高效液相色谱原理 硬件及常见问题解决方法
高效液相色谱常见问题与解决方法汇总
高效液相色谱常见问题与解决方法汇总一压力异常操作压力的变化往往是故障的征兆。
从下表中找出所观察到的现象，并在右侧的列表中参考相应的解决方法。
A、没有压力显示，没有流动相流动B、流动相流动正常，但没有压力显示C、压力持续偏高D、压力持续偏低E、压力不断上升F、压力降为零G、压力不断下降，但不回零二漏液通常可以通过拧紧或更换管路接头来解决漏液的问题。
但值得注意的是过份拧紧会导致金属接头的漏液和塑料接头的磨损。
如果通过稍微拧紧接头不能解决漏液的问题，就必须将接头取下，检查是否损坏（例如，卡套损坏、密封表面有杂质）；损坏的接头应该更换掉。
A、接头处漏液B、泵漏液C、进样阀漏液D、色谱柱漏液筛板选择指导E、检测器漏液三液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。
其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决；而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。
对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。
A、峰拖尾B、峰前延C、峰分叉D、峰变形E、早出的峰变形F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰G、 K’增加时，脱尾更严重H、酸性或碱性化合物的峰拖尾I、额外的峰J、保留时间波动K、保留时间不断变化L、基线漂移M、基线噪音（规则的）N、基线噪音（不规则的）O、宽峰P、分离度降低Q、所有的峰面积都太小R、所有的峰面积都太大4 以下问题在使用进样阀过程中有可能发生。
A、手动进样阀，转动不灵B、手动进样阀，载样困难C、自动进样阀，不能转动D、自动进样阀，其它问题5、由气味、景象和声音可以发现的问题，你需要运用你所有的感官去发现液相色谱的问题。
你最好养成习惯，每天花上几分钟运用你的感官（除了味觉）来“感觉”你的液相色谱是否存在问题，这样可以帮助你迅速找到问题所在。
例如：在你看到漏液之前，你可能首先闻到它的气味。
大部分的问题是可以通过眼睛看到。
A、溶剂的气味B、热气味C、读数不正常D、灯警告E、警告音F、刺耳的短音或长音六、常见故障及日常维护下表中列出了液相色谱常见的一些问题，右侧中则列出的日常维护的方法可以减少问题出现的频率。
高效液相色谱仪使用中常见故障及解决方法 液相色谱常见问题解决方法
高效液相色谱仪使用中常见故障及解决方法液相色谱常见问题解决方法1 高效液相色谱仪系统液相色谱仪紧要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统构成。
对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的紧要部位。
2 常见问题及解决方法高效液相作为一种高精密仪器，假如在使用过程中不依照正确操作的话，就简单导致一些问题。
其中常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。
1.柱压问题柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要紧密注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分别效果及保留时间等紧密相关。
所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50PSI（3.3 Bar）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。
压力过高、过低都属于柱压问题。
压力过高：这是高效液相在使用中常见的问题，指的是压力蓦地上升，一般都是由于流路中有堵塞的原因。
此时，我们应当分段进行检查。
（1）.首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充分液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，假如液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。
处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。
假如液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查；（2）.打开Purge阀，使流动相不经过柱子，假如压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。
处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。
假如压力降至100PSI （6.7 Bar）以下，过滤白头正常，在检查；（3）.把色谱柱出口端取下，假如压力不下降，则是柱子堵塞。
处理方法：假如是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。
假如是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。
假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。
这时，假如柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很简单造成柱效下降，所以尽量少用。
高效液相色谱常见问题分析与对策
高效液相色谱常见问题分析与对策液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。
其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决；而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。
对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。
A、峰拖尾原因解决方法1、筛板阻塞a、反冲色谱柱b、更换进口筛板c、更换色谱柱2、色谱柱塌陷填充色谱柱3、干扰峰a、使用更长的色谱柱b、改变流动相或更换色谱柱4、流动相PH选择错误调整PH值。
对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰5、样品与填料表面的溶化点发生反应a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂b、更改色谱柱B、峰前延原因解决方法1、柱温低升高柱温2、样品溶剂选择不恰当使用流动相作为样品溶剂3、样品过载降低样品含量4、色谱柱损坏见A1、A2C、峰分叉原因解决方法1、保护柱或分析柱污染取下保护柱再进行分析。
如果必要更换保护柱。
如果分析柱阻塞，拆下来清洗。
如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。
如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。
2、样品溶剂不溶于流动相改变样品溶剂。
如果可能采取流动相作为样品溶剂。
D、峰变形原因解决方法1、样品过载减少样品载量E、早出的峰变形原因解决方法1、样品溶剂选择不恰当a、减少进样体积b、运用低极性样品溶剂F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰原因解决方法1、柱外效应a、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路）b、使用小体积的流通池G、K’增加时，脱尾更严重原因解决方法1、二级保留效应，反相模式a、加入三乙胺（或碱性样品）b、加入乙酸（或酸性样品）c、加入盐或缓冲剂（或离子化样品）d、更换一支柱子2、二级保留效应，正相模式a、加入三乙胺（或碱性样品）b、加入乙酸（或酸性样品）c、加入水（或多官能团化合物）d、试用另一种方法3、二级保留效应，离子对加入三乙胺（或碱性样品）H、酸性或碱性化合物的峰拖尾原因解决方法1、缓冲不合适a、使用浓度50-100mM的缓冲液b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液I、额外的峰原因解决方法1、样品中有其他组份正常2、前一次进样的洗脱峰a、增加运行时间或梯度斜率b、提高流速3、空位或鬼峰a、检查流动相是否纯净b、使用流动相作为样品溶剂c、减少进样体积J、保留时间波动原因解决方法1、温控不当调好柱温2、流动相组分变化防止变化（蒸发、反应等）3、色谱柱没有平衡在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱K、保留时间不断变化原因解决方法1、流速变化重新设定流速2、泵中有气泡从泵中除去气泡3、流动相选择不恰当a、更换合适的流动相b、选择合适的混合流动相L、基线漂移原因解决方法1、柱温波动。
高效液相色谱常见问题分析与对策
高效液相色谱常见问题分析与对策液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。
其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决；而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。
对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。
A、峰拖尾原因解决方法1、筛板阻塞a、反冲色谱柱b、更换进口筛板c、更换色谱柱2、色谱柱塌陷填充色谱柱3、干扰峰a、使用更长的色谱柱b、改变流动相或更换色谱柱4、流动相PH选择错误调整PH值。
对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰5、样品与填料表面的溶化点发生反应a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂b、更改色谱柱B、峰前延原因解决方法1、柱温低升高柱温2、样品溶剂选择不恰当使用流动相作为样品溶剂3、样品过载降低样品含量4、色谱柱损坏见A1、A2C、峰分叉原因解决方法1、保护柱或分析柱污染取下保护柱再进行分析。
如果必要更换保护柱。
如果分析柱阻塞，拆下来清洗。
如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。
如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。
2、样品溶剂不溶于流动相改变样品溶剂。
如果可能采取流动相作为样品溶剂。
D、峰变形原因解决方法1、样品过载减少样品载量E、早出的峰变形原因1、样品溶剂选择不恰当a、减少进样体积b、运用低极性样品溶剂F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰原因解决方法1、柱外效应a、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路）b、使用小体积的流通池G、K’增加时，脱尾更严重原因解决方法1、二级保留效应，反相模式a、加入三乙胺（或碱性样品）b、加入乙酸（或酸性样品）c、加入盐或缓冲剂（或离子化样品）d、更换一支柱子2、二级保留效应，正相模式a、加入三乙胺（或碱性样品）b、加入乙酸（或酸性样品）c、加入水（或多官能团化合物）d、试用另一种方法3、二级保留效应，离子对加入三乙胺（或碱性样品）H、酸性或碱性化合物的峰拖尾原因解决方法1、缓冲不合适a、使用浓度50-100mM的缓冲液b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液I、额外的峰原因解决方法1、样品中有其他组份正常2、前一次进样的洗脱峰a、增加运行时间或梯度斜率b、提高流速3、空位或鬼峰a、检查流动相是否纯净b、使用流动相作为样品溶剂c、减少进样体积J、保留时间波动原因解决方法1、温控不当调好柱温2、流动相组分变化防止变化（蒸发、反应等）3、色谱柱没有平衡在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱K、保留时间不断变化解决方法1、流速变化重新设定流速2、泵中有气泡从泵中除去气泡3、流动相选择不恰当a、更换合适的流动相b、选择合适的混合流动相L、基线漂移原因解决方法1、柱温波动。
液相色谱四大常见故障及解决方法 液相色谱如何操作
液相色谱四大常见故障及解决方法液相色谱如何操作液相色谱仪紧要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统构成。
对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的紧要部位。
常见问题及解决方法一、柱压问题柱压问题是使用液相色谱过程中需要紧密注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分别效果及保留时间等紧密相关。
所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在345kPa 以内或在50PSI之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。
压力过高、过低都属于柱压问题。
1压力过高这是液相在使用中常见的问题，指的是压力蓦地上升，1、一般都是由于流路中有堵塞的原因。
此时，我们应当分段进行检查。
（1）.首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充分液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，假如液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。
处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。
假如液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查；（2）.打开Purge阀，使流动相不经过柱子，假如压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。
处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。
假如压力降至100PSI以下，过滤白头正常，在检查；（3）.把色谱柱出口端取下，假如压力不下降，则是柱子堵塞。
处理方法：假如是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。
假如是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。
假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。
这时，假如柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很简单造成柱效下降，所以尽量少用。
问题无法解决可考虑更换色谱柱。
2、流速设定不正确：可重新设定正确流量。
3、流动相配比不正确：不同配比的流动相其黏度系数不相同，较高黏度的流动相相应的系统压力也大，假如可能可更换黏度较小的溶剂或重新设定配比。
高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法
高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法1 色谱柱跑干了，处理方法：将贮液瓶装入重蒸水，首先按purge键，将柱前气柱排出，若无法排出，可将色谱柱前拆下，用注射器抽吸。
待柱前气体排空后，连接色谱柱，用水高低流速交替冲洗色谱柱，直至柱压稳定为止。
2.基线不稳，有静电，处理方法：检查接地是否良好。
3.峰面积变化非常大，处理方法：检查是否进样阀堵塞。
4.基线突然提高，变粗，处理方法：检查样品池能量，若低于正常值，说明检测器污染。
5.柱压变动范围较大，处理方法：多为进气泡。
高低流速交替冲洗。
6.柱效或峰形突然变差，处理方法：更换预柱。
7塔板数低：色谱柱选择不对，二次保留、峰形不好的影响8色谱柱易变性：色说柱选择不对，二次保留的影响9色谱柱寿命短：色谱柱选择不对，样品需预处理（PH<3或PH>7）10保留值变化：色谱柱平衡不够，流动相比例改变11出现新的干扰峰：初始分离不够或初始样品无代表性选择波长要从以下几个方面考虑：1. 检测波长要大于溶剂截止波长。
如果所选择的波长下溶剂有很强的吸收当然是不合适的。
溶剂有强吸收后，基线抬高，减小检测的线性范围而且会加大基线噪声，对溶质的检测灵敏度下降。
2. 对各组分都要有适当的吸收。
一般是不可能做到的。
所以只要选择一个对大多数组分都有较大吸收的波长就可以了。
3. 外标法定量时，要选择被测组份最大吸收波长。
254nm 对常见的共轭结构和羰基官能团都有吸收。
对饱和基团也有弱的吸收。
而对于常见的乙腈、甲醇的透过率很高。
是在不知道用什么波长时最理想的试验波长。
（一）涡流扩散（Eddy diffusion）流动相碰到较大的固体颗粒，就像流水碰到石头一样产生涡流。
如果柱装填得不均匀，有的部分松散或有细沟，则流动相的速度就快；有的部位结块或装直紧密则流就慢，多条流路有快有慢，就使区带变宽。
因此，固相载体的颗粒要小而均匀，装柱要松紧均一，这样涡流扩散小，柱效率高。
高效液相色谱常见故障及解决方案
清洗柱或更换柱 清洗六通阀 清晰检测器
管路污染
冲洗
流动相中含有稳定剂 或稳定剂变化
使用无防腐溶剂
8.保留时间变 化
现象
保留时 间不重 复
判断
系统不问或未达 到平衡
室温波动大
柱被污染 溶剂配比不合适 进样体积太大或 样品浓度太高
故障排除
分析之前应有足够的时间 使系统平衡 使用柱温箱、将系统置于 恒温、空气对流小的环境 冲洗柱或更换柱 调节溶剂配比
检测器内有气泡
用甲醇或其他强极性的溶剂 冲洗流通池
用强极性的溶剂清洗系统
清洗检测器，在检测器后面 安装背景压力调节器
检测器灯能量不足
更换灯
12.规则基线 噪音
现象
规则基 线噪音
判断
故障排除
流动相、检测 器或泵内有气 泡
流动相脱气，冲洗系统除去检 测器或泵内的空气
室温不稳
稳定环境温度。使用柱温箱、 将系统置于恒温、空气对流小 的环境
鬼
洗脱物
峰
注射器脏
故障排除
用标准品对照、检查样品处理过程， 换新样品
增加分析时间或梯度洗脱、提高流 速、如问题仍存在，两次进样间用 强溶剂冲洗色谱柱
清洗注射器、冲洗进样口
现象
判断
故障排除
流动相被污染
清洗溶剂贮液瓶、清洗溶剂入 口过滤器、使用HPLC级试剂
色谱图 出现鬼 峰
柱被污染 六通阀污染 检测器污染
峰变 宽
环境温度变化 漏夜
使用柱温箱 检查漏夜的位置并维修
出现两个或多个未被完 全分离的物质的峰
选择其它色谱条件以改善分 离效果
检测器时间常数太大
使用较小的时间常数
4.峰分叉
高效液相色谱常见问题及维修保养
高效液相色谱常见问题及维修保养高效液相色谱常见问题1、液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？①筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。
②存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子③可能柱超载，减少进样量。
2、HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法是什么？①样品量不足，解决办法为增加样品量②样品未从柱子中流出。
可根据样品的化学性质改变流动相或柱子③样品与检测器不匹配。
根据样品化学性质调整波长或改换检测器④检测器衰减太多。
调整衰减即可。
⑤检测器时间常数太大。
解决办法为降低时间参数⑥检测器池窗污染。
解决办法为清洗池窗。
⑦检测池中有气泡。
解决办法为排气。
⑧记录仪测压范围不当。
调整电压范围即可。
⑨流动相流量不合适。
调整流速即可。
⑩检测器与记录仪超出校正曲线。
解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
3、做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？①泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；②比例阀失效，更换比例阀即可；③泵密封垫损坏，更换密封垫即可；④溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；⑤系统检漏，找出漏点，密封即可；⑥梯度洗脱，这时压力波动是正常的。
4、我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。
其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。
①拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；②把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；③将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。
这时，如果柱压仍不下降，再检查；只用于使用过的柱子。
④更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1000
800
中药材
600
中成药
400
提取物
200
0 2000年版 2005年版 2010年版
液相色谱原理
基本原理：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固 定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和） 的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
A
柱塞A前进
Single ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱiston Delivery
Combined Delivery
柱塞B后退
泵的工作方式( 四元梯度)
比例阀
1、由比例阀来控制流动相比例的变化 2、可以同时使用多种溶剂，最大四种
泵的工作方式( 二元梯度)
混合器
1、由两个独立的泵来控制溶剂比例 2、只能同时使用两种溶剂 3、若要增加溶剂选择，可加入溶剂选择阀 4、质谱检测器的最佳前端
柱温与分离 (不经过预热器)
VWD1 A, Wavelength=338 nm (C:\AGILENT...\氨基酸20141031\转化糖电解质20141030 2014-10-31 13-04-46\AA对照.D) mAU
8
6
1.863 - 天门冬氨酸 3.296 - 谷氨酸
6.088 - 丝氨酸 7.044 - 组氨酸
7.76.4507-3 -苏甘氨氨酸酸 8.595 - 精氨酸
9.153 - 丙氨酸 10.663 - 酪氨酸 12.128 - 胱氨酸 12.789 - 缬氨酸 13.171 - 蛋氨酸 1144..578196 -- 苯异丙亮氨氨酸酸 15.538 - 亮氨酸
15.872 - 赖氨酸
4
2
不经过预热器，则甘氨酸和苏氨酸、 苯丙氨酸和异亮氨酸不能够分离。
自动进样器：有自动可变体积或者固定定量环形式 固定定量环形式：若需要不同体积进样，需要手动 更换定量环。 柱温箱：精确控温，保证色谱重复性。
检测器：根据应用不同，多种检测器模块可选。UVVWD，UV-DAD，FLD，ELSD
液相色谱仪的一般运行过程(示意图)
1. 高压输液系统
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很 大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液 泵、过滤器、压力脉动阻尼器等组成，其中高压输液泵是核心 部件。 对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压 力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。常 用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点是在一定操 作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关； 恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力 而变化，故保留时间的重视性差，它们各有优缺点。 目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机 械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
泵的类型
消除流量脉冲－串联柱塞
单向阀
P
脉冲阻尼器
减少了单向阀用量 需要阻尼器 压缩因子补偿
Agilent 1100 Series Pumps: Solvent Compressibility Compensation
Piston Displacement (祃)
0
System Pressure>0
20
10
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
min
液相色谱原理
选择性差异从哪里来？
R
O
Si
R1
R
品牌1 C18键合方式
OH
R
O
Si R1
R OH
R
O
Si
R1
R
R1
O Si
R1 CH3 Si CH3 CH3
R1
O Si
R1 CH3 Si CH3 CH3
R1
O Si
R1
PG
R
品牌3 C18键合方式
PG
mAU 400
300 延迟体积 ~ 700 μL 起始等度时间约2分钟
200
100
0
mAU 400
0.5
1
1.5
2
300
200
100
0
0.5
1
1.5
2
3.7 min
2.5
3
3.5
4
2.6 min
4.5
min
延迟体积 ~120 μL 起始等度时间约0.3分钟
2.5
3
3.5
4
4.5
min
2．进样系统
负责把液态样品引入液相色谱的流动相中 进样器必须耐受液体系统产生的高压 自动进样器是进样的自动装置 进样器类型：
8
液相色谱原理
同品牌，同型号的色谱柱获得一致的选择性
Eclipse XDB C18 - Xanthines黄嘌呤
5 µm
α 2，3= 1.13
1
3.5 µm
2
3
4
α 2，3= 1.13
5
min
1
1.8 µm
2
3
4
α 2，3= 1.14
1
2
3
4
5
min
5
min
Eclipse XDB C18 – Barbitals巴比妥
水相/缓冲盐 对离子
离子
体积排阻色谱 聚苯乙烯硅胶等
(Size Exclusion)
水相（SEC/GFC） 大分子量化合物 有机相（GPC） 聚合物
液相色谱原理
色谱柱的选择
根据化合物的性质：极性、酸碱 性、电离能力选择色谱柱及流动 相。
一般情况下，遵循相似相溶原 理。
要注意相同类型色谱柱选择性的 差异。
： 关键点 流动相 固定相 相互作用
液相色谱原理
分离度公式
塔板数
选择性因子
容量因子
������
������ − 1
������′
������������ = 4 × ������ × ������′ + 1
Rs：分离度；一般要求大于1.5。分离度越大越好。 N：理论塔板数；与色谱柱填料粒度、长度、均一性等相关；理论板数越高越好。 α：选择性因子；与色谱柱键合相、硅胶封端技术等相关；选择性因子越大越好。 k：容量因子；与化合物性质、流动相、键合相相关；容量因子在0-10范围内影响大。
根据选定的模式进行色谱柱的选 择。
常见的高效液相色谱的分离模式
色谱类型 (Mode)
固定相 (Stationary Phase)
流动相 (Mobile Phase)
主要适用范围
(Compound Separated)
正相色谱 (Normal-Phase)
硅胶，氨基、氰基、二 醇基键合硅胶……
有机溶剂
固定定量环形式：一般用于手动进样器，需要手动更换 定量环以适用不同进样体积的需求
流通式：一般用于自动进样器，可进样最大loop环体积 内的任意量。流通式的交叉污染也较小。
手动进样器
定量环
自动进样器
3．温度控制系统
柱温的精确控制对于提高色谱柱的柱效，改善 色谱峰的分离度，缩短保留时间，降低反压， 保证分析样品结果的重复性，具有不可忽视的 作用。同时升高温度可以缩短保留时间，使实 验耗时少，减少流动相的消耗。因此，一个色 谱系统需要正确控制色谱柱柱温，所以柱温箱 已成为HPLC系统中的重要配套装置。
0.0040
0.0035 0.0030 0.0025 0.0020 0.0015
最佳流速范围
2.
5.0 m
3.
3.5 m
0.0010 0.0005
1.8 m
0.0000 -0.0005
0.4mL/min
2 mL/min
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
Interstitial linear velocity (ue- cm/sec)
System Pressure=0
100
One Piston Cycle
TIME
w/o compensation with compensation
For internal use only 11
泵的类型
消除流量脉冲－并联柱塞泵
P 单向阀
A
B
相消干扰 通常也需要阻尼器 增加了单向阀的使用数量
B P
柱温箱
柱温箱的温度控制方式：
单加热：加热块 强制风冷 或者半导体（帕尔贴）制冷
帕尔贴元件是由一排排N和P型的半导体构成，通过在半导体里面转移电荷载体(如 N型中的电子和P型中的空穴)， 从而把热从一侧转移到另外一侧。再通过改变施 加电压的极性，元件可以被用来加热或冷却溶剂，样品和色谱柱。柱温箱模块中 的风扇用于把帕尔贴元件后部产生的热量带走。
0
-2
2
4
6
8
10
12
14
16 min
流动相不经过预热，甘氨酸/苏氨酸、苯丙氨酸/异亮氨酸分离度达不到要求
柱温与分离(经过预热器)
VWD1 A, Wavelength=338 nm (C:\AGILENT...\氨基酸20141031\转化糖电解质20141030 2014-10-31 14-26-47\AA对照.D) mAU
R
PG
R
CH3
O
Si
CH3
CH3
O
Si CH3
CH3