高效毛细管电泳法--原理
第五章 高效毛细管电泳和电动色谱
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3Leabharlann 101三、毛细管凝胶电泳
毛细管凝胶电泳 CGE）：按照试样中各个组 分相对分子质量的大小进行分离的方法。 用途：常用于蛋白质、寡聚核苷酸、核糖核 酸、DNA片段的分离和测序及聚合酶链反应产 物的分析。CGE能达到CE中最高的柱效。
• 毛细管等电聚焦是基于不同蛋白质或多肽之 间等电点的差异进行分离的电泳技术。 • 毛细管等电聚焦最具特色的应用是测定蛋白 质的等电点。在异构酶鉴定、单克隆抗体、 多克隆抗体、血红蛋白亚基等研究中，经常 用毛细管等电聚焦。
五、亲和毛细管电泳
亲和毛细管电泳是利用配体与受体之间存在特异性 相互作用，可以形成具有不同荷-质比的配合物而达 到分离目的。
梯度升压方式对毛细管电泳分离的影响 A. 2kV至25kV，0min，一步升压；B.2kV至25kV，5min，线性梯度 升压. 样品：β-乳球蛋白A，溶菌酶，细胞色素C，肌红蛋白，微白蛋白
二、毛细管及其温度控制
毛细管电泳柱作为分离分析的载体，其材料、 形状、内径、柱长、温度对分离度和重现性都 有影响。
缓冲液中加入添加剂，并让缓冲液与毛 细管充分平衡.如加入阳离子表面活性剂 十四烷基三甲基溴化铵(tetradecyl trimethyl ammonium bromide ,TTAB)， 能在内壁形成物理吸附层，使EOF反向. 添加剂还有聚乙烯亚胺、甲基纤维素 (MC)、十六烷基溴化铵(CTAB)等。
毛细管电泳-紫外检测法测定
用于清洗毛细管，防止 样品残留。
标记物
用于增强样品在紫外检 测器中的信号，提高检
测灵敏度。
实验设备
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
01
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毛细管电泳仪
用于分离样品中的各组分，具 有高分辨率和高灵敏度。
紫外检测器
用于检测样品中特定组分的紫 外吸收光谱，从而确定组分的
性质和浓度。
洗脱泵
用于提供洗脱液，清洗毛细管 内的残留物。
毛细管电泳-紫外检测法的优缺点
高分离效率
毛细管电泳具有高柱效和低扩散 系数，能够实现高效分离。
微量样品需求
只需少量样品即可完成分析，适 用于珍贵样品的分析。
毛细管电泳-紫外检测法的优缺点
快速分析
分析时间短，适合高通量分析。
多种检测模式
可结合多种检测器，如紫外、荧光、质谱等，实现多组分同时检测。
毛细管电泳-紫外检测法的优缺点
图表展示
通过柱状图、折线图等形式展示实验结果，便于直观地比较不同样品之间的差异 。
结果分析
吸光度分析
根据实验数据，分析各样品在检测波长下的吸光度，探讨吸 光度与样品浓度之间的关系。
分离效果评估
对毛细管电泳分离后的各组分进行紫外检测，分析分离效果 ，包括峰形、分离度等。
结果比较与讨论
1 2 3
不同样品比较
05
结论
研究成果总结
毛细管电泳-紫外检测法是一种 高效、灵敏的分离分析方法， 适用于多种化合物的分离和检
测。
在本实验中，成功分离和检测 了多种目标化合物，包括有机 酸、氨基酸、肽类和蛋白质等
。
该方法具有较高的分离效率和 灵敏度，能够满足实际应用的 需求。
说明毛细管电泳特点及应用
说明毛细管电泳特点及应用
毛细管电泳是一种高效液相色谱技术，其基本原理是利用电场将带电粒子在毛细管中的移动速率和荷电量的差异进行分离和富集。
毛细管电泳具有高分离效率、快速分离、小量样品、自动化程度高等特点，已经成为了化学、生物、环境学等领域的一个重要分析工具。
其主要应用领域和特点如下：
1.分离生化分子
毛细管电泳可以用于分离和富集DNA、RNA、蛋白质、糖类和小分子有机物等生物分子。
这些生物分子在酸碱性、水解、氧化还原等条件下有不同的化学性质和电荷性质，可以被毛细管电泳技术精确分离和定量。
例如在DNA分离和定量方面，毛细管电泳已经成为PCR扩增产物检测、基因测序、DNA指纹鉴定等分子生物学技术中的重要手段。
2.分析环境污染物
毛细管电泳可以用于环境监测和食品安全检测等领域，可以对水、空气、土壤和食品中的有机和无机污染物进行快速准确定量分析。
例如利用毛细管电泳技术可以分析环境中的氨、硝酸盐、荧光增白剂、PESTICIDE 等有害物质含量，以及酒类中的苯甲酸、乙酸等有害物质。
3.分析药品和代谢产物
毛细管电泳可以快速、灵敏地分离和鉴定药品和代谢产物，具有药动学和毒理学研究的重要意义。
毛细管电泳技术节省反应时间，减少实验操作时间，可对液-液、液-固、固-液等反应进行分离和分析，得到精确的数据和结果。
如利用毛细管电泳技术，可以分析身体内的有机酸、氨基酸、代谢产物等物质。
总之，毛细管电泳技术在化学分析和生物分析中均有广泛应用，且已成为学术研究和工业生产的一种重要分离分析手段。
毛细管电泳测序原理
毛细管电泳测序原理毛细管电泳测序是一种基于DNA片段长度差异的测序技术，其原理是利用毛细管电泳分离DNA片段，并根据片段移动速度的差异确定序列信息。
首先，需要通过PCR扩增得到目标DNA片段。
PCR是一种体外DNA扩增技术，通过DNA聚合酶的作用，将目标DNA序列扩增至足够数量，以便进行下一步的测序分析。
接下来，将PCR产物加入到含有聚合物的毛细管内，并施加电场。
在电场的作用下，DNA片段会被吸附在毛细管内壁上，并形成一个移动带。
然后，施加电场，并在毛细管两端连接电源，使得电场通过毛细管内的DNA移动带。
不同长度的DNA片段根据其分子量不同，会以不同的速度移动，分离出DNA片段。
在这个过程中，由于DNA片段的质荷比不同，所以在电泳过程中会出现DNA 片段的离子机流效应。
DNA片段的离子机流速度与其质量成反比，因此，越长的DNA片段离子机流速度越慢。
当DNA片段离子机流速度相等时，移动速度以及移动距离的大小就取决于DNA 片段的长度。
因此，通过观察移动带的长度，可以确定DNA片段的长度信息。
为了准确测序，通常还需要将目标DNA分成四份，并分别加入四种带有荧光标记的特异性引物。
这些引物会与目标DNA片段互补配对，并在DNA扩增过程中，序列确定位置为反应产物的末端，引物上的荧光标记用于定位。
接下来，将四种标记的引物混合加入PCR反应混合液中，并进行PCR扩增。
在扩增过程中，引物会进行无模板扩增，因此会得到四种不同长度的扩增产物。
随后，将PCR产物经过毛细管电泳分离，根据DNA片段长度的差异，可以将这些扩增产物分离开来，并观察每一带的荧光信号的顺序。
通过分析荧光信号的顺序，可以得到DNA序列的信息。
由于每一个碱基都分别用不同的荧光色标标记，因此可以通过观察荧光信号的顺序获取DNA序列。
毛细管电泳测序的优点是测序速度快、准确度高，可以同时进行多个样品的测序。
毛细管电泳测序仪器相对简单，操作方便，适用于中小型实验室。
毛细管电泳仪的原理
毛细管电泳仪的原理
毛细管电泳仪（capillary electrophoresis，CE）是一种电泳技术，它利用电场对生物分子进行分离和分析。
它是由美国科学家 A.J.P. Martin在20世纪80年代中期发展而来的，已被广泛应用于生物化学，分子生物学，分析化学，环境科学，药物学和其他科学领域。
毛细管电泳仪的基本原理是将样品放入毛细管中，然后把毛细管放置在一个电极板上，当电极板上的电极产生电场时，样品就会沿着电场线移动并分离。
毛细管的直径很小，介质的库仑数也比较低，这就使得电泳过程中离子的移动更快，分离效率更高。
毛细管电泳仪还具有众多优点，比如快速、灵敏、准确、简单等。
它能够实现快速、灵敏的分离，分离效率高达99.5%；它可以分离各种大小的生物分子，甚至可以分离蛋白质；它能够检测和分析复杂的样品；它也可以分析有机溶剂中的有机酸，如乙酸和丙酸；它还可以分析有机物的各种复杂分子，如芳烃和芳香族烃。
由于毛细管电泳仪的优势，它在医学、科学研究等领域得到了广泛的应用，在诊断疾病，研究蛋白质，检测抗体等方面都取得了巨大的成功。
它是一种高效、灵敏、准确的技术，也是一种经济而又可靠的方式，能够实现高通量的分析。
毛细管电泳原理
纳米材料
纳米材料具有独特的物理和化学性 质，在毛细管电泳中可提高检测灵 敏度和分离性能。
生物材料
利用生物活性物质如蛋白质、酶等 作为分离介质，实现生物分子间的 分离和检测。
新型分离模式的开发
多维分离
将多种分离模式结合，实现复杂样品的高效分离。
反相毛细管电泳
采用反相介质作为分离介质，实现对极性分子的分离。
亲和毛细管电泳
利用生物分子间的特异性亲和力进行分离和检测。
微型化与集成化的发展趋势
微型化
减小设备体积，提高分析速度和降低试剂消耗。
集成化
将多个分离步骤集成在一个系统中，实现全自动化分析。
微流控芯片
将毛细管电泳与微流控技术相结合，实现高效、快速和便携的分 析。
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检测技术
紫外可见光谱检测
电化学检测
紫外可见光谱检测是毛细管电泳中最 常用的检测方法之一。该方法通过检 测样品在紫外可见光下的吸收光谱来 进行分析。
电化学检测利用电极反应来测量样品 中的离子或分子。该方法具有高选择 性、高灵敏度和低背景干扰等优点。
荧光检测
荧光检测具有高灵敏度和高选择性， 因此在毛细管电泳中也被广泛应用。 该方法通过测量样品在特定波长下的 荧光强度来进行分析。
选择合适的毛细管电泳实验条 件，如分离电压、电解质浓度 和pH值等，可以提高分析准 确性和灵敏度。
通过优化进样方式和洗脱液的 组成和浓度，可以改善实验条 件。
实验条件的标准化和规范化也 是毛细管电泳改进的重要方向 之一。
06
毛细管电泳研究前沿与展 望
新材料在毛细管电泳中的应用
高分子材料
利用高分子材料作为毛细管电泳 的分离介质，提高分离效率和分
高效毛细管电泳法原理
毛细管区带电泳（CZE）
CZE又称毛细管自由电泳，是毛细管电泳中最基本、应用最普遍的一种模式。它在毛细管中 仅填充缓冲液，基于溶质组分在电场中的迁移速度不同而分离。前述的基本原理即是CZE 的基本原理。
毛细管胶束电动色谱（MECC）
毛细管胶束电动色谱是电泳技术和色谱技术巧妙结合的分离新技术，也是毛细管电泳中唯 一能同时分离中性物质和离子型物质的分离模式。
简称毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE），指以高压电场为驱动力，以毛细管为 分离通道，依据样品中各组分之间淌度和（或）分配行为上的差异而实现分离的一种液相分 配技术。CE是经典电泳技术和现代微柱分离技术相结合的产物。
基本装置
CE 的基本装置包括一个高压支流电源、一根毛细管、一个检测器及两个供毛细管两端插入 而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。
高效毛细管电泳
高效毛细管电泳相对于经典电泳在技术上采取了两项重要改进： 一是采用了0.05mm内径的毛细管, 二是采用了高达数千伏的电压。 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高；
电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加。
基本理论
在电解质溶液中，带电粒子在电场作用 下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移。迁 移速度为：
试中Vep为离子电泳迁移速度， μep为电泳淌度，E为电场强度, q为离子电荷量，η为介质粘度， r为离子半径。
Vep=μep ·E=
q
·E 6πηr
基本理论
CE所用的石英毛细管柱，在pH>3时，石英毛细 管壁上的硅醇基(— SiOH）在水溶液中发生电 离，产生的SiOˉ负离子使毛细管壁内表面带负 电，和溶液接触时相应的缓冲液带正电，形成 了双电层。
高效毛细管电泳法原理
高效毛细管电泳法原理
高效毛细管电泳法原理基于带电粒子在电场中运动的原理。
当一个电场被施加到一根毛细管的两端时，带电粒子会向电场的方向移动。
由于毛细管材料的特性，导致表面带有一定的电荷。
因此，带电分子和离子在电场中运动的速度受到毛细管表面电荷的影响，即被阻碍。
高效毛细管电泳法利用了这个原理，将样品通过毛细管进行分离，通过改变电场的强度、毛细管内部的流体速度等因素，使得不同粒子的迁移率随着时间而不同，从而实现对离子、分子混合物的高效、快速分离。
因此，高效毛细管电泳法在分离、检测中的应用十分广泛，如药物研发、环境监测、基因测序、蛋白质分析等。
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界面化学电化学理论
1.扩散双电层理论 电动电泳现象：
在外加电场作用下，溶胶中固液两相相对运 动；或者在外加力作用下，迫使固液两相进行 相对移动，又可以产生电势差及两相相对运动。 这两种相反的现象均与界面电势差及相对运动有 关。
固液两相产生的原因
1.固体表面从溶液有选择吸附某种离子而带电 2.固体表面上的物质粒子，在溶液发生电离。
分离原理
MECC是在缓冲液中加入表面活性剂，当 其浓度高于临界浓度时形成胶束。在电场 力的作用下，毛细管水相可看作流动相， 胶ห้องสมุดไป่ตู้相可看作“准固定相”，溶质由其在 胶束相和水相中的分配系数不同而在不同 时间流出。
仪器
特点
与HPLC相比，CE的特点是： （1）分析速度快，柱效高； （2）几乎不消耗溶剂，样品用量小； （3）前处理简单，甚至无需前处理； （4）可自由选择被分离物质的类型，使
分离原理
毛细管柱
毛细管柱是CE的核心部件，目前多为 25~75μm之间，材料为聚四氟乙烯、玻璃 和弹性石英，以石英居多。 选择细内径毛细管柱有利于最大散热，但 比表面积大，会增加溶质的吸附作用。
分离模式
毛细管电泳根据分离机理不同，具有多种 分离模式，能够提供互不相关而又互相补 充的信息。
毛细管区带电泳（CZE） 毛细管胶束电动色谱（MECC） 毛细管电泳 毛细管凝胶电泳（CGE） 毛细管等电聚焦（CIEF） 毛细管等速电泳（CITP） 毛细管电色谱（CEC）
1 具平面流型
其电渗驱动力沿毛细管均匀分布，电渗速 度的径向分布几乎是均匀的，它使整个流 体像一个“塞子”一样以均匀的速度向前 运动，不会直接引起样品组分区带扩散。
但在HPLC中，采用的压力驱动方式使柱 中流体呈抛物线型，其中心处速度是平均 速度的两倍，导致溶质区带本身扩张，引 起柱效下降，使其分离效果不如CE。
结语
综上所述，CE技术在药物分析领域已显示 出强大的实力，具有广阔的发展前景，相 信经过科学工作者的不懈努力及深入研究， CE技术将得到不断发展和完善，随着商品 化仪器的不断改进，CE将成为药物分析的 重要工具。
高效毛细管电泳
（High Performance Capillary Electrophoresis，HPCE）
简称毛细管电泳（Capillary Electrophoresis， CE），指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离 通道，依据样品中各组分之间淌度和（或）分配 行为上的差异而实现分离的一种液相分配技术。 CE是经典电泳技术和现代微柱分离技术相结合的 产物。
毛细管区带电泳（CZE）
CZE又称毛细管自由电泳，是毛细管电泳 中最基本、应用最普遍的一种模式。它在 毛细管中仅填充缓冲液，基于溶质组分在 电场中的迁移速度不同而分离。前述的基 本原理即是CZE的基本原理。
毛细管胶束电动色谱（MECC）
毛细管胶束电动色谱是电泳技术和色谱 技术巧妙结合的分离新技术，也是毛细管 电泳中唯一能同时分离中性物质和离子型 物质的分离模式。
高效毛细管 电泳技术
电泳，及其电泳技术
在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在 电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相 反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。
由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移 速率不同，可实现分离。利用电泳现象对某些化 学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳 法或电泳技术。
基本理论
在高电压作用下，双电层中的水合阳离子引
起流体整体朝负极方向移动，该现象称为电渗 流（electro-osmotic flow, EOF）。
电渗流速度可表示为：
Veo= μeo ·E=
εξ η
·E
其中Veo为电渗流速度，
μeo 为电渗淌度，
ξ为双电层的Zeta电位，
ε为分离介质的介电常数
电渗流的特点
基本理论
在电解质溶液中，带电粒子在电场作 用 下，以不同的速度向其所带电荷相反方 向迁移。迁移速度为：
Vep=μep ·E=
q 6πηr
·E
试中Vep为离子电泳迁移速度， μep为电泳
淌度，E为电场强度, q为离子电荷量，η为 介质粘度，r为离子半径。
基本理论
CE所用的石英毛细管 柱，在pH>3时，石英 毛细管壁上的硅醇基 (— SiOH）在水溶液 中发生电离，产生的 SiOˉ负离子使毛细管 壁内表面带负电，和 溶液接触时相应的缓 冲液带正电，形成了 双电层。
图谱清晰 （5）毛细管容易清洗，不容易产生柱污染
当然CE也存在许多不足之处： （1）灵敏度和线性范围不如HPLC （2）仅能够实现微量制备 （3）定量精密度稍低于HPLC
应用
◆ 离子分析 ◆ 体内药物分析 ◆ 中药分析 ◆ 手性拆分 ◆ 蛋白质、多肽、氨基酸分析 ◆ DNA、RNA分析 ◆ 抗生素、维生素、糖类、单细胞分析
分离原理
粒子在电解质溶液中的迁移速度等于 电泳和电渗流两种速度的矢量和,即
V=Vep+Veo=(μep + μeo ) ·E
正离子的运动方向和电渗流一致，故最先 流出；中性粒子的电泳速度为0，故其迁 移速度相当于电渗流速度；负离子的运动 方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度 一般都大于电泳流速度，故它将在中性粒 子之后流出。这样，各种粒子因迁移速度 不同而实现了分离。
基本装置
CE 的基本装置包括一个高压支流电源、 一根毛细管、一个检测器及两个供毛细管 两端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。
高效毛细管电泳
高效毛细管电泳相对于经典电泳在技术 上采取了两项重要改进：
一是采用了0.05mm内径的毛细管, 二是采用了高达数千伏的电压。
毛细管的采用使产生的热量能够较快散 发，大大减小了温度效应，使电场电压 可以很高；电压升高，电场推动力大， 又可进一步使柱径变小，柱长增加。