分子生物学-研究方法(上)PPT课件
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现代分子生物实验技术PPT(上)
3. Ct值与起始模板的关系 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数(Log值）存在线 性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的 标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数， 横坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准 曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
• 将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合 适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有 重nomic library: a storable collection of cellular clones that contains copies of every sequence in the whole genome inserted into a suit基因, 也可以克隆调控基因, 有利于研究基因的结构、功 能和调控机理。
常用的琼脂糖凝胶电泳缓冲液
缓冲液 Tris-乙酸 （TAE） 工作溶液 1×:0.04mol/L Tris-乙酸 0.001mol/L EDTA 贮 存 液（1000 ml） 50×: 242g Tris 57.1ml冰乙酸 100ml0.5mol/L EDTA （pH8.0） 10×: 108g Tris 15.5ml85%磷酸（ 1.679g/ml） 40ml 0.5mol/L EDTA （pH8.0） 5×: 54g Tris 27.5g 硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA （pH8.0）
核酸电泳技术要点
• 制备凝胶：准确称取琼脂糖粉末，以电泳缓冲液（ TAE/TBE）溶解，微波加热至沸腾，待温度降至约60℃ 时，加EB液，混匀后，迅速倒入预先制好胶槽内。 • 电泳：随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，对于大分 子DAN片断。电场强度不宜高于5V/cm。 但对于小片断的 DNA可以5-20 V/cm电压电泳。
分子生物学实验技术ppt课件
质粒转化大肠杆菌的过程
感受态
非定向克隆 +
或
定向克隆
克隆的片段只能按
+ 特定方向连接基因组DNA的构建基因组DNA的类型
质粒（﹤10kb)噬菌体质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可 用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子， 然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比 值（M/Z值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离 的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
两种离子发生方法： 基质辅助激光解吸附/离子化（MALDI)、电喷雾离子化 （ESI)
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基 因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后， 以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一 种技术。
将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进 行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的 噬菌体展示库 。
将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与 “猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库 中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎 物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进 行质谱鉴定。
四、蛋白组学研究
蛋白质分离 蛋白质分析 蛋白质相互作用的研究方法： 酵母双杂交技术，噬菌体展示技术，表
面等离子共振技术，荧光共振能量转移 技术，蛋白质微阵列芯片技术，免疫共 沉淀技术，pull-down技术
蛋白质分离
最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双 向电泳（2-DE），是根据蛋白质的等电点不同在pH 梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（IEF)，然 后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
重叠延伸PCR原理
重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物， 使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过 重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可 简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构 建
分子生物学第五章分子生物学研究法(上)
分子生物学第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA 片段，有的仍有切割位点质粒DNA将DNA 克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8 kb载体：质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学核酸杂交法培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA 印迹32P 标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选，挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板，加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗：第一抗体，识别目标蛋白二抗：抗体的抗体，能增强信号，增加该方法的灵活性分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学SNP概述single nucleotide polymorphism,pronounced “snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，发生频率1%或更高例如：某些人的染色体上的某个位置为A，而另外一些人的同样位置是T，染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记：在遗传分析上用作标记的基因分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学第一代遗传标记：RFLPRFLP标记是发展最早的DNA标记技术。
分子生物学PPT课件
顺式作用元件〔cis-acting element〕 反式作用因子〔trans-acting
element〕 真核生物启动子 增强子 转录因子〔trans-criptional factor,
TF) 转录过程
近启动子：〔核心启动子〕，－40～ ＋5，决定转录起始的准确位置。远启
动子：〔上游控制元件〕，－165～ －40，影响转录的频率。
膜受体介导的信息传递
cAMP -Ａ激酶 途径
磷脂酰肌醇途径
酪氨酸蛋白激酶 途径
胞内受体介导的信息传递
rRNA
RNA的加工成熟
tRNA mRNA
转录起始的选择 选择性加工 mRNA的稳定性
mRNA的构造 翻译的起始调节 可溶性蛋白因子的修饰与翻译起始
调控 选择性翻译 小分子RNA的调控〔反义RNA、干
制 复制的过程
复制的保真性
复制的调控
定义
半保存复制 特点
类型〔线型、环状〕
参与DNA复制的物质
底物 模板 引物 DNA聚合酶 解链酶 引物酶 单链结合蛋白 拓扑异构酶 连接酶
复制起始 复制的过程 延伸
终止
复制起始点 复制方向 引发体的形成
DNApolⅠ和 Ⅲ的3′－5′活性 RNA引物起始复制，引物最终除去，
扰RNA、微小RNA、时序RNA〕 翻译的自我调节 翻译后程度的调控
谢谢
染色质构造对基因表达的影响 DNA的甲基化与去甲基化 染色体(质)丧失 基因扩增 基因重排
顺式作用元件 反式作用因子〔类型、构造〕 转录起始的调节〔转录起始复合物、
反式作用因子的活性、作用方式〕 RNA聚合酶 真核基因转录调控的主要形式 应答元件的作用机制 真核基因转录后程度上的调控
医学分子生物学ppt完整版
2024/1/30
切除修复
对于较复杂的DNA损伤 ，如嘧啶二聚体或DNA 链断裂，通过切除损伤 部位并合成新的DNA片 段进行修复。
重组修复
在DNA双链断裂等严重 损伤情况下，通过DNA 重组机制进行修复，涉 及同源序列的搜索和交 换。
13
DNA重组的方式与意义
同源重组
发生在同源序列之间的重组，通过交 换DNA片段实现遗传信息的重新组合
6
02
基因与基因组
2024/1/30
7
基因的概念与结构
01 基因的定义
基因是遗传信息的基本单位，控制生物性状的遗 传。
02 基因的结构
基因由编码区和非编码区组成，编码区包括外显 子和内含子。
03 基因的遗传效应
基因通过控制蛋白质的合成来控制生物的性状。
2024/1/30
8
基因组的组成与特点
01 基因组的定义
基因表达的调控方式
基因表达受到多种因素的调控，包括 转录因子、表观遗传学修饰、 microRNA等。
2024/1/30
10
03
DNA复制、修复与重组
2024/1/30
11
DNA复制的过程与特点
1
DNA复制的过程
起始、延伸和终止三个阶段，涉及多种酶和蛋白 质的参与，确保DNA的准确复制。
2 3
DNA复制的特点
结合分子生物学指标，对 药物疗效进行评估，为新 药研发和临床应用提供依 据。
29
分子生物学技术在个体化医疗中的应用
基因检测
通过基因检测分析个体基 因组信息，为个体化医疗 提供基础数据。
2024/1/30
个体化用药指导
根据基因检测结果和药物 代谢特点，为患者提供个 体化用药建议，提高药物 治疗效果。
切除修复
对于较复杂的DNA损伤 ，如嘧啶二聚体或DNA 链断裂，通过切除损伤 部位并合成新的DNA片 段进行修复。
重组修复
在DNA双链断裂等严重 损伤情况下，通过DNA 重组机制进行修复，涉 及同源序列的搜索和交 换。
13
DNA重组的方式与意义
同源重组
发生在同源序列之间的重组，通过交 换DNA片段实现遗传信息的重新组合
6
02
基因与基因组
2024/1/30
7
基因的概念与结构
01 基因的定义
基因是遗传信息的基本单位，控制生物性状的遗 传。
02 基因的结构
基因由编码区和非编码区组成，编码区包括外显 子和内含子。
03 基因的遗传效应
基因通过控制蛋白质的合成来控制生物的性状。
2024/1/30
8
基因组的组成与特点
01 基因组的定义
基因表达的调控方式
基因表达受到多种因素的调控，包括 转录因子、表观遗传学修饰、 microRNA等。
2024/1/30
10
03
DNA复制、修复与重组
2024/1/30
11
DNA复制的过程与特点
1
DNA复制的过程
起始、延伸和终止三个阶段，涉及多种酶和蛋白 质的参与，确保DNA的准确复制。
2 3
DNA复制的特点
结合分子生物学指标，对 药物疗效进行评估，为新 药研发和临床应用提供依 据。
29
分子生物学技术在个体化医疗中的应用
基因检测
通过基因检测分析个体基 因组信息，为个体化医疗 提供基础数据。
2024/1/30
个体化用药指导
根据基因检测结果和药物 代谢特点，为患者提供个 体化用药建议，提高药物 治疗效果。
分子生物学 PPT课件
• 使细胞生物学、遗传学、发育生物学、神经 生物学和生态学由原来的经典学科变成了生命科 学的真正前沿科学，形成了一系列交叉学科，如 分子遗传学、分子生态学、分子免疫学、分子病 毒学、分子病理学、分子肿瘤学和分子药理学等。 分子生物学是生命科学的核心前沿。
• 不同种属生物的表现形式多种多样和千姿百 态，但是，生命活动的本质却是高度一致的。例 如绝大多数生物遗传取决于DNA；除少数例外， 遗传密码在整个生命世界中都是一致的。又如核 酸一级结构和蛋白质一级结构的对应关系以及蛋 白质的有序合成，也表现出高度一致性。
• （五）小分子RNA研究进展
• 1993年，Lee RC等发现线虫(C.elegans) lin-4基 因编码的小分子RNA，其长度为22～61个核苷 酸——反义RNA。
• 反义RNA能与lin-14 mRNA的3ˊ非翻译区 （untranslated region，UTR）反义互补结合，阻 断lin-14的翻译，降低线虫早期发育阶段lin-14 蛋白的水平。
• 因此，分子生物学技术已成为推动生物 科学的各个领域向分子水平发展的重要 工具或手段，也是服务于人类和社会， 推动医药和工、农业发展的强大动力。
二、分子生物学的研究内容
• 分子生物学的研究内容主要包括以下三个方面。 • 1、核酸分子生物学： • 主要研究核酸的结构及其功能。 • 2、蛋白质分子生物学：
• 例如DNA及RNA的印迹转移、核酸分子杂 交、DNA克隆或重组DNA、基因体外扩增、 DNA 测序等等，以及研究蛋白质一级结构、 二级结构和三维结构与功能的分析技术。
• 其中重组DNA(recombinant DNA)技术是现代分 子生物学技术的核心。
• 重组DNA技术又称为基因操作(gene manipulation )、分子克隆(molecular cloning)、基 因克隆(gene cloning) 或基因工程（gene engineering）等。
分子生物学(共19张PPT)
04
蛋白质的结构与功能
蛋白质的分子组成与结构
氨基酸通过肽键连 接形成多肽链，即 蛋白质的一级结构 。
多条多肽链组合在 一起，形成蛋白质 的三级结构。
蛋白质的基本组成 单位是氨基酸，共 有20种常见氨基酸 。
多肽链经过盘绕、 折叠形成二级结构 ，主要形式包括α螺旋和β-折叠等。
在特定条件下，蛋 白质可形成四级结 构，由多个亚基组 成。
发展历程
从20世纪50年代DNA双螺旋结构 的发现开始，分子生物学经历了 飞速的发展，成为现代生命科学 中最为活跃和前沿的领域之一。
分子生物学的研究对象与任务
研究对象
主要包括DNA、RNA、蛋白质Байду номын сангаас生 物大分子，以及它们之间的相互作用 和调控机制。
研究任务
揭示生物大分子的结构、功能及其相 互作用机制；阐明基因表达调控的分 子机制；探索生物大分子在生命过程 中的作用和意义。
转录因子
01
真核生物中存在大量转录因子，它们与DNA特定序列结合，激
活或抑制基因转录。
表观遗传学调控
02
通过DNA甲基化、组蛋白修饰等方式，改变染色质结构，影响
基因表达。
microRNA调控
03
microRNA是一类小分子RNA，通过与mRNA结合，抑制其翻
译或促进其降解，从而调节基因表达。
基因表达调控的分子机制
发育生物学研究生物体的发育过程，而分子 生物学则揭示了发育过程中基因表达和调控 的分子机制。
02
DNA的结构与功能
DNA的分子组成与结构
DNA的基本组成单位
脱氧核糖核苷酸，由磷酸、脱氧核糖 和碱基组成。
DNA的碱基
DNA的双螺旋结构
《分子生物学》课件
介绍CRISPR-Cas9系统的原理 及在基因编辑中的应用。
基因编辑实验室
展示现代基因编辑实验室的设 备和技术。
基因治疗
探讨基因编辑技术在治疗遗传 病和癌症中的潜力。
生物信息学与计算生物学
大数据分析
使用生物信息学和计算生物学的工具来分析 海量生物数据。
蛋白质结构预测
通过模拟和计算来预测和研究蛋白质的结构 和功能。
3 基因修复与修复机
制
探讨基因损伤修复和细 胞保护机制在环境暴露 中的作用。
生物多样性与保护
生物多样性
解释生物多样性的重要性和全球生物多样性状 况。
保护生物多样性
讨论保护生物多样性的 分子标记物
液体活检
通过PCR和测序技术检测基因突变和遗传病。
《分子生物学》PPT课件
《分子生物学》PPT课件大纲： 1. 介绍分子生物学概念 2. DNA和RNA结构与功能 3. 蛋白质的合成与结构 4. DNA复制和细胞分裂 5. 基因表达与转录 6. RNA加工修饰 7. 蛋白质翻译和折叠 8. 基因调控及表观遗传学
基因编辑与CRISPR技术
CRISPR Cas9
介绍分子标记物在疾病诊断和治疗中的应用， 如肿瘤标志物。
探讨液体活检在肿瘤诊断和监测中的潜力。
分子生物学的社会影响
1 伦理和法律问题
讨论基因编辑和遗传修 复等技术引发的伦理和 法律问题。
2 公众教育和意识
强调公众了解分子生物 学的重要性和科学素养 的培养。
3 医疗与健康
探讨分子生物学在医疗 和健康领域的革命性发 展。
基因组学研究
利用计算方法研究基因组结构、功能和进化。
网络生物学
通过构建和分析生物网络来揭示生物体内的 复杂关系。
基因编辑实验室
展示现代基因编辑实验室的设 备和技术。
基因治疗
探讨基因编辑技术在治疗遗传 病和癌症中的潜力。
生物信息学与计算生物学
大数据分析
使用生物信息学和计算生物学的工具来分析 海量生物数据。
蛋白质结构预测
通过模拟和计算来预测和研究蛋白质的结构 和功能。
3 基因修复与修复机
制
探讨基因损伤修复和细 胞保护机制在环境暴露 中的作用。
生物多样性与保护
生物多样性
解释生物多样性的重要性和全球生物多样性状 况。
保护生物多样性
讨论保护生物多样性的 分子标记物
液体活检
通过PCR和测序技术检测基因突变和遗传病。
《分子生物学》PPT课件
《分子生物学》PPT课件大纲： 1. 介绍分子生物学概念 2. DNA和RNA结构与功能 3. 蛋白质的合成与结构 4. DNA复制和细胞分裂 5. 基因表达与转录 6. RNA加工修饰 7. 蛋白质翻译和折叠 8. 基因调控及表观遗传学
基因编辑与CRISPR技术
CRISPR Cas9
介绍分子标记物在疾病诊断和治疗中的应用， 如肿瘤标志物。
探讨液体活检在肿瘤诊断和监测中的潜力。
分子生物学的社会影响
1 伦理和法律问题
讨论基因编辑和遗传修 复等技术引发的伦理和 法律问题。
2 公众教育和意识
强调公众了解分子生物 学的重要性和科学素养 的培养。
3 医疗与健康
探讨分子生物学在医疗 和健康领域的革命性发 展。
基因组学研究
利用计算方法研究基因组结构、功能和进化。
网络生物学
通过构建和分析生物网络来揭示生物体内的 复杂关系。
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第五章
分子生物学研究方法（上）
.
1
本章主要内容
常见的DNA操作技术 基因克隆技术简介 蛋白质组学及研究技术
.
2
引言
➢ 重组DNA技术发展史上的重大事件
(1) 40年代，解决了遗传的物质基础问题。确定了
遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白 质。
(2)50年代，解决了基因的自我复制和世代交替问 题。建立了DNA分子的双螺旋结构模型，提出了半保留
从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。
.
4
➢ 基因工程的主要内容或步骤
“分---切---连---转---筛”
（1）从基因组中分离、或PCR扩增、或人工合成带有目的 基因的DNA片段。 （2）用适当的限制酶分别切割适当的载体分子和含有目的 基因的DNA分子。 （3）将目的基因连接到载体分子上，形成重组DNA分子。 （4）将重组DNA分子转移到适当的受体细胞中并增殖。 （5）筛选重组转化子，扩增目的基因。再将目的基因克隆 到表达载体上，导入受体细胞，使表达目的产物。
.
14
➢ 放射性的衰变类型 α-射线：带正电荷的高速粒子流 β-射线：带负电荷的粒子流 γ-射线：光子流
➢ 分子生物学研究中常用的放射性同位素及其性质
元素名称 半衰期 12.1年 5700年 14.3天 87.1天 5.8年
147N + 10n → 146C + 11H 146C → 147N + 0-1e 23892U → 20682Pb + 842He + 60-1e
分离DNA片段的大小范围（bp） 50 000~1 000 20 000~1 000 6 000~300 1 000~100 500~25 50~1
凝胶的分辨能力同凝胶类型和浓度有关，凝胶
浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，
孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，
孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。
末端转移酶
在双链核酸的3ˊ末端加上多聚单核苷酸
DNA外切酶III
从DNA链的3ˊ末端逐个切除单核苷酸
λ噬菌体DNA外切酶
从DNA链的5ˊ末端逐个切除单核苷酸
碱性磷酸酯酶
切除位于DNA链5ˊ或3ˊ末端的磷酸基团
科学家已几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段， 再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分. 子量大小逐一分开，以供下一步研7究。
.
12
1.2 转基因方法
1.2.1 细菌转基因的方法 (1)结合（conjugation） (2)转化（transformation）(常规转化、电转化等) (3)转染（transfection） (4)转导（transduction）
1.2.2 动物转基因的方法 (1)显微注射法：包括细胞核内和细胞质内注射。 (2)电导转基因法 (3)逆转录病毒介导法 (4)胚胎干细胞介导法 (5)精子载体法
用途：鉴定重组DNA分子 蛋白质与核酸相互作用 DNA分型 DNA核苷酸序列分析 限制酶酶切片段分析 限制酶酶切作图
.
9
➢ 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2 - 50kb之间
.
10
➢ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶分辨范.围为1-1000个碱基对 11
凝胶类型及浓度 0.3%琼脂糖 0.7%琼脂糖 1.4%琼脂糖 4.0%聚丙烯酰胺 10.0%聚丙烯酰胺 20.0%聚丙烯酰胺
1 DNA操作技术
• DNA分子的切割与连接 • 核酸分子杂交 • 凝胶电泳 • 细胞转化 • 核酸序列分析 • 基因的人工合成 • 基因的定点突变 • PCR扩增 • 基因敲除
.
8
1.1 核酸的凝胶电泳
原理： 种类：琼脂糖（agarose）凝胶电泳；
聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶电泳
1.2.3 植物转基因的方法
(1)Ti质粒介导
(2)电转化法
(3)基因枪法
.
13
1.3 核酸的分子杂交
1.3.1 放射性同位素技术
同位素：原子序数相同而质量不同的元素。
➢ 放射性同位素 同位素可分为稳定同位素和不稳 定同位素，后者又称为放射性同位素。不稳定同位 素原子核结构不稳定，易自发产生衰变，产生α射线、β-射线和γ-射线等，同时从不稳定同位素 变成稳定同位素。在分子生物学研究中，得到应用 的是放射性同位素。
.
17
1.3.2 分子杂交类型
根据鉴定对象不同，可将分子杂交法分为3种类型：
Southern杂交由E.M.Southern于1从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，
然后与核酸探针进行杂交。
Northern杂交：将RNA分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，
识别并在特定位点切开DNA 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子
DNA聚合酶I（大肠杆菌） 按5ˊ到3ˊ方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口
反转录酶
按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链
多核苷酸激酶
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5ˊ-OH末端（进行末端标 记实验或用来进行DNA的连接
.
5
基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具 有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因 置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的 能力。
1962年Arber 发现限制性核酸内切酶， 1967年Gellert发现了 DNA 连接酶。
.
6
酶类
重组DNA实验中常见的主要工具酶
功能
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
.
(t1/2 = 4.5×109a)
15
➢ 放射性强度的探测
（1）盖革计数器（Geiger counter tuber）， 闪烁计数器。
（2）放射自显影：X-光乳胶片覆盖于样品，在 黑暗中，-70℃，曝光。
➢ 放射性分子的制备：核物理，化学，生化反应， 生化分离技术
.
16
➢ 核酸分子的放射性同位素标记应用举例 利用切口平移技术制备DNA放射性探针
复制机制。
(3)50年代末至60年代，相继提出了“中心法则” 和操纵子学说, 成功地破译了遗传密码，充分认 识了遗传信息的流动和表达途径。
.
3
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
分子生物学研究方法（上）
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1
本章主要内容
常见的DNA操作技术 基因克隆技术简介 蛋白质组学及研究技术
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2
引言
➢ 重组DNA技术发展史上的重大事件
(1) 40年代，解决了遗传的物质基础问题。确定了
遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白 质。
(2)50年代，解决了基因的自我复制和世代交替问 题。建立了DNA分子的双螺旋结构模型，提出了半保留
从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。
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4
➢ 基因工程的主要内容或步骤
“分---切---连---转---筛”
（1）从基因组中分离、或PCR扩增、或人工合成带有目的 基因的DNA片段。 （2）用适当的限制酶分别切割适当的载体分子和含有目的 基因的DNA分子。 （3）将目的基因连接到载体分子上，形成重组DNA分子。 （4）将重组DNA分子转移到适当的受体细胞中并增殖。 （5）筛选重组转化子，扩增目的基因。再将目的基因克隆 到表达载体上，导入受体细胞，使表达目的产物。
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➢ 放射性的衰变类型 α-射线：带正电荷的高速粒子流 β-射线：带负电荷的粒子流 γ-射线：光子流
➢ 分子生物学研究中常用的放射性同位素及其性质
元素名称 半衰期 12.1年 5700年 14.3天 87.1天 5.8年
147N + 10n → 146C + 11H 146C → 147N + 0-1e 23892U → 20682Pb + 842He + 60-1e
分离DNA片段的大小范围（bp） 50 000~1 000 20 000~1 000 6 000~300 1 000~100 500~25 50~1
凝胶的分辨能力同凝胶类型和浓度有关，凝胶
浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，
孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，
孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。
末端转移酶
在双链核酸的3ˊ末端加上多聚单核苷酸
DNA外切酶III
从DNA链的3ˊ末端逐个切除单核苷酸
λ噬菌体DNA外切酶
从DNA链的5ˊ末端逐个切除单核苷酸
碱性磷酸酯酶
切除位于DNA链5ˊ或3ˊ末端的磷酸基团
科学家已几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段， 再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分. 子量大小逐一分开，以供下一步研7究。
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1.2 转基因方法
1.2.1 细菌转基因的方法 (1)结合（conjugation） (2)转化（transformation）(常规转化、电转化等) (3)转染（transfection） (4)转导（transduction）
1.2.2 动物转基因的方法 (1)显微注射法：包括细胞核内和细胞质内注射。 (2)电导转基因法 (3)逆转录病毒介导法 (4)胚胎干细胞介导法 (5)精子载体法
用途：鉴定重组DNA分子 蛋白质与核酸相互作用 DNA分型 DNA核苷酸序列分析 限制酶酶切片段分析 限制酶酶切作图
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➢ 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2 - 50kb之间
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➢ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶分辨范.围为1-1000个碱基对 11
凝胶类型及浓度 0.3%琼脂糖 0.7%琼脂糖 1.4%琼脂糖 4.0%聚丙烯酰胺 10.0%聚丙烯酰胺 20.0%聚丙烯酰胺
1 DNA操作技术
• DNA分子的切割与连接 • 核酸分子杂交 • 凝胶电泳 • 细胞转化 • 核酸序列分析 • 基因的人工合成 • 基因的定点突变 • PCR扩增 • 基因敲除
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1.1 核酸的凝胶电泳
原理： 种类：琼脂糖（agarose）凝胶电泳；
聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶电泳
1.2.3 植物转基因的方法
(1)Ti质粒介导
(2)电转化法
(3)基因枪法
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1.3 核酸的分子杂交
1.3.1 放射性同位素技术
同位素：原子序数相同而质量不同的元素。
➢ 放射性同位素 同位素可分为稳定同位素和不稳 定同位素，后者又称为放射性同位素。不稳定同位 素原子核结构不稳定，易自发产生衰变，产生α射线、β-射线和γ-射线等，同时从不稳定同位素 变成稳定同位素。在分子生物学研究中，得到应用 的是放射性同位素。
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1.3.2 分子杂交类型
根据鉴定对象不同，可将分子杂交法分为3种类型：
Southern杂交由E.M.Southern于1从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，
然后与核酸探针进行杂交。
Northern杂交：将RNA分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，
识别并在特定位点切开DNA 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子
DNA聚合酶I（大肠杆菌） 按5ˊ到3ˊ方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口
反转录酶
按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链
多核苷酸激酶
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5ˊ-OH末端（进行末端标 记实验或用来进行DNA的连接
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基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具 有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因 置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的 能力。
1962年Arber 发现限制性核酸内切酶， 1967年Gellert发现了 DNA 连接酶。
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酶类
重组DNA实验中常见的主要工具酶
功能
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
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(t1/2 = 4.5×109a)
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➢ 放射性强度的探测
（1）盖革计数器（Geiger counter tuber）， 闪烁计数器。
（2）放射自显影：X-光乳胶片覆盖于样品，在 黑暗中，-70℃，曝光。
➢ 放射性分子的制备：核物理，化学，生化反应， 生化分离技术
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➢ 核酸分子的放射性同位素标记应用举例 利用切口平移技术制备DNA放射性探针
复制机制。
(3)50年代末至60年代，相继提出了“中心法则” 和操纵子学说, 成功地破译了遗传密码，充分认 识了遗传信息的流动和表达途径。
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1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。