗现象 电渗流的速度比电泳速度快5－7倍 利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同 一方向，产生差速迁移，在一次电泳操作中同时 完成正、负离子的分离分析
分情况而论
电渗流是毛细管电泳分离的重要参数 控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电 泳分离的效率、重现性、分离度。
第7章 毛细管电泳
7－2 分离模式
5 毛细管等电聚焦 CIEF: 建立在不同蛋白质或多肽之间等 电点（pI值）差异基础上的分离方 法。 蛋白质的等电点(pI): 指蛋白质分子的表观电荷数为零 时的pH值。
第7章 毛细管电泳
5 毛细管等电聚焦 方法:
1.
2.
3.
进样－等电聚焦－检测 先将脱盐的试样（蛋白质）以≥1％的浓度与两性电 解质溶液混合，用压力进样充入毛细管柱(阳极端)， 置于阳极电解质溶液如H3PO4中，检测端为阴极端，置 于阴极电解质如NaOH中。 施加电压，进行电泳实验。两性电解质离子形成pH的 位置梯度，而蛋白质在迁移时会在其等电点的pH区域 内停止移动。这样pI不同的蛋白质各组分会在毛细管 内很窄的不同pH区域内聚焦. 在阳、阴极电解液中加入盐如NaCI或NaOH,破坏pH梯 度，使各组分蛋白质重新带电，在电场力作用下发生 迁移、检测，使不同组分的蛋白质得到分离。
毛细管电泳
5、进样方式
进样量：毛细管长度的1%-2%；纳升级、非常小
1. 流体力学进样方式 进样端加压、出口端抽真空、虹吸进样
2. 电动进样方式 毛细管一端插入样品瓶，加电压
3. 扩散进样 试样通过扩散作用进入分离柱端口处。
七、 应用 1、离子分析
2、药物分析
采用MEKC模式， 鉴定违禁药物； 效果优于HPLG法
有关物质 有关物质 有关物质 有关物质
例：毛细管电泳（抑肽酶）
AU
ห้องสมุดไป่ตู้
0.008 0.006 0.004 0.002 0.000 -0.002 -0.004 -0.006
15
18.417分钟的是去丙氨酸-去甘氨酸-抑肽酶， 18.617分钟的是去丙氨酸-抑肽酶， 18.829分钟的是抑肽酶峰
18.829
（3）中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏 水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；
（4）可用来分离中性物质。 （5）色谱与电泳分离模式的结合。
4、 毛细管电色谱 CEC
在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定 液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配 为分离机理的电动色谱过程
固定相：依HPLC理论和经验选择，反相应用多 缓冲液：水溶液或有机溶液。
三、高效毛细管电泳分析
技术上的重要改进：
➢ 采用了0.05mm内径的毛细管 ➢ 采用了高达数千伏的电压
特点：
A、分离效率高：104理论塔板数，接近GC 空心管，无固定液，H = B/u；流型不同
B、 分离速度快：优于LC，接近GC C、进样量少：nL
四、分离过程
电泳：带电粒子在电场作用下迁移 电渗：溶剂在电场作用下的单向流动
最基本、应用广的分离模式
毛细管电泳法
第一节
（一）原理
毛细管电泳法
毛细管电泳（CE）亦称为高效毛细管电泳法（HPCE），是20 世纪80年代发展起来的一类高效快速的分离分析方法。该法系以弹性
毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分的
淌度（单位电场强度下的迁移 速度）和分配行为的差异而实
现分离，因此可将其视为经典
电泳技术和现代微柱分离相结 合的产物。
每次进样之前毛细管要用不同的溶液冲洗，选用自动冲洗进样仪器较为
方便。进样方法有压力进样、负压进样、虹吸进样和电动进样等。进样
时通过控制压力、电压或时间来控制进样量。
5.检测器
紫外检测器，荧光检测器，电化学检测器，质谱仪等均可作为CE 的检测器。其中紫外检测器应用最广，它是将毛细管接近出口端的外 层聚合物剥去约2mm一段，使石英管壁裸露，毛细管两侧各放置一 个石英聚光球，使光源聚焦在毛细管上，透过毛细管到达光电池对溶 质进行检测。
2.胶束电动毛细管色谱（MEKC或MECC）
该法系以胶束为假固定相的一种电动色谱。 当操作缓冲液加入大于其临界胶束浓度的离子型表面活性剂如十 二烷基硫酸钠（SDS）或十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）、胆酸等， 这时表面活性剂就聚集形成胶束（假固定相），其亲水端朝外，
憎水非极性核朝内，溶质则在水和胶束两相间分配，各溶质因分
其中以色谱为主，但对荷电溶质兼有电泳作用。 该法克服了CE选择性差和分离中性物质困难的缺点，同 时提高了液相色谱的分离效率，形成其独特的高效、微量、 快捷的特点，开辟了高效微柱分离技术的新途径。
二、仪器设备
（一）毛细管电泳仪的基本结构（见下图）
1.电极槽和进样系统 2.清洗系统 3.毛细管 4.检测器 5.铂电极 6.电极槽 7.恒温系统 8.记录和数据处理
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1 毛细管区带电泳（CZE）
也称为毛细管自由溶液区带电泳 毛细管电泳中最基本的操作模式，应用最广泛，是其它 各种操作模式的母体
第10章 毛细管电泳
2 胶束电动毛细管色谱
10.1.3 分离模式
胶束电动毛细管色谱:是以电渗流驱动的一种色谱技术 胶束电动毛细管色谱 MECC:是以胶束为假固定相的一种 电动色谱，是电泳技术和色谱技术的结合
毛细管等速电泳一般用恒流操作模式.
分离开始后, 在电压的作用下, 各组分由于淌度 的不同被分离.
系统通电后, 样品中迁移速度最大的离子运动最快, 但慢于前导电解质. 迁移速度最小的离子运动最慢, 但快于尾随电解质, 具有不同淌度的离子得到分离。
恒稳态时所有区带具有相同的移动速度.
第10章 毛细管电泳
已成为分离分析生物大分子如蛋白质、多肽、核酸、DNA等强 有力的工具。例应用CGE分离与激光诱导荧光检测相结合，用 于DNA序列快速分析。
第10章 毛细管电泳
5 毛细管电色谱
10.1.3 分离模式
• CEC:以电渗流驱动流动相， 开管和填充两种，通常填充或涂布固定相
比高效液相色谱具有更高的柱效
第10章 毛细管电泳
分离是建立在试样中各组分的电泳淌度不同， 等速电泳中被分析试样进样前后分别使用前导电解 质溶液和终结(后继）电解质溶液，分离后的各组 分区带以相同的电泳迁移速度通过检测窗口。
等速电泳所要求的条件:
1. 特殊的电解质系统:
在毛细管等速电泳中,用有效淌度比样品中任何离子 的有效淌度都大, 并具有一定缓冲能力的离子作为前 导电解质 ( leading electrolyte ), 加入到末端 ( 检测端) 电解槽和毛细管中, 用有效淌度比样品中任 何离子的有效淌度都小, 并具有一定缓冲能力的离子 作为尾随电解质 ( terminating electrolyte ) 加入 起始端电解槽中. 样品加在前导电解质和尾随电解质 之间. 系统中要加入对离子, 以满足电中性的要求.
• 20世纪30－40年代 蒂塞利乌斯 (A.W.K.Tiselius） 建立了移动界面电泳，将电泳发 展成分离技术
• 获得1948年诺贝尔化学奖
•
1981,J.W.Jorgenson,K.D.Lu kacs实验上和理论上为毛细 管电泳的发展奠定了基础。
10.1.2 毛细管电泳的原理
1 ห้องสมุดไป่ตู้置
电极 缓冲液
第10章 毛细管电泳
10.1.3 分离模式
• 毛细管等电聚焦特点:
1. 等电聚焦实际上也是一个试样浓缩过程，这 一过程可用于浓缩试样组分。
2. 具有极高的分辩率，可以分离等电点相差 0.01pH的两种蛋白质.
注意:电渗流的存在会破坏聚焦区带的稳定
第10章 毛细管电泳
7 毛细管等速电泳
10.1.3 分离模式
2. 施加电压，进行电泳实验。两性电解质离子形成pH的 位置梯度，而蛋白质在迁移时会在其等电点的pH区域 内停止移动。这样pI不同的蛋白质各组分会在毛细管 内很窄的不同pH区域内聚焦.
3. 在阳、阴极电解液中加入盐如NaCl或NaOH,破坏pH梯 度，使各组分蛋白质重新带电，在电场力作用下发生 迁移、检测，使不同组分的蛋白质得到分离。
第10章 毛细管电泳
3 毛细管凝胶电泳
10.1.3 分离模式
CGE 是毛细管自由溶液区带电泳派生出的一种电泳方 式
用多孔性的凝胶或其它筛分剂作介质，网状结构， 按分子的大小分离
第10章 毛细管电泳
10.1.3 分离模式
毛细管凝胶电泳的特点： 综合了电泳技术和平板凝胶电泳的优点 ， 1. 电泳峰尖锐，柱效极高 2. 短柱上实现极好的分离 3. 试样容量为10－12g 主要缺点:制备柱较困难，寿命较短
区带电泳和等速电泳使用的电解质溶液的不同
• 在区带电泳中，整个系统都用同一种电解质充 满，这种电解质被称为背景电解质或支持电解 质。它运载电流并有一定的缓冲能力。
• 在等速电泳中，不加入这样的背景电解质。
2. 背景电流要小到足以克服区带电泳效应
在毛细管等速电泳中, 由于没有一个背景电解 质支持电流 (毛细管等速电泳要求溶剂的自身 电导可以忽略不计 ), 各区带互相连接.
10.2.3 理论效率及表示方法
1.理论塔板高
H=L/N
N=
5.54(tR/
W )2 ½
W 为电泳峰的半峰宽 ½
实验上可按上式求出理论塔板数
毛细管
数据处理
试样
检测器
电极 缓冲液
高压电源
（可高至30KV）
第10章电泳法和高效毛细管电
10.1.3 分离模式
1 毛细管区带电泳 2 胶束电动毛细管色谱 3 毛细管凝胶电泳 4 亲和毛细管电泳 5 毛细管电色谱 6 毛细管等电聚焦电泳 7 毛细管等速电泳
第10章 毛细管电泳
10.1.3 分离模式
加入高于胶束临界浓度的 表面活性剂
第10章 毛细管电泳
10.1.3 分离模式
胶束电动色谱的应用特点:
• 使毛细管电泳不仅能分离离子化合物，而且还能分离 中性化合物.
• 比高效液相色谱更为高效.
HPLC 分离柱效为5000－25000理论板数/m
MECC 可达到50000－500000理论板数/m
• 比高效液相色谱更为高速.MECC分离时间通常小于 30min，但达到相仿效率的毛细管LC，需要更长的时 间。
第10章 电泳法和高效毛细管电泳法
(Electrophoresis and High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE)
毛细管电泳是带电粒子在电场力的 驱动下，在毛细管中按其淌度或分 配系数不同进行高效、快速分离的 电泳新技术，也称为高效毛细管电 泳。
6 毛细管等电聚焦
10.1.3 分离模式
CIEF: 建立在不同蛋白质或多肽之间等电点（pI值）差
异基础上的分离方法，通过建立pH值梯度。 蛋白质的等电点(pI):
指蛋白质分子的表观电荷数为零时的pH值。
第10章 毛细管电泳
10.1.3 分离模式
毛细管等电聚焦的实验方法:
进样－等电聚焦－检测
1. 先将脱盐的试样（蛋白质）以≥1％的浓度与两性电 解质溶液混合，用压力进样充入毛细管柱(阳极端)， 置于阳极电解质溶液如H3PO4中，检测端为阴极端， 置于阴极电解质如NaOH中。