Biacore应用交流-中国科学院生物物理研究所 蛋白质科学研究平台
BiaCore基本原理
离下来的分析物量
再生
• 将和配体结合的分析物分子从芯片表面彻底除去 • 必须保持芯片表面的活性
Biacore Training
传感图（The Sensorgram）
Biacore Training
Biacore Training
总结 • Biacore 技术组成
5acoretrainingspr检测spr是一种折射率传感器测量结果依赖于表面分子的浓度和环境温度spr响应值表示了共振角度的改变大致上对于cm5芯片和蛋白质的结合而言1ru的响应值等价于芯片表面结合物质的浓度改变了1pgmm2biacoretraining微射流卡盘ifc液体传送装置迷你化的组件试剂消耗量低完整的全自动液体处理装置ifc液体通道液体通道flowcells展开图biacoretraining微射流卡盘液体通道flowcells不同的biacore仪器其ifc的液体通道的类型和数量有所不同
» 传感图（The sensorgram）
SPR 生物传感技术的应用领域 • 生物大分子的相互作用
Biacore Training
SSppeecciiffiicciittyy
KKiinneettiiccss
AAffffiinniittyy
CCoonncceennttrraattiioonn
How Specific...
SPR技术的主要构成部分
SPR 检测系统
Biacore Training
传感芯片
IFC微射流卡盘
SPR 检测系统
Biacore Training 质量改变 结合过程
解离过程
光学组件
光源 时间
偏振光
biacore曲线
biacore曲线引言概述：Biacore曲线是一种常用的生物传感技术，用于研究分子间的相互作用。
该技术通过测量分子间的亲和力和动力学参数，为研究蛋白质、抗体和药物等生物分子的相互作用提供了重要的工具。
本文将从三个大点出发，详细阐述Biacore曲线的原理、应用以及优势。
正文内容：1. 原理1.1 表面等离子共振Biacore曲线基于表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）现象。
当光线入射到金属薄膜表面时，与金属表面的电子发生共振，形成表面等离子波。
当有分子吸附到金属薄膜表面时，会改变表面等离子波的传播情况，从而引起光的反射角发生变化。
通过测量反射光的角度变化，可以得到分子与金属表面的相互作用信息。
1.2 生物分子相互作用Biacore曲线利用SPR技术测量生物分子相互作用的动力学参数，如关联（association）和解离（dissociation）速率常数，平衡常数等。
通过将一个分子固定在芯片表面，另一个分子流经芯片表面，可以实时监测两者之间的相互作用。
这种实时监测的优势使得Biacore曲线成为研究分子间亲和力的重要工具。
1.3 曲线分析Biacore曲线的分析通常包括两个步骤：曲线拟合和数据解读。
曲线拟合可以通过不同的模型来实现，常见的模型有Langmuir模型和双指数模型等。
数据解读可以通过计算得到的动力学参数来评估分子间的亲和力和解离速率。
这些参数对于研究药物的相互作用、蛋白质结构和功能等方面具有重要意义。
2. 应用2.1 药物筛选Biacore曲线可以用于药物筛选的初步评估。
通过测量药物与靶蛋白之间的亲和力和动力学参数，可以评估药物的结合能力和稳定性。
这对于药物研发过程中的候选药物筛选和优化具有重要意义。
2.2 抗体研究Biacore曲线广泛应用于抗体研究领域。
通过测量抗体与抗原之间的亲和力和解离速率，可以评估抗体的结合能力和亲和力。
这对于抗体的筛选、优化以及疾病治疗方案的设计具有重要意义。
Biacore_检测蛋白与蛋白相互作用
Biacore_检测蛋白与蛋白相互作用蛋白是生物功能的主要体现者，蛋白的表达水平、活性强弱和相互作用等与生物学功能密切相关，如复制转录、信号转导、新陈代谢、抗体药物等，错误的蛋白相互作用会引起紊乱和疾病。
因此，蛋白的相互作用分析成为目前生物大分子研究中必不可少的重要手段。
蛋白-蛋白相互作用分析方法有很多，比如ELISA、CoIP、FRET、Y2H等，但这些方法往往受到需要标记、检测灵敏度低、假阳性高、无法定量等限制。
以Biacore为代表的表面等离子体共振（SPR）技术，无需对分子进行标记，能够实时观测微量、灵敏、快速、动态的定量表征结合过程，为正确全面地判定分子间相互作用提供可靠的数据支持！Biacore在蛋白-蛋白相互作用领域的研究涉及到科学研究的很多方面，比如：（1）结构生物学（2）病毒入侵机制（3）植物调控的分子机理，抗逆机制（4）转录因子（5）食品含量测量（6）疾病的分子机理研究等接下来以BiacoreT200仪器为例，解析蛋白与蛋白互作实验操作流程。
Biacore T200 检测蛋白与蛋白结合操作指南实验前准备· S 系列 CM5 芯片，货号：29-1049-88 ( 一片装 )、BR-1005-30 ( 三片装 )、29-1496-03 ( 十片装 )，( 注：每张芯片若一次性使用，可检测三对不同的互作，若再生后重复使用，只要蛋白一直有活性，就可一直使用 )。
·氨基偶联试剂盒( 货号：BR-1000-50),( 注：里面的EDC 和NHS，溶解后，200ul 每管分装，-20℃冻存，后续实验前，各取一管融化后使用即可 )。
·偶联 Buffer：10mM 醋酸钠 pH4.0 ( 货号：BR-1003-49 )，或10mM 醋酸钠 pH4.5 ( 货号：BR-1003-50 )。
·缓冲液：10 x HBS-EP+ ( 货号：BR-1006-69 )，用去离子水稀释10 倍，配置500 mL，置于T200 系统左侧托架上，将缓冲液进液管 A 插入瓶中。
BiacoreT200SPR详细操作流程-2亲和力及动力学测定和数据分析
BiacoreT200SPR详细操作流程-2亲和⼒及动⼒学测定和数据分析3) 在setup 对话框中，设置Startup 。
在运⾏正式样品前，通常都会运⾏若⼲Startup 循环，⽬的是让系统在开始阶段模拟运⾏样品，以达到稳定的基线和系统状态。
因此此时的样品⼀般都⽤缓冲液替代分析物样品。
在solution 中输⼊Buffer ，Number of Cycles 设为3（通常为3-5次）。
点击Next，进⼊下⼀步。
四测定亲和⼒和动⼒学（多循环）在这章节中，我们将应⽤向导程序设置多循环实验，完成亲和⼒和动⼒学数据的检测。
同时，我们也将介绍如何分析所得到的实验数据。
在第2章中，我们已经在芯⽚上偶联了配体（β2-microglobulin 抗体）。
在第3章中，我们确定了分析物（β2-microglobulin ）的浓度范围和再⽣试剂条件。
在这章节中，我们将会检测配体和分析物的亲和⼒和动⼒学。
4.1设置多循环动⼒学1) 打开New Wizard Template ，在Assay 中选择Kinetics/Affinity ，点击New 。
2) 在Injection Sequence 对话框中，Flow path 选择2-1，Chip type 选择CM5，点击Next ，进⼊下⼀步。
4) 在Injection Parameters对话框中，设置进样、解离和再⽣的相关参数。
在Sample中，Contact time是指分析物的进样时间，通常为1-5分钟，本次实验设为180s。
亲和⼒实验的Flow rate必须⼤于30µl/min，此处设为30µl/min。
Dissociation time是指解离时间，需根据样品的情况设置，此处设为300s。
在Regeneration中，Solution输⼊regeneration scouting结果中确认的再⽣试剂条件，Glycine-HCl 2.5。
biacore 分子互作技术
biacore 分子互作技术BIACORE是当前广泛应用的实时生物分子互作技术平台，可用于研究生物大分子（蛋白质、核酸等）之间的相互作用，包括蛋白质与其配体、抗体与其抗原、细胞受体与配体等。
该技术基于表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）原理，可以实时、无标记、非抗体依赖地监测生物分子之间的相互作用变化，提供了一种高灵敏度、高时效性的生物分子互作分析手段。
本文将从技术原理、实验步骤、技术优势、应用前景等方面进行介绍。
一、技术原理BIACORE技术的原理基于SPR原理，即当激光光束经过从金属薄膜反射时，会在薄膜表面形成一个等离子体振荡层，也就是表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）。
当生物分子（蛋白质、核酸等）在薄膜表面上形成一个复合物时，复合物的质量和厚度影响了表面等离子体振荡层的共振角度和强度，从而导致反射光的强度和反射光的位移发生变化，并且这种变化与复合物的特异性、亲和力等参数相关。
因此，通过测量反射光的强度和反射光的位移变化来分析生物分子之间的相互作用，可以快速、准确地测定它们之间的亲和力、动力学参数等信息。
二、实验步骤BIACORE技术通常需要进行以下步骤：1、表面修饰：制备金属表面，并通过特定的方法进行表面修饰，例如使用一种特定的抗体或者配体。
2、样品注入：待测试的生物分子样品或蛋白质样品通过注射器注入到BIACORE探头的药物集合器内，然后直接进入芯片表面进行检测。
3、实时监测：检测过程需要实时监测反射光的强度和反射光的位移变化，用于分析样品与表面受体之间的结合变化。
4、数据分析：通过数据分析软件，对实验数据进行分析解释，获得生物分子之间相互作用的动力学参数、亲和力等信息。
三、技术优势1、实时监测：该技术能够实时监测分子相互作用过程，避免了传统生化方法（如放射标记法、酶联免疫吸附法等）中间的间歇步骤，从而获得更加准确的结果。
蛋白质研究技术平台
详细描述
生物标志物是生物体内与疾病或生理状态相 关的蛋白质或其代谢产物，通过蛋白质组学 技术可以发现新的生物标志物，并通过验证 实验确认其在临床实践中的价值。例如，在 糖尿病研究中，可以找到与糖尿病相关的生 物标志物，用于监测血糖控制情况、评估糖 尿病并发症的风险以及指导治疗方案的选择
。
06
技术平台的挑战与展望
VS
详细描述
蛋白质组学技术可以对大量蛋白质进行高 通量、高灵敏度的检测和分析，通过比较 正常和疾病状态下的蛋白质表达谱，发现 与疾病相关的差异表达蛋白质，进而揭示 疾病发生发展的分子机制。例如，在癌症 研究中，可以找到癌症特异的蛋白质标志 物，用于癌症的早期诊断和预后评估。
药物靶点筛选
总结词
药物靶点筛选是技术平台的另一重要应用，通过蛋白质组学技术，可以高效地发现和验证药物作用的靶点，为新 药研发提供关键的候选药物分子。
特点
蛋白质研究技术平台具有高度的专业 性、技术性和系统性，涵盖了蛋白质 组学、生物化学、分子生物学等多个 领域的知识和技术。
技术平台的重要性
生命科学研究的基础
生物技术的核心
蛋白质是生命活动的主要承担者，对 蛋白质的研究是深入了解生命过程和 疾病机制的基础。
蛋白质研究技术平台在生物技术的多 个领域，如基因工程、细胞工程、酶 工程等中发挥着核心作用。
凝胶电泳技术
聚丙烯酰胺凝胶电泳
01
根据蛋白质的电荷和分子量进行分离，分辨率高，常用于精细
的蛋白质分离。
琼脂糖凝胶电泳
02
根据蛋白质的电荷和分子量进行分离，操作简便，常用于初步
分离和鉴定蛋白质。
双向凝胶电泳
03
结合等电聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，可对蛋白质进行高
生物大分子相互作用分析
四、BIAcore的一般分析流程
2. pH值选择（pH Scouting）
A 目的 使配体与芯片表面接近
B 如何选择合适的pH值？ 选择在pKa和蛋白质pI之间的某一pH值，用此pH值的NaAC稀释配体。
C 判断pH值合适的依据
四、BIAcore的一般分析流程
BIAcore C
BIAcore 3000
BIAcore Flexchip
BIAcore A100
BIAcore X100
BIAcore T100
二、BIAcore简介和工作原理
4. 其他品牌的分子互作分析仪
二、BIAcore简介和工作原理
5. BIAcore3000组件
光路和检测系统
IFC系统 芯片及卡盘
一、生物分子相互作用的研究
3. 大分子互作研究方法
A 酵母双杂交系统（THS） B 化学发光共振能量转移（BRET） C 双分子荧光互补（BIFC） D 生物分子相互作用分析（BIA） E 蛋白芯片（PC）
二、BIAcore简介和工作原理
1. BIA定义
BIA：Biomolecular Interaction Analysis 生物分子相互作用分析
三、BIAcore的应用领域
1. 免疫学检测、生化分析
2. 药物发现和筛选
3. 核酸/核酸、核酸/蛋白互作分析
4. 蛋白质分析和蛋白质组学
三、BIAcore的应用领域
1. 免疫学检测、生化分析
A 抗原识别、抗原决定簇 代替放射性免疫检测和ELISA
B 抗原抗体结合常数测定 T细胞识别抗原是免疫学研究的重点，分析抗原抗体结合常
4. 进样分析（Sample Injection）
biacore配体偶联水平计算
在生物医学领域中，生物分子相互作用的研究是非常重要的。
而对于生物分子相互作用的研究中，biacore配体偶联水平的计算是一个关键的步骤。
本文将从浅入深地探讨biacore配体偶联水平计算的主题，帮助您更深入地理解这一概念。
1. 什么是biacore配体偶联水平计算？在生物医学研究中，biacore是一种常用的生物分子相互作用分析仪器。
而配体偶联水平计算则是指在biacore上对配体与受体的结合强度进行定量分析和计算。
这一步骤可以帮助研究人员更好地理解生物分子间的相互作用，从而为药物研发和生物医学研究提供重要参考。
2. biacore配体偶联水平计算的重要性配体偶联水平计算是生物医学研究中的关键一环。
通过这一计算，研究人员可以了解配体与受体之间的相互作用强度，从而评估药物的疗效和安全性，优化药物研发过程。
配体偶联水平计算也能够帮助科研人员深入理解生物分子的结构与功能，为疾病治疗和病理机制研究提供重要数据支持。
3. biacore配体偶联水平计算的原理在biacore配体偶联水平计算中，主要依靠表面等离子体共振技术(SPR)。
通过SPR技术，可以实时监测配体与受体在生物芯片表面的结合情况，并通过计算得出它们之间的结合亲和力、速率常数等参数。
这些参数的计算可以帮助研究人员全面评估生物分子的相互作用情况，为进一步研究和应用提供有效数据支持。
4. biacore配体偶联水平计算的进展和挑战随着生物技术和分析仪器的不断发展，biacore配体偶联水平计算在生物医学领域的应用也得到了广泛的推广。
然而，由于生物分子结合过程的复杂性和多样性，配体偶联水平计算中还存在一些挑战，如对大分子复合物的计算、数据的准确性和标准化等方面的问题。
未来还需要进一步完善技术和方法，以提高配体偶联水平计算的准确性和应用价值。
5. 个人观点与总结biacore配体偶联水平计算在生物医学研究中具有重要意义。
通过全面评估配体与受体的结合情况，可以为药物研发和生物医学研究提供重要参考。
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Ligand surface
• High density ligand weakened serum binding background
Binding level，regeneration
5. 解离慢的互作可以采用三倍稀释
6. Biacore 3000和T100数据的一致性
仪器 Biacore3000 BiacoreT100
0 2 4 6 ug/ml 8 10 12 14 16
200 0
测定小鼠血清中针对某种抗原的抗体浓度， 建立标准曲线时发现购买的样品有问题。
2. 寻找好的再生条件有利实验的重复性 和稳定性
Yang X, et al. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2014
Gong Y, et al. Nat Struct Mol Biol. 2011
6. 其它技术有一定局限性：亲和力太强， 超过了ITC测量的最佳范围
Ding J, et al. J Biol Chem. 2012
ITC测定的亲和力为1.6 nM，是ITC技术直接测定 亲和力的极限！
Biacore适合测定nM级亲和力，并得到动力 学数据，了解互作的动力学过程
KD = 4.83 Χ10-8 M
原因:逐项排除，最后发现是缓
冲体系的问题，pH出错。 重新制备缓冲液后验证。
100
200 Tim e
300
400
500 s
4. 浓度测定时可以不用对照通道
Gly-HCl
Negative serum
Gly-HCl
Negative serum
Blank surface
实验操作和样品准备是完全独立的，亲和力完全一致。
总结
Biacore技术：发现相互作用
确定相互作用 定量相互作用 浓度测定 准备工作非常重要：样品准备和文献调研 实验者最好全程参与Biacore实验
谢 谢！
ca p tu ring m ole c ule
Response
lig a n d
-100
0
100
200 Tim e
300
400
500 s
Streptavidin-biotin, PBST, 12.5-250 nM
RU
Anti-human IgG, HEPES
亲和力相差40倍！
Response
70 60 50 40 30 20 10 0 -10 -100 0
3. 实验样品和缓冲液的认真准备
采用两种捕获方式测定某一人源抗体与抗原的亲和力
RU 120
KD = 3.35×10-8 M
RU 180 130 80 30 -20
KD = 8.31×10-10 M
a na lyte
Response
100 80 60 40 20 0 -20 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Tim e s
SPR实验证明：
4. 获得复合物结构后，通过Biacore实验 找出作用面上的关键氨基酸残基
Zhang Z, et al. Mol Microbiol. 2010
5. 样品是混合物，测定某种生物分子的 活性浓度
标准曲线
检测细胞培养上清中抗体 的活性浓度
6. 其它技术有一定局限性：快结合快解离 EMSA技术很难测出来
ka (M-1s-1) 2.38×106 2.401×106
kd (s-1) 1.63×10-3 1.651×10-3
KD (M) 6.87×10-10 6.878×10-10
Rmax（RU） 33.4 16.54
Capture level: 152 RU for 3000 and 69.2 RU for T100. Regeneration: 15-s pulse of 20 mM HCl. Kinetic assay: concentrations: 0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 0, 5 nM. injection time: 90 s; dissociation time: 180 s; flow: 40 µ l/min.
Biacore应用交流
陈 媛 媛 中国科学院生物物理研究所 蛋白质科学研究平台 2015.4.16
主要内容
案例分享：Biacore技术提供了哪些重要信息。
实验体会：如何得到理想的Biacore数据。
使用的仪器
Biacore 3000 （2005年启用）
Biacore T100 （2010年启用）
ka
kd
表面等离子共振技术(SPR) 分子间互作的动力学分析 KD = kd/ka
案例分享
1. 通过Biacore技术确定新的调节细菌趋 化性的方式
Li R, et al. Mol Microbiol. 2010
2. 获得重要蛋白复合物结构，补充生化 实验
Gong Y, et al. Nature, 2008
Biacore实验体会
1. 样品的活性和均一性是最重要的！
RU 250 200 150
7.8-500ug/ml
100 80 60 40 20 0
25 75 125 Time 175 225 s
7.8-500ug/m l
Response
100 50 0 -50
RelResp
Bad ligand
0 100 200 Conc 300 400 500
3. 搭建结构到功能的桥梁
Li X, et al. J Biol Chem. 2006
蛋白的生理功能是通过相互作用实现的，得到单一蛋白结构后，通过Biacore实验， 分析互作机制，将结构和功能联系起来，扩展文章的深度。
3. 搭建结构到功能的桥梁
Wang D, et al. Nat Immunol, 2010
0.01-16ug/m l
RU 2000 1500 1000
0.01-16ug/m l
1800 1600 1400 1200
Response
RelResp
1000 800 600
500 0
400
-500 -1000 50 100 150 Time 200 250 300 350 s
Good ligand