实验二免疫荧光
免疫荧光实验出现的问题及处理方案
免疫荧光实验出现的问题及处理方案一、引言免疫荧光实验是一种重要的实验方法，广泛应用于生物医学研究中。
然而，在实验过程中，我们时常会遇到一些问题，如背景信号过高、染色效果不理想等。
本文将针对这些常见问题进行分析，并提供相应的处理方案。
二、问题及处理方案2.1背景信号过高在免疫荧光实验中，背景信号过高是常见的问题之一，它会影响到我们对目标物质的检测和分析。
以下是一些可能导致背景信号过高的原因及相应的处理方案：非特异性结合1.：在实验中，可能存在一些非特异性抗体或试剂与样品中的其他成分结合，导致背景信号增大。
解决该问题的方法是使用合适的阴性对照，如对照抗体、缺乏特定抗原的样品等。
未充分洗涤 2.：洗涤步骤不充分可能导致残留的非特异性结合物增多，进而使背景信号过高。
解决该问题的方法是增加洗涤次数，并使用足够的缓冲液来洗涤样品。
荧光染料问题3.：某些荧光染料本身可能存在背景信号较高的情况。
在选择荧光染料时，应注意避免选择背景信号较高的染料。
在实验中，可以尝试不同的荧光染料以减少背景信号。
2.2染色效果不理想除了背景信号过高外，染色效果不理想也是在免疫荧光实验中常见的问题。
以下是一些可能导致染色效果不理想的原因及相应的处理方案：抗体不合适1.：选择不合适的抗体可能导致染色效果不理想。
在实验中，应根据样品的特点选择适当的抗体，并进行充分的优化。
如果抗体来源有问题，应尝试使用其他来源的抗体。
染色条件不合适2.：染色条件的温度、时间等因素对染色效果有重要影响。
如果染色效果不理想，可以尝试调整染色条件，如改变温度、延长或缩短染色时间等。
样品制备问题 3.：样品制备不当可能导致染色效果不理想。
在实验前，应充分准备样品，并采用合适的固定方法和处理步骤，以确保样品的完整性和稳定性。
三、其他问题及处理方案除了背景信号过高和染色效果不理想外，免疫荧光实验还可能存在其他问题，如溶液配制错误、仪器故障等。
以下是一些可能出现的问题及相应的处理方案：溶液配制错误1.：如果实验溶液配制错误，可能会对实验结果产生不利影响。
免疫荧光技术名词解释细胞生物学
一、免疫荧光技术概述免疫荧光技术是一种通过荧光显微镜观察细胞或组织中特定分子的方法。
它利用抗体与待检测分子结合后，再加上荧光标记的二抗或荧光标记的直抗，通过荧光显微镜观察标记分子的位置和数量。
免疫荧光技术在细胞生物学和免疫学研究中得到了广泛应用，为研究生物分子的定位、表达和相互作用提供了重要技术支持。
二、免疫荧光技术的原理1. 抗体结合在免疫荧光技术中，首先需要用特异性抗体与待检测的分子结合。
这些抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，通过它们与目标分子的结合，实现对待检测分子的高度特异性识别。
2. 荧光标记待检测分子与抗体结合后，需要加入荧光标记的二抗或直抗，使得待检测分子与荧光物质结合形成复合物。
通常使用的荧光分子有FITC、TRITC、Alexa Fluor等，它们在不同激发波长下显示出不同的荧光颜色。
3. 观察和分析最后通过荧光显微镜观察标记的细胞或组织样品，根据荧光信号的强度和分布情况，可以判断待检测分子的位置和数量，从而了解其在细胞内的表达和功能。
三、免疫荧光技术的应用1. 细胞膜标记免疫荧光技术可用于标记细胞膜上的特定蛋白，例如细胞黏附蛋白、受体蛋白等，从而观察它们在细胞膜上的分布情况和动态变化，揭示细胞膜的结构和功能。
2. 细胞器定位通过标记特定的蛋白或抗体，免疫荧光技术可以用于观察细胞器的定位，如线粒体、内质网、高尔基体等，帮助研究者了解细胞器在细胞内的分布和相互作用。
3. 蛋白相互作用免疫荧光技术也被广泛应用于研究蛋白之间的相互作用关系，通过标记不同的蛋白并观察它们在细胞内的共定位情况，可以揭示蛋白间的相互作用网络和信号传导路径。
4. 细胞功能研究通过观察细胞内荧光标记物的动态变化，免疫荧光技术可以帮助研究者了解细胞的代谢活动、信号转导和细胞周期等重要的生物学过程。
四、免疫荧光技术的发展和趋势1. 自动化和高通量随着技术的发展，免疫荧光技术已经向自动化和高通量方向发展。
自动化的设备和流程使得实验操作更加标准和高效，而高通量的技术则可以同时观察大量样品，加快研究进程。
免疫荧光技术实验报告
免疫荧光技术实验报告免疫荧光技术实验报告免疫荧光技术是一种通过将荧光标记的抗体与特定抗原结合来检测和定位生物分子的方法。
本实验旨在探究免疫荧光技术的原理和应用，并通过实验验证其可行性。
一、实验原理免疫荧光技术基于抗原与抗体的特异性结合原理。
在本实验中，我们选择了一种常用的抗原-抗体反应，即兔抗小鼠IgG。
首先，将小鼠IgG注射到兔体内，兔体会产生针对小鼠IgG的抗体。
然后，将这些抗体与荧光染料标记，形成荧光标记的抗体。
当荧光标记的抗体与小鼠IgG结合时，可以通过荧光显微镜观察到荧光信号。
二、实验步骤1. 准备样本：将小鼠IgG溶解在缓冲液中，制备不同浓度的小鼠IgG溶液。
2. 固定标本：将小鼠IgG溶液滴加到载玻片上，使其均匀分布，并用乙醇固定。
3. 孵育抗体：将荧光标记的兔抗小鼠IgG加入载玻片上，与固定的小鼠IgG反应。
4. 清洗样本：用缓冲液洗涤载玻片，去除未结合的抗体。
5. 观察结果：在荧光显微镜下观察载玻片上的荧光信号。
三、实验结果在实验中，我们观察到荧光显微镜下载玻片上出现了荧光信号。
荧光的强度与小鼠IgG的浓度成正比，即小鼠IgG浓度越高，荧光信号越强。
这表明荧光标记的抗体与小鼠IgG发生了特异性结合。
四、实验分析免疫荧光技术的原理是利用抗体与抗原的特异性结合来检测和定位生物分子。
在本实验中，我们成功地将荧光标记的抗体与小鼠IgG结合，形成荧光信号。
这表明免疫荧光技术可以用于检测特定抗原，并通过荧光显微镜观察到信号。
免疫荧光技术在生物医学研究中具有广泛的应用。
它可以用于检测病原体、研究细胞蛋白定位、诊断疾病等方面。
例如，在病原体检测中，可以使用荧光标记的抗体来检测病原体的存在和定位，从而提高病原体的检测灵敏度和准确性。
在细胞蛋白定位研究中，免疫荧光技术可以用于观察蛋白在细胞内的分布情况，从而揭示蛋白的功能和相互作用关系。
在疾病诊断中，荧光标记的抗体可以用于检测特定抗原的存在，从而帮助医生进行疾病的早期诊断和治疗。
免疫荧光(单标和双标)注意事项及具体方法
免疫荧光（单标和双标）注意事项及具体方法一、技术简介免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
二、实验流程免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。
但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。
具体染色方法如下。
1. 所需材料与试剂：a. 培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。
b. 一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
c. 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。
d. 封闭液。
e. 0.01mol／LPBS缓冲液。
2. 染色方法：a. 取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿，用0.01MPBS洗2-3遍。
b. 加入0.3%的Tritonx-100，37℃，30 rain。
c. 加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。
d. 正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min，抑制IgG的非特异性结合。
阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
e. 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃过夜。
抗体以0.01mo/LPBS稀释（理想的抗体浓度需经试验而定）。
f. 用0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5min，0.01 M PBS洗5 rain。
免疫荧光通道选择
免疫荧光通道选择免疫荧光通道选择是一项非常重要的实验步骤，可以用来检测样品中的蛋白质或细胞表面分子，并观察它们在细胞内或组织中的定位。
本文将从实验步骤和技巧两方面来详细介绍免疫荧光通道选择的相关知识。
一、实验步骤：1.取样：从细胞或组织中获取需要检测的样品，可以通过培养细胞或组织切片的方式获取。
2.固定样品：用甲醛或乙醛作为固定剂，将样品进行固定。
通常情况下，细胞需要在室温下进行固定10-20分钟，而组织切片需要在4°C下固定1-3小时。
3.脱水：将样品进行脱水处理，这一步骤可以去除样品中多余的水分，便于后续的染色。
4.透明剂处理：将样品进行透明剂处理，这一步骤可以使样品透明，并便于观察。
5.切片：将样品切成薄片，使其能够在显微镜下被观察。
6.离子结合剂：用离子结合剂，如牛血清蛋白、BSA等，来阻止抗体在非特异性结合上的作用，提高特异性。
7.荧光探针：将荧光探针与样品进行染色，这一步骤可以使细胞中的蛋白质或细胞表面分子轻易地被检测到。
二、技巧：1.检测波长选择：在进行染色前，需要根据荧光物质的激发波长和发射波长来选择检测波长。
2.荧光物质选择：根据需要检测的分子类型，选择适合的荧光探针。
3.品牌和抗体选择：尽量使用经过验证的品牌和抗体，以及进行合适的负对照和正对照，确保实验数据的准确性。
4.控制异种抗体的交叉反应：异种抗体在进行荧光染色时可能会产生交叉反应，例如小鼠产生的抗体可能会与人的样品产生交叉反应。
此时可以使用与样品同种类的标记物或选择与样品没有交叉反应的抗体。
5.互补性质：在进行荧光染色时，需要考虑到抗原表位和抗体的互补性质。
如果抗原表位和抗体不互补，则染色效果不佳，影响观察结果。
免疫荧光通道选择在生命科学领域中得到了广泛应用，可以用于检测疾病的诊断、药物研发等多个领域，因此正确地掌握实验步骤和技巧非常重要。
希望本文介绍的内容能够对大家在科学研究中有所帮助。
免疫荧光法
免疫荧光法免疫荧光法是一种利用免疫分析（免疫学）与荧光技术结合的分析技术，是免疫分析中应用最为广泛的技术之一。
该技术是在荧光技术的基础上，采用特殊抗体作为检测指示物，开启免疫细胞生物学的新型检测技术。
它具有很高的灵敏度、特异性和可重复性，应用范围广泛，是免疫检测中最重要的方法之一。
免疫荧光法是在免疫原理的基础上开发出来的一种以特异性抗体为指示物的高敏感度检测方法，它能够检测膜结构蛋白的定位、蛋白质的表达水平及生物化学变化过程、蛋白质的交互作用、细胞周期变化、细胞表面活性等多种信息。
由于抗体的特异性，免疫荧光法可以迅速准确地检测指定的分子，可以检测微量的分子，灵敏度很高。
免疫荧光法的原理有三：抗原抗体复合物形成；抗原抗体复合物与荧光标记抗体复合；介质中激发荧光反应。
在这三种原理中，抗原抗体复合物形成是核心，此复合物形成后，会在介质中激发荧光反应，从而得到实验结果。
其步骤大致为侦测抗原→复合抗体抗原→复合荧光标记抗体→荧光反应。
免疫荧光法的应用主要有：检测蛋白质的表达水平；检测细胞1:1 1:n相互作用；检测细胞内的活性；还可用于检测细胞的活力、细胞增殖和细胞凋亡以及复杂细胞生理过程。
由于免疫荧光法的特殊性和敏感性，它已成为生物应用研究中不可缺少的高灵敏检测技术，广泛应用于癌症、血液病和免疫系统病等医学研究。
在这种技术的发展过程中，也有一些不足之处。
其一，荧光增强效果及其大小与抗体的结合程度有关，这就要求抗体的特异性要求相对较高；其二，由于抗体的特异性和敏感性受到环境的影响，不同的环境可能会导致不同的检测结果；其三，抗体价格较高，成本高。
因此，免疫荧光法需要进一步改进和优化，以提高其准确性和效率。
比如在抗体的制备过程中，可以采用抗原免疫表达定向突变技术，研制特异性、耐用性和稳定性较好的抗体，从而有效提高免疫荧光法的敏感性和特异性；另外还可以通过研究不同的荧光探针及其结合作用，开发高效的荧光反应技术，以追求荧光增强效果的最佳化；另外还可以采用基因工程等方法，来降低抗体的成本。
免疫荧光(IF)实验操作步骤及详细说明
免疫荧光（IF）实验操作步骤及详细说明一、试剂和溶液10X PBS：80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1L 纯水，调pH 至7.4 洗涤液：1× PBS：纯水稀释10X PBS；1× PBST：含0.05% Tween-20 的1×PBS 固定液：4%多聚甲醛：4g 多聚甲醛溶于100ml PBS 通透液：0.1% triton-100 封闭液：PBS 配制的3% BSA 抗体稀释液：一抗稀释液：3% BSA；二抗及鬼笔环肽稀释液：1X PBS；DAPI: 纯水稀释二、实验步骤1.细胞爬片：将盖玻片在酒精灯上灼烧片刻灭菌，铺在12 孔板中，然后接种细胞，置于37℃，5% CO2 培养箱过夜，待细胞形态完全伸展开并且处于健康状态，细胞密度为40%-50%（做爬片的细胞一般是复苏细胞传代2 代后的细胞）；2.洗涤：倒掉细胞培养液，1×PBS 轻微振荡洗涤2 次,每次5min；3.固定：4%多聚甲醛固定细胞，室温放置20min,倒掉多聚甲醛，加入适量PBS；4.冻存：-20℃保存（如果直接使用，可跳至7）；5.解冻：常温下放置30 min；6.洗涤：PBS 轻微振荡洗涤2 次,每次5min；7.通透：加入适当体积的通透液室温放置10min。
（若蛋白为膜表达则无需此步）8.洗涤：PBS 轻微振荡洗涤2 次,每次5min；9.封闭：加入适当体积的封闭液，室温放置30 min；10.一抗孵育：倒掉封闭液，加入适当体积及浓度的一抗，37℃孵育60min；11.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤3 次,每次5min；12.二抗孵育：加入适当体积及稀释比的荧光二抗，37℃避光孵育50 min；（如果一抗是荧光素标记的则无需此步）；13.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤3 次,每次5min；14.核染色：加入适当体积及稀释比的核染料DAPI 室温反应10min （如果无需加鬼笔环肽，可洗涤后跳至16）；15.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤3 次,每次5min；16.细胞骨架染色：此步骤只针对有细胞核定位的项目；加入反应体积为0.2ml，适当稀释比的鬼笔环肽，避光37℃孵育60 min 或4℃孵育过夜；17.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤2 次,每次5min，纯水轻微振荡洗涤5min；18.封片：取干净的载玻片，分别标记和编号，在载玻片上滴加适量防荧光猝灭封片剂，用镊子取出盖玻片，细胞面朝下，盖在载玻片上；19.荧光显微镜观察，记录结果。
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类1、免疫标记法及其分类1）荧光免疫法：原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2）放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。
但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。
近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
3）酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L 板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1 000ug／L。
夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。
ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。
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➢荧光探针 罗丹明标记鬼笔环肽可特异性的标记F肌动蛋白，
并发出具有独一无二的高亮度和光稳定性的红色荧光。
实验用品
试剂
固定液：4%多聚甲醛 封闭试剂：10%正常山羊血清 0.2%Triton X-100 一抗：小鼠源抗Vinculin单克隆抗体
（abcam） 二抗: Alexa Fluor488标记的山羊抗小鼠IgG
交联试剂
如：中性甲醛溶液、多聚甲醛、福尔马林等，有利于保护细胞结构， 但是会产生蛋白交联，降低抗原性，因此需要进行抗原修复。
有机试剂
如：预冷的甲醇、乙醇、丙酮等，它们会吸去脂类使细胞脱水， 并使蛋白变性，这种固定方法不需要再对细胞进行通透。
灌注固定： 将固定液通过内循环系统灌注到组织中，特别是脑组织的取材！
间接荧光抗体染色法示意图
实验原理 微丝骨架的检测
肌动蛋白：细胞骨架微丝的单体
鬼笔环肽：是一种高亲和力F肌动蛋白探针， 可与F肌动蛋白特异结合。
四甲基罗丹明(TRITC)： 激发光/发射光波长: 540/565 nm， 红色荧光染料。
skin fibroblast labeled with rhodamine phalloidin.
1.保持细胞、组织的固有形态和结构； 2.防止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质； 3.细胞内蛋白质凝固; 4.保持组织或细胞化学成分的某些属性,如抗原性或核 酸杂交活性。
根据组织类型，选择合适的固定剂
特点2.细胞化学反应及可见性
酶+底物反应 显色反应
抗原+抗体反应 显色反应
放射性同位素衰变和 射线的释放反应 感光
NeuN在成熟神经元中特异表达 GFAP在胶质细胞中特异表达
常见问题
高背景染色
高背景盖过特异染色
• 降低抗体浓度
高
背
• 优化封闭条件
景
• 缩短抗原修复时间
• 使用阴性对照
低 背 景
常见问题
不正确的信号
抗原染色位置不正确 • 调整固定方法 • 优化抗原修复条件 • 抗体的特异性不高
Hela细胞 Rabbit monoclonal toTRAF3
底物显色
标记酶 HRP
AP
底物 DAB
AEC DAB+nickel enhancer
BCIP/NBT
萘酚AS-MX+fast red
产物颜色 棕黄色
红色 黑色
蓝紫色
红色
显色时镜下观察显色程度，确定显色时间！ 复染
免疫组化：苏木素(蓝色)，核固红（红色） 免疫荧光：DAPI、Hoechst
封片并观察
（invitrogen） 罗丹明标记的鬼笔环肽：
（ Rhodamine Phalloidin，invitrgen） DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚）：（碧云天） PBS洗涤缓冲液：PH7.4
材料及仪器
Hela细胞 细胞培养皿 荧光显微镜
实验步骤
一，细胞制备和细胞固定
将细胞铺在 24孔板中
在切片上盖上玻片来保存和保护切片，并能提升影像的质量。 免疫组化：中性树胶 免疫荧光：50%、75%或95%甘油 抗荧光淬灭封片液 抗荧光淬灭封片液（含DAPI）
常见问题
没有信号/染色
样本里没有目标抗原或抗体的特异性不好
• 使用阳性对照 • 优化抗原修复条件 • 增加抗体浓度 • 信号放大（生物素-亲和素系统） • 无抗原，用原位杂交技术检测蛋白表达
抗原修复
福尔马林或多聚甲醛固定会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
酶抗原修复（PIER）
热抗原修复（HIER）
胰蛋白酶（Trypsin）
高压蒸汽法
胃蛋白酶（Pepsin）
微波法
蛋白酶K（Proteinase K）
蛋白水解酶37℃孵育10-20min。 对样本损害较小，冰冻切片适用。
水浴加热法
细胞免疫荧光技术
细胞化学
在原位观察到化学成分,提供什么信息？
1.推测化学成分（大分子）的可能功能
2.观察生理、病理状态下的大分子动态变化
定位的变化
量的巨大变化
3.指示大分子所在的特异细胞，观察细胞在组织 的分布及在生理病理状态下的变化
特点1.原位：怎样做到组织/细胞的原位？
固定（Fixation)
Mounting/ observation
实验样本
1，石蜡切片（Paraffin-emnedded sections）
优点
•保持细胞、组织形态 •容易保存
不足
•需进行石蜡包埋，染色前需脱蜡 •需要进行抗原修复
石蜡包埋
1. 乙醇梯度脱水：50%、70%、80%每次1h, 95%、100%各两次1h. 2. 二甲苯两次1h. 3. 恒温箱中浸蜡两次4小时。 4. 使用包埋机包埋。
核酸杂交反应 显色反应
➢酶细胞化学技术 ➢免疫细胞化学技术
➢放射自显影 ➢原位杂交技术
实验目的
➢ 掌握免疫荧光技术的基本原理 ➢ 熟悉细胞免疫荧光技术的方法 ➢ 了解在免疫细胞化学技术中如
何获得好的实验结果
人体和其他多细胞生物都由细胞按特定方式有序构建
死去的 角质化细胞
表皮细胞
基膜 真皮细胞
皮肤组织
锚定连接的构成：
细胞内锚定蛋白 （Vinculin） 位于质膜胞质面， 提供细胞骨架成分 附着点。
细胞骨架 （actin） 跨膜黏附蛋白
细胞内锚定蛋白 跨膜黏附蛋白
（与骨架附着） （黏附分子）
实验原理 Vinculin的检测
➢ 原位检测
➢ 抗原抗体特异反应
➢ 间接法
抗体
抗原
激发光
显示荧光
荧光素标记 的抗抗体
• 抗原活性保存较好
胞、
组织结构
• 切片不易保存
冰冻切片HE染色
石蜡切片HE染色
固定
正确的固定是免疫组织化学方法的关键，免疫组化无法检测一个已经不存在的抗原
•组织块迅速浸入固定液，最大限度保护抗原。 •样本不要太大，保证完全浸润。 •固定液浓度：浓度越大，固定程度越好。 •固定时间与温度：时间越长，温度越高，固定程度越深。
“Step by step”实验步骤
固定
fixation
一抗孵育
1st Ab incubation
包埋
embedding
封闭
blocking
切片
sectioning
抗原修复
antigen retrieval
二抗孵育
2nd Ab incubation
酶底物显色
enzyme substrate
封片和观察
常见问题
细胞/组织的形态被破坏
• 冰冻切片形成冰晶破坏组织结构： 固定后梯度蔗糖脱水。
• 取材时组织块尽量小，固定充分。 • 提高切片质量：
切片时使用锋利的刀片、 新鲜的防脱片载玻片等。
结 构 破 坏
结 构 正 常
人肝癌组织 CD31免疫荧光染色
思考题
检测人肝癌组织中蛋白A及蛋白B两种蛋白的共定位情况， 思考应选择什么方法，用什么仪器观察？ 请写出简略步骤。
切片置于加热至98 ℃的 修复液中约25min。
热抗原修复
封闭
降低非特异性结合（如免疫球蛋白IgG登）所造成的背景染色
正常动物血清：
•不能与一抗同源 •最好是二抗同源
牛血清白蛋白BSA
没有封闭，高背景
有封闭，低背景
封闭
标记方法
使用HRP标记物 使用AP标记物 使用生物素标记物 使用荧光标记物
封闭方法
0.3%H2O2室温孵育10-15min 0.24mg/ml的左旋四咪唑加到染料溶液中 封闭试剂盒 用含0.3M甘氨酸的封闭液封闭
通透（permeabilization）
• 当抗体检测位于细胞内的目标蛋白时(包括抗 原表位在胞内段的跨膜蛋白)，需要对细胞进 行通透。 • 将样品在含0.1-0.2%Triton X-100的PBS中孵 10min。 • 使用预冷的甲醇或丙酮固定则不需要通透 。
A
B
注意事项
➢ 细胞密度: 60-70%
细
➢ 防止细胞污染
胞 污
➢ 固定时间: 一般5-30min
染
➢ 漂洗: 必要时用恒温摇床摇洗
➢ 激光共聚焦显微镜: 专用培养皿
免疫细胞化学技术
标记物
1. 免疫荧光技术 2. 免疫酶技术 3. 免疫亲和技术 4. 免疫胶体金技术
特异大分子在组织细胞原位的定位、定性
脱蜡/复水
1.65℃烤片1h。 2.二甲苯两次5min。 3.乙醇梯度复水：100%、95%、70%、50%、30%每次5min。 4.水/PBS漂洗5min。
实验样本
2，冰冻切片（Frozen sections）
优点
不足
• 操作步骤简单，时间短， • 形态较石蜡包埋的样本差
适用于活检ห้องสมุดไป่ตู้
• 冰晶的形成可能会影响细
将细胞培养 至所需密度
固定
染色 或保存
PBS 洗涤
实验步骤
二，细胞免疫荧光（ICC）染色
加入一抗
加入二抗 和鬼笔环肽
加入DAPI复染
PBS 洗涤
0.2%
TritonX 处理5min
封闭 室温30min
PBS 洗涤
4℃过夜
37℃1-2小时
PBS 洗涤
37℃5-10min
荧光 显微镜 观察
实验结果
红色：微丝 绿色：vinculin 蓝色：细胞核
一抗孵育
每一个新的实验都要找出合适的抗体浓度，使得特异性染色最大化并减少背景
建议浓度
二抗孵育
酶偶联二抗 - 辣根过氧化物酶（HRP），