免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)
PCT胶体金试纸制备及其原理
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5、PCT胶体金试纸样品垫和金标垫处理
样品垫和金标垫的处理方式一样，都是将切割好的样品垫（玻纤膜-有些脆， 需小心）和金标垫（聚酯膜）浸泡在处理液中1小时，使其彻底湿润。（半小时 需用镊子翻一次面）
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3、常用的免疫胶体金检测技术
（1）免疫胶体金光镜染色法 （2）斑点免疫金渗滤法 （3）胶体金免疫层析法
将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗 体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前 移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区 域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上， 可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。
PCT胶体金试纸制备及其原理
2016年6月3号
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胶体金（colloidal gold）也称金溶胶（gold solution）： 是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗 粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层 构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12－）， 外层双层正离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶 体金游离于溶胶间的悬液状态。
胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用 下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体 金。
胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由
免疫胶体金法实验流程
免疫胶体金法实验流程(中英文实用版)英文文档内容：Immunogold Colloidal Gold Assay Experimental ProcedureThe immunogold colloidal gold assay is a widely used technique in immunochemistry, introduced by Faulk and Taytor in 1971.This method has gained increasing application in various fields of biomedical research.The main applications in medical testing include immunochromatography and rapid immunogold filtration assay (DIGFA), which are used for the detection of HBsAg, HCG, and anti-double-stranded DNA antibodies, among others.This assay is characterized by its simplicity, rapidity, accuracy, and lack of pollution.The immunogold colloidal gold assay is based on the synthesis of gold nanoparticles from chloroauric acid (HAuCl4) in the presence of reducing agents such as white phosphorus, ascorbic acid, sodium citrate (柠檬酸钠), and tannic acid.These gold nanoparticles are formed with a certain size and stabilized in a colloidal state due to electrostatic interactions, resulting in a negatively charged hydrophobic colloidal solution.The colloidal gold is considered an ideal immunological marker for immunoelectron microscopy.To perform the immunogold colloidal gold assay, the following experimental procedure is typically followed:1.Prepare the gold nanoparticles by reducing chloroauric acid with a suitable reducing agent.bel the target antigens or antibodies with the gold nanoparticles.3.Coat the gold-labeled antigens or antibodies onto a solid support, such as a nitrocellulose membrane or a microplate.4.Prepare the sample containing the target analyte to be tested.5.Perform the immunochromatography or rapid immunogold filtration assay according to the manufacturer"s instructions.6.Interpret the results by visualizing the presence or absence of the target analyte on the solid support.This assay provides a rapid and sensitive method for the detection and characterization of various biological targets, making it an essential tool in diagnostic medicine and research.中文文档内容：免疫胶体金法实验流程免疫胶体金法是一种在免疫化学中广泛应用的技术，由Faulk和Taytor在1971年引入。
《免疫胶体金技术》课件
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实验仪器：离心机、电泳仪、显微 镜、移液器等
实验注意事项：避免污染、控制温 度、保持湿度等
实验步骤
准备实验材料： 制备胶体金溶 制备抗体溶液： 制备抗原溶液：
包括胶体金、 液：将胶体金 将抗体与缓冲 将抗原与缓冲
抗体、抗原、 与缓冲液混合， 液混合，搅拌 液混合，搅拌
缓冲液等
搅拌均匀
提高稳定性：通过优化实验条件、选择稳定的检测试剂等方法，提高检测结果的稳定性
提高自动化程度：通过开发自动化检测设备，提高检测效率和准确性
免疫胶体金技术的实验操作
实验准备
实验材料：胶体金、抗体、抗原、 缓冲液、洗涤液、显色剂等
实验步骤：样本处理、抗体孵育、 胶体金标记、洗涤、显色等
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云计算和大数据技术：实现 检测数据的实时分析和共享
检测灵敏度提升
技术进步：通过改进胶体金颗粒的制备工艺，提高检测灵敏度
应用领域：在生物医学、食品安全、环境监测等领域具有广泛应用前景
技术融合：与其他检测技术相结合，提高检测灵敏度和准确性
发展趋势：随着科技的发展，免疫胶体金技术的检测灵敏度将不断提高，应用范围也将不 断扩大。
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免疫胶体金技术
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单击输入目录标题 免疫胶体金技术概述 免疫胶体金技术的分类 免疫胶体金技术的优缺点 免疫胶体金技术的实验操作 免疫胶体金技术的应用实例
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免疫胶体金技术概述
定义和原理
免疫胶体金技术是一种基于免疫反应的检测技术 原理：利用抗原-抗体特异性结合，通过胶体金标记抗体，实现对目标抗原 的检测 特点：灵敏度高、特异性强、操作简便、快速
免疫胶体金技术及其应用
免疫胶体金技术及其应用齐颖颖【摘要】Immune colloidal gold technique has developed rapidly in recent years, and applied range field of applications. This paper summarizes the technical principles, preparation methods, widely us age, analyzes and proposes of the existing problems. In addition, it analyses the exislent problems. and raises prospects on those problems.%免疫胶体金技术近年来发展迅速，应用范围极广。
本文综述了免疫胶体金技术原理、制备方法及其广泛应用，分析了存在的问题，并针对其存在问题提出展望。
【期刊名称】《河北省科学院学报》【年(卷),期】2011(028)004【总页数】4页(P36-39)【关键词】免疫胶体金技术;制备;应用【作者】齐颖颖【作者单位】河北省科学院生物研究所,河北石家庄050081【正文语种】中文【中图分类】Q78免疫胶体金技术（ICG）是以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应，在光镜电镜下对抗原或抗体物质进行定位，定性乃至定量研究的标记技术。
1962年Feldherr第一次介绍了胶体金可作为一种电子显微镜水平的示踪记物。
1971年，Faulk和Taylor［1］首次用免疫金标技术研究沙门氏菌壁细胞抗原成分，将胶体金与抗体结合用于电镜水平的免疫细胞化学研究，这一年被公认为免疫胶体金技术诞生年。
1974年Romano EL等将胶体金属标记在马抗人的IgG上，实现了间接免疫金染色法。
1974年Bauer H等报道凝集素－金复合物的应用。
1978年Geoghe－gan WD等应用免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原。
胶体金
(二) 方法类型 • 1．双抗体夹心法 用抗体结合在微孔滤 膜中央，滴加待检标本，若标本中待测 抗原则与膜上抗体结合，然后滴加金标 抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即在膜 中央呈红色斑点（胶体金聚集）。 • 2．间接法 用抗原包被在微孔滤膜上，滴 加待测标本，滴加洗涤液洗涤后, 滴加金 标抗抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即 在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。 该法由于血清标本中非目的IgG的干扰, 易导致假阳性结果,临床上较少用。
(二) 方法类型
• 1.双抗体夹心法 若图20-2所示，G处为金标抗 体(免疫金)，T处包被抗体，C处包被抗金标抗 体，B处为吸水纸。测试时A端滴加待测标本， 通过层析作用，待测标本向B端移动，流经G 处时将金标抗体复溶，若待测标本中含待测抗 原，即形成金标抗体-抗原复合物，移至T区时， 形成金标抗体-抗原-抗体复合物，金标抗体被 固定下来，在T区显示红色线条，呈阳性反应， 多余的金标记抗体移至C区被抗金标抗体捕获， 呈现红色质控线条。
• 1.胶体金的结构 胶体金（colloidal gold） 也称金溶胶（gold solution），是由金盐 被还原成原金后形成的金颗粒悬液。 胶 体金颗粒由一个基础金核（原子金Au） 及包围在外的双离子层构成，紧连在金 核表面的是内层负离子（AuC12－）， 外层离子层H+则分散在胶体间溶液中， 以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。
• 3．间接法 为了消除待测血清标本中 大量的非特异性IgG与特异性IgG竞 争结合金标记抗人IgG，降低了试验 敏感性，胶体金间接免疫层析法测 抗体常设计成反流免疫层析法(图204)。
•
测试卡分成可左右折叠的两部分，右面中央纵向贴有 NC膜条为膜上包被有抗原线T，E处为含能与蛋白结 合的有色染料的标本加样区，F处吸水材料；左面中央 开有观察窗口B，C处固定有金标记羊抗人抗体，A、 D处为吸水材料。测定时先将缓冲液加在D处层析至C 处使金标物复溶，然后将标本加在E处使其与染料一 起在膜的层析作用下向F端移动，若标本中有待测抗体 存在，则与膜上抗原结合形成抗原抗体复合物，待有 色染料延伸至膜上标记线G处时，在F处加缓冲液，合 上测试卡，A处的强大吸水作用使膜上液体反向流动， 标本中非特异性IgG及无关物向E处反向层析，随后而 来的金标羊抗人抗体与抗原抗体复合物结合，出现棕 红色线条。无棕红色线条出现则表明血清中无特异性 抗体。该法有效地排除了非特异性抗体对测试的干扰。
免疫胶体金的技术
2. 凝胶过滤法
u 将探针溶液装入透析袋内， 4℃ ，置于硅胶或聚乙 二醇中浓缩至原体积的1 4～1 5 u 离心 1500 r min，20min 弃沉淀 u 经Sephacryl（丙烯葡聚糖）S400层析柱分离纯化。 用0.02mol/L TBS(0.1%BSA)洗脱 ? TBS的PH根据蛋白质种类而定 u 按红色深浅分管收集洗脱液
1. 光镜免疫金银法 3 在免疫金染色的基础上增加物理显影的步骤 3 显影液的配制及显影过程应在暗处进行 3 阳性部位呈黑色颗粒状 32. 电镜免疫金银法 3 包埋前染色, 包埋后染色
【IGSS法优点】
1. 可被用于光镜和电镜观察 2. 敏感性高 3. 定位准确 4. 背景清晰, 对比度好 5. 方法简便, 安全 6. 成本较低, 标本可长期保存
【常用还原剂】柠檬酸钠、鞣酸、白磷等
柠檬酸钠还原制备的金颗粒直径较大，15~150nm
白磷还原制备的金颗粒直径较小，3~12nm
【具体制备方法】
（二）影响溶胶稳定性的因素 u 电解质 u 胶体金浓度 u 温度 u 大分子物质
（三）胶体金的鉴定
【鉴定方法】在电镜下观察金颗粒的大小 及金颗粒的均匀程度
( 七) 标记探针的鉴定
1. 负染色检查: 将胶体金溶液滴在覆有
Formavar膜( 支持膜) 的镍网上, 空气中干燥, 醋 酸铀负染, 透射电镜下观察
2. 生物活性鉴定: 可用直接或间接法放射免疫
测定, 凝聚试验及免疫组化染色进行鉴定
四. 免疫胶体金染色方法
( 一 ) 免疫金染色法
Immunogold staining, IGS
( 五）标记
1. 计算所需待标记蛋白质的总量
根据用以标记的胶体金溶液总体积及所测定的最 适蛋白质稳定量，计算出所需待标记蛋白质的总量
胶体金技术
免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)文章来源： 文章作者： 发布时间：2007-04-24 字体： [大 中 小]（一） 原理 免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。
胶体金是由氯金酸（HAuCl 4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。
胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。
胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA 、PHA 、ConA 等。
根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
（二） 胶体金的制备根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。
常用来制备胶体金颗粒的方法如下。
1．枸橼酸三钠还原法（1）10nm 胶体金粒的制备：取0.01％HAuCl 4水溶液100ml ，加入1％枸橼酸三钠水溶液3ml ，加热煮沸30min ，冷却至4℃，溶液呈红色。
（2）15nm 胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl 4水溶液100ml ，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml ，加热煮沸15min ～30min ，直至颜色变红。
冷却后加入0.1Mol/L K 2CO 30.5ml ，混匀即可。
（3）15nm 、18nm ～20nm 、30nm 或50nm 胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl 4水溶液100ml ，加热煮沸。
根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml 、2.5ml 、1ml 或0.75ml ，继续煮沸约5min ，出现橙红色。
这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm 、18～20nm 、30nm 和50nm 。
免疫胶体金技术
免疫胶体金技术(一) 原理免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。
胶体金是由氯金酸(HAuCl)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并4由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。
胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。
胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。
根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
(二) 胶体金的制备根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。
常用来制备胶体金颗粒的方法如下。
1(枸橼酸三钠还原法(1)10nm胶体金粒的制备:取0.01,HAuCl水溶液100ml，加入1,枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮4沸30min，冷却至4?，溶液呈红色。
(2)15nm胶体金颗粒的制备:取0.01,HAuCl水溶液100ml，加入1,枸橼酸三钠水溶液2ml，加热4煮沸15min,30min，直至颜色变红。
冷却后加入0.1Mol/L KCO0.5ml，混匀即可。
23(3)15nm、18nm,20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备:取0.01,HAuCl水溶液100ml，加热煮4沸。
根据需要迅速加入1,枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。
这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18,20nm、30nm和50nm。
2(鞣酸—枸橼酸钠还原法A液:1,HAuCl水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。
4B液:1,枸橼酸三钠4ml，1,鞣酸0.7ml，0.1Mol/L KCO液0.2ml，混合，加入双馏水至20ml。
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（2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜（0.45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。
（3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。
（4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。
最好是进口的。
（5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。
（三）胶体金标记蛋白的制备
胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。
如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。
除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。
1、待标记蛋白溶液的制备将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1h，去除聚合物。
2、待标胶体金溶液的准备以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。
标记IgG时，调至9.0；标记McAb时,调至8.2；标记亲和层析抗体时，调至7.6；标记SPA 时，调至5.9～6.2；标记ConA时，调至8.0；标记亲和素时，调至9～10。
由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。
3、胶体金与标记蛋白用量之比的确定
（1）根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml。
（2）将标记蛋白（以IgG为例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为
5µg/ml～50µg/ml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。
对照管只加1ml稀释液。
（3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。
（4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。
以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10％～20％。
4、胶体金与蛋白质（IgG）的结合将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。
常用稳定剂是5％胎牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。
加入的量：5％BSA使溶液终浓度为1％；1％聚乙二醇加至总溶液的1／10。
5、胶体金标记蛋白的纯化
（1）超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。
用BSA做稳定剂的胶体金—羊抗兔IgG结合物可先低速离心（20nm金胶粒用1
200r/min，5nm金胶粒用1 800r/min）20min，弃去凝聚的沉淀。
然后将5nm胶体金结合物用6 000g，4℃离心1h；20nm～40nm胶体金结合物，14 000g，4℃离心1h。
仔细吸出上清，沉淀物用含1％BSA的PB液（含0.02％NaN3），将沉淀重悬为原体积的1／10，4℃保存。
如在结合物内加50％甘油可贮存于-18℃保存一年以上。
为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一步用10％～30％蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。
（2）凝胶过滤法：此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。
将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的1／5～1／10。
再经1 500r/min 离心20min。
取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝胶S-400）层析柱分别纯化。
层析柱为0.8 cm×20cm，加样量为床体积的1／10，以0.02Mol/L PBS液洗脱（内含0.1％BSA，0.05％NaN3，pH8.2者用IgG标记物），流速为8ml/h。
按红色深浅分管收集洗脱液。
一般先滤出的液体为微黄色，有时略混浊，内含大颗粒聚合物等杂质。
继之为纯化的胶体金蛋白结合物，随浓度的增加而红色逐渐加深，清亮透明，最后洗脱出略带黄色的为标记的蛋白组分。
将纯化的胶体金蛋白结合物过滤除菌、分装,4℃保存。
最终可得到70％～80％的产量。
6、胶体金蛋白结合物的质量鉴定
（1）胶体金颗粒平均直径的测量：用支持膜的镍网（铜网也可）蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。
或用醋酸铀复染后观察。
计算100个金颗粒的平均直径。
（2）胶体金溶液的OD520nm值测定：胶体金颗粒在波长510nm～550nm之间出现最大吸收值峰。
用0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含1％BSA，0.02％NaN3）将胶体金蛋白试剂作1︰20稀释，OD520＝0.25左右。
一般应用液的OD520应为0.2～0.4。
（3）金标记蛋白的特异性与敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色法（MF－IGSSA）。
将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜），用胶体金标记的抗体（或抗原）以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。
（四）胶体金标记技术在免疫学中的应用
胶体金标记技术由于标记物的制备简便，方法敏感、特异，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，它的应用范围广，除应用于光镜或电镜的免疫组化法外，更广泛地应用于各种液相免疫测定和固相免疫分析以及流式细胞术等。
1、液相免疫测定：将胶体金与抗体结合，建立微量凝集试验检测相应的抗原，如间接血凝一样，用肉眼可直接观察到凝集颗粒。
利用免疫学反应时金颗粒凝聚导致颜色减退的原理，建立均相溶胶颗粒免疫测定法（Sol particle immunoassay ,SPIA）已成功地应用于PCG 的检测，直接应用分光光度计进行定量分析。
2、金标记流式细胞术：胶体金可以明显改变红色激光的散射角，利用胶体金标记的羊抗鼠Ig抗体应用于流式细胞术，分析不同类型细胞的表面抗原，结果胶体金标记的细胞在波长632nm时，90度散射角可放大10倍以上，同时不影响细胞活性。
而且与荧光素共同标记，彼此互不干扰。
3、胶体金固相免疫测定法
（1）斑点免疫金银染色法（Dot－IGS／IGSS）是将斑点ELISA与免疫胶体金结合起来的一种方法。
将蛋白质抗原直接点样在硝酸纤维膜上，与特异性抗体反应后，再滴加胶体金标记的第二抗体，结果在抗原抗体反应处发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的红色斑点，此称为斑点免疫金染色法（Dot－IGS）。
此反应可通过银显影液增强，即斑点金银染色法（Dot －IGS／IGSS）。
（2）斑点金免疫渗滤测定法（dot immuno－gold filtration assay,DIGFA）此法原理完全同斑点免疫金染色法，只是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。
在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。
此方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（HIV）的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。