胶体金、免疫荧光
免疫胶体金测试原理
免疫胶体金的制备原理
胶体金是氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下， 金离子还原后聚合成的一定大小的金颗粒，它由一个基础的晶核（11 个金原子形成的二 十面体）和包围在外的双离子层构成（内层为负离子层 AuCl2－，外层是带正电荷的 H ＋）。由于静电作用，金颗粒之间相互排斥而悬浮成为一种稳定的胶体状态，形成带负 电的疏水胶溶液，故称胶体金。
双抗原夹心法
双抗原夹心法的特点在于包被和标记均为抗原，检测时，样品中的待检抗体首先与 标记抗原结合，再与包被抗原结合。其质控线应包被标记抗原的多抗，但实际检测中， 质控线的效果往往不好。
双抗原夹心法检测抗体的优点在于它检测的是总抗体，即样本中的 IgG、IgM、IgA 等特异性抗体均可作为搭桥抗体产生阳性结果，其对人兽共患病的检测更有价值，既可 检测人血清抗体，亦可检测动物血清抗体，从而实现用同一种检测试剂检测不同种属的 抗体。另外，双抗原夹心法的特异性和敏感度易于控制，并且可达到很高的水准。
免疫胶体金技术在医学检验中的应用研究
免疫胶体金技术在医学检验中的应用研究摘要：目的探讨免疫胶体金技术在医学检验领域的应用价值及发展前景。
方法随机选择本院2016年1月至2017年1月期间诊疗的500例患者, 结合免疫胶体金技术的运用, 对患者疾病类型予以加以诊断。
结果 500例患者中, 妊娠134例,包含早孕25例、梅毒47例;急性心肌梗死120例;蛋白尿患者23例;急性脑梗死78例;冠心病56例;脑膜炎40例;其它49例。
结论医学检验中, 免疫胶体金技术能够更好提高患者疾病诊断率, 为后续治疗工作的开展提供条件, 值得推广。
关键词：免疫胶体金技术; 医学检验; 应用与进展;胶体金法是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，使其具有光吸收性、呈色性和胶体性等特点。
而免疫胶体金技术 (Immune colloidal gold technique) 作为胶体金标记物, 将硝酸纤维素膜定义为固相载体, 依据滤膜的微孔滤过原理, 以此实现对抗原抗体的测定[1]。
鉴于此, 随机选择本院2016年1月至2017年1月期间诊疗的500例患者为研究对象, 探讨免疫胶体金技术在医学检验领域的应用价值及发展前景。
详细总结如下。
1 资料与方法1.1 一般资料随机选择本院2016年1月至2017年1月期间诊疗的500例患者, 男性患者283例、女性患者217例;最小年龄为15岁, 最大年龄为82岁, 年龄中位数为(48.5±3.5) 岁。
纳入标准:无任何禁忌症;自愿参与本次研究, 且已签署知情同意书;患者均具有自理能力。
1.2 方法于清晨对患者静脉血、尿液、粪便予以采集, 待相关处理完成后, 经免疫胶体金检验技术的运用, 对患者疾病类型加以诊断。
1.3 结果500例患者中, 妊娠134例, 包含早孕25例、梅毒47例;急性心肌梗死120例;蛋白尿患者23例;急性脑梗死78例;冠心病56例;脑膜炎40例;其它49例。
免疫组化常用方法介绍及个人经验总结
免疫组化常用方法介绍及个人经验总结1 、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。
2 、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。
3 、分类1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。
2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。
与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。
3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP 法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。
4 、目前几种常用免疫组化方法简单介绍1）免疫荧光方法是最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。
荧光免疫标记技术
适用于标记样品量少、蛋白含量低的抗体溶液，此法标记抗体比较 均匀，非特异性染色也比较少。
【主要试剂与器材】 1．器材 （1）铁立架、蝴蝶夹、层析柱、洗脱瓶、搅拌器、磁棒、
紫外分光光度计 （2）烧杯、试管、滴管、吸管、洗耳球、pH试纸、黑纸 2．试剂 （1）抗体 （2）异硫氰基荧光黄（FITC） （3）葡聚糖凝胶（Sephadex G-25） （4）pH9.5，0. 5M 碳酸缓冲液 （5）pH7.0，0.005M 磷酸缓冲液
免疫标记技术的应用 标记物与抗原、抗体的连接技术； 标记后的抗原、抗体进行特异性检测的实验设计原理 以及相应的检测仪器的使用方法。
免疫荧光标记技术（immunofluorescence technique）
是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应 的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量 的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗 体结合部位，检测出抗原或抗体。
荧光免疫标记技术
免疫标记（immunolabelling technic）
是指用一些易测定的、具有高度敏感性的标记物质：荧光素、放射 性核素、酶、胶体金、生物素、铁蛋白及化学（或生物）发光剂等作为 追踪物，标记特异性的抗原、抗体分子进行的抗原、抗体反应。
通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原、抗体的性 质与含量。并借助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微 镜和发光免疫测定仪等精密仪器对试验结果直接镜检观察或进行自动化 测定。
免疫荧光技术- 基本原理
免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微 示踪的精确性相结合。
以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但不 影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试 剂，用于检测和鉴定未知的抗原。
比较几种免疫检测的异同
免疫学课后作业比较几种免疫标记技术的异同。
答：根据标记物种类的不同，免疫标记技术可以分为放射免疫分析、酶标记免疫分析、荧光标记免疫分析、化学发光标记免疫分析、胶体金标记免疫分析技术，它们之间具有相同点，也有不同之处，现将其归纳如下。
一、相同点主要包括以下几个方面：1、均具有高特异性。
五种免疫标记技术的免疫技术都是采用抗原抗体反应，而抗原与抗体的结合是一一对应、特异性结合的，故它们都具有非常高的特异性。
2、均具有高灵敏性。
由于五种免疫标记技术的标记技术均采用示踪物标记，例如酶、放色性核素、荧光素、胶体金以及致密物质等，当与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体复合物本身，只需测定复合物中的标记物，通过化学或物理的手段使不见的反应放大，转化为可见的、可测知的光、色、电、脉冲等信号，并可借助仪器精密测定，从而间接测出微量的抗原或抗体。
3、检测对象相同。
除了放射免疫技术只能检测抗原外，其他四种免疫标记技术均可检测抗原或者抗体，即通过已知抗原(或抗体)特异性结合待测抗体（或抗原），从而定性或定量地测出抗体或抗原。
4、免疫标记的程序基本相同。
其包括纯化抗原或抗体、确定标记物质（即决定了最终的检测方式）、进行标记、对标记产物分离纯化和分析鉴定等一系列程序。
二、不同点主要包括以下几个方面：1、检测原理不一样。
首先，酶免疫技术是以酶标记的抗体（或抗原）作为主要试剂，将抗原-抗体反应的特异性和酶催化底物反应高效性和专一性结合起来的一种免疫方法，其对作为标记用的酶具有特定的要求，如活性高、纯度高等；放射免疫标记技术是以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法；免疫荧光技术是以荧光素作为标记物与已知的抗体或抗原结合，然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和坚定未知的抗原，其对用于标记的荧光素也有特定的要求，如荧光效率高，与蛋白质结合稳定，易于保存等；发光免疫分析技术是将发光分析与免疫反应相结合而建立的一种新型超微量分析技术，它是使用发光剂标记抗体（或抗原），通过发光检测抗原（或抗体）反应的免疫分析方法；免疫胶体金标记技术则是以胶体金作为示踪标记物，而胶体金在碱性环境中带负电荷，与抗体蛋白质分子的正电荷基团因静电而形成牢固结合应用于抗原抗体反应的一种新型免疫检测方法。
免疫胶体金技术在医学检验领域的运用
免疫胶体金技术在医学检验领域的运用摘要：免疫胶体金技术在医学领域中，具有广泛的运用前景。
文章对免疫胶体金技术进行介绍，同时探究了该项技术在医学检验领域的运用开展简单分析，对免疫胶体金技术的定性、定量的检测进行分析，并对该技术医学方面开展详细阐述。
关键词：免疫胶体金技术；医学检验；领域免疫胶体金技术是将胶体金作为示踪物，并放于硝酸纤维素载体中行过滤（滤膜），毛细血管作用下标记抗体（抗原），可在滤膜上特异性与配体结合，以此产生了显色（阳性）。
所以采用这种方法可进行抗原、抗体的定性、定量、半定量的检测[1]。
1 免疫胶体金技术检测分析1.1 定性检测免疫胶体金技术运用成熟，主要包括斑点免疫金渗滤-DIGFA、胶体金免疫层析-GICA这两种方法。
在医学领域中，这两种方法运用都比较成熟，主要优势在于有着较高的灵敏度，且检验时间不长，同时操作简单，在医学领域中常用[2]。
1.2 定量及半定量检测胶体金本身颜色为粉红或红色，可以通过肉眼及光学传感器，对检测色彩深浅度判断，达到定量以及半定量检测目的[3]。
2 免疫胶体金技术在医学领域中的运用2.1 DIGFADIGFA称之为斑点免疫金渗滤-DIGFA。
初次的筛选实验过程中，斑点免疫金渗滤-DIGFA是一种有效的方法。
在症状诊断中运用较好，且效果得到了肯定，目前运用前景好。
有研究人员在血清梅毒抗体检验方法选择时，运用斑点免疫金渗滤-DIGFA的特异度达到了百分百，灵敏度也高达94%。
效果明显。
同时，在粪便隐血检验运用中，与常用的邻苯胺法相比，斑点免疫金渗滤-DIGFA灵敏度以及抗干扰力更理想[4]。
2.2 GICAGICA称之为胶体金免疫层析-GICA。
在免疫层析检验法兴起的时代下，该方法起源上个世纪90年代末，使用者运用该技术进行阴道的念珠菌检测，具有极高的灵敏度以及特异性，这表现出的检验性质与传统的技术相比，效果更优。
该方法的现场检测可快速开展，效果好。
有研究者在诊断急性心肌梗死时，运用心肌三联胶体金法、心肌酶谱检测法，肌酸激酶同工酶灵敏度96.3%、肌钙蛋白灵敏度85.2%、肌红蛋白灵敏度100%，这说明了胶体金免疫层析技术联合运用法，在临床上诊断心肌梗死价值更实用，效果更好。
被动凝集法、间接免疫荧光法和胶体金法联合检测肺炎支原体抗体对儿童肺炎支原体感染的诊断价值
应用研究被动凝集法、间接免疫荧光法和胶体金法联合检测肺炎支原体抗体对儿童肺炎支原体感染的诊断价值王居鹏1，2，朱黎娜2，马明坤2，陈慧3，郭素香3，任丽1△摘要：目的分析被动凝集法（PA）、间接免疫荧光法（IFA）和胶体金法（GICT）联合检测对儿童肺炎支原体（MP）感染的诊断价值。
方法选取进行MP抗体检测的患儿617例，以临床诊断为判断标准，分为MP感染组（345例）和非MP感染组（272例）。
所有患儿均经PA检测MP总抗体，经IFA和GICT检测MP-IgM抗体。
分析PA、IFA和GICT 这3种方法单独检测及两两联合检测与临床诊断的一致性，受试者工作特征（ROC）曲线评价其对MP感染的诊断价值，分析PA联合IFA检测2组患儿抗体情况。
结果MP感染组PA检测MP总抗体、IFA和GICT检测MP-IgM抗体的阳性率较非MP感染组高（P＜0.01）。
PA检测MP总抗体的阳性检出率高于IFA和GICT检测MP-IgM抗体的阳性检出率（P＜0.01）。
PA联合IFA与临床诊断为中度一致（Kappa值=0.41，P＜0.05）。
3种方法单独检测和两两组合检测中PA联合IFA的曲线下面积、敏感度、总符合率、阴性预测值最高，阴性似然比最低。
GICT单独检测特异度最高。
IFA单独检测阳性预测值和阳性似然比最高。
当MP-IgM抗体阳性时，MP感染组23.44%的患儿总抗体滴度＜1︰160，非MP感染组47.22%的患儿总抗体滴度≥1︰160。
当MP-IgM抗体阴性时，MP感染组91.91%的患儿MP总抗体滴度≥1︰160，非MP感染组有73.50%的患儿总抗体滴度＜1︰160。
结论PA和IFA联合检测可为临床诊断儿童MP 感染提供更客观、准确的检测结果。
关键词：肺炎支原体；儿童；胶体金；免疫球蛋白M；荧光抗体技术，间接；被动凝集法；间接免疫荧光法中图分类号：R446文献标志码：A DOI：10.11958/20212561Diagnostic value of particle agglutination,indirect immunofluorescence assay and immunecolloidal gold technique combined detection for Mycoplasma pneumoniae antibody inchildren with Mycoplasma pneumoniae infectionWANG Jupeng1,2,ZHU Lina2,MA Mingkun2,CHEN Hui3,GUO Suxiang3,REN Li1△1Department of Clinical Laboratory,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical ResearchCenter for Cancer;Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin;Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Tianjin300060,China;2Department of Clinical Laboratory,3Department of Pediatrics,Second TeachingHospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine△Corresponding Author E-mail:*************.cnAbstract:Objective To analyze the diagnostic value of particle agglutination(PA),indirect immunofluorescence assay(IFA)and immune colloidal gold technique(GICT)combined detection for Mycoplasma pneumoniae(MP)infection in children.Methods A total of617children were selected for MP antibody detection,and children were divided into the MP infection group(345cases)and the non-MP infection group(272cases)based on clinical diagnosis.All the children were detected MP total antibody by PA,and MP-IgM antibody by IFA and GICT.The consistency of PA,IFA and GICT detection alone or in combination with clinical diagnosis was analyzed.The diagnostic value of receiver operating characteristic(ROC) curve in the diagnosis of MP infection was evaluated,and the antibody detection of PA combined with IFA was analyzed.Results The positive rate of total MP antibody detected by PA and MP-IgM antibody detected by IFA and GICT was higher in the MP infected group than those in the non-MP infected group(P＜0.01).The positive rate of total MP antibody detected by PA was significantly higher than MP-IgM antibody detected by IFA and GICT(P＜0.01).PA combined with IFA was moderately consistent with clinical diagnosis(Kappa=0.41,P＜0.05).The area under the curve of the diagnostic value,基金项目：国家自然科学基金资助项目（81904250）；天津市教委科研计划项目（2019KJ045）作者单位：1天津医科大学肿瘤医院检验科（邮编300060），国家肿瘤临床医学研究中心；天津市“肿瘤防治”重点实验室；天津市恶性肿瘤临床医学研究中心；2天津中医药大学第二附属医院检验科，3儿科作者简介：王居鹏（1990），男，主管技师，主要从事临床免疫学相关研究。
关于研究蛋白质细胞定位的几种方法
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的晶体结来自构window._bd_share_config={"mon":{"bdSnsKey
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不起那天都讲了什么，也不记得自己做了什么，但是，自始至终木子都没有和袁
体与抗原反应时，在光镜水平胶金液呈现鲜艳的 樱红色，不需加外进行染色。在电镜水平，金颗 粒具有很高的电子密度，清晰可辨。因此，免疫 电镜胶体金标记法近年来被成功地应用于生物 学的各个方面，并取得了可喜的进展。胶体金是 由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸等作用下， 聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成 为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。免疫胶体 金标记电镜技术广泛应用于细胞及组织内蛋白 的定位研究，是利用胶体金在碱性环境中带负电
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注意事项
（1）打开层析条包装后应在1h 内应用。 （2）将层析条插入样品中，样 品的液面不能超过试剂条的标记 线。
思考题
1、试述一步金法早早孕妊娠 诊断实验原理 2、金标法的优缺点？
实验结果讨论
试剂条质控线与测试线的色带可因 尿中hCG含量多少而显现出颜色深浅， 结果判定按上述标准进行。
对照线与检测线均不出现色带，表明 发生检测错误应重试；当HCG浓度很高 时检测线很明显，对照线可能变得很 弱，为正常结果； 子宫肿瘤、葡萄胎或更年期病人，因 尿中HCG含量较高，可能会出现阳性结 果。
实验原理
早早孕检测试剂采用双抗体夹心一步法 技术，以胶体金为指示标记，检测尿液 中HCG浓度。
原理ห้องสมุดไป่ตู้
实验方法
将试纸条从冰箱中取出，置室温 下放置一定时间，让其充分复温。 取出试纸条，将有箭头的一端插 入尿液中，其深度不得超过标志 线，约5s后取出平放，5min内观 察结果。
结果判断
T C
阳性 阴性
无效
实验结果
结果报告 待测标本HCG检测
性
阳性：两条紫红色条带出现。一条 位于测试区（T）内，另一条位于质 控区（C）。表明已怀孕 阴性：仅质控区（C）出现一条紫红 色条带，在测试区（T）内无紫红色 条带出现。表明未怀孕。
实验结果
弱阳性：5min内测试区（T）出现的 红色条带颜色浅于质控区的条带。表 示可疑，2天后重新检查，以免漏检 无效：测试区，质控区均无红色条带 标明试验失败或者试条失效。
实验七、胶体金、免疫荧光
实验内容
录像
一步金法早早孕妊娠诊断
一步金法早早孕妊娠诊断
实验原理 实验方法 实验结果与讨论 思考题
胶体金免疫层析
实验所用试剂全为干试剂，多个 试剂被结合在一个约6mm*70mm的 塑料板条上，试纸条两端附有吸 水材料，成为单一试条，实验过 程短，是“床边检验”的主要方 法之一。