免疫胶体金技术影响因素分析_张付贤
免疫胶体金技术常见影响因素分析
免疫胶体金技术常见影响因素分析自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。
免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。
而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。
1耗材的选择1.1不同型号膜的筛选。
硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。
不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径和分布结构不同。
膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高。
用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。
1.2结合垫的选择。
结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。
1.3样品垫及吸水纸的选择。
样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。
试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。
如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。
《免疫胶体金技术》课件
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实验仪器：离心机、电泳仪、显微 镜、移液器等
实验注意事项：避免污染、控制温 度、保持湿度等
实验步骤
准备实验材料： 制备胶体金溶 制备抗体溶液： 制备抗原溶液：
包括胶体金、 液：将胶体金 将抗体与缓冲 将抗原与缓冲
抗体、抗原、 与缓冲液混合， 液混合，搅拌 液混合，搅拌
缓冲液等
搅拌均匀
提高稳定性：通过优化实验条件、选择稳定的检测试剂等方法，提高检测结果的稳定性
提高自动化程度：通过开发自动化检测设备，提高检测效率和准确性
免疫胶体金技术的实验操作
实验准备
实验材料：胶体金、抗体、抗原、 缓冲液、洗涤液、显色剂等
实验步骤：样本处理、抗体孵育、 胶体金标记、洗涤、显色等
添加标题
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云计算和大数据技术：实现 检测数据的实时分析和共享
检测灵敏度提升
技术进步：通过改进胶体金颗粒的制备工艺，提高检测灵敏度
应用领域：在生物医学、食品安全、环境监测等领域具有广泛应用前景
技术融合：与其他检测技术相结合，提高检测灵敏度和准确性
发展趋势：随着科技的发展，免疫胶体金技术的检测灵敏度将不断提高，应用范围也将不 断扩大。
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免疫胶体金技术
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单击输入目录标题 免疫胶体金技术概述 免疫胶体金技术的分类 免疫胶体金技术的优缺点 免疫胶体金技术的实验操作 免疫胶体金技术的应用实例
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免疫胶体金技术概述
定义和原理
免疫胶体金技术是一种基于免疫反应的检测技术 原理：利用抗原-抗体特异性结合，通过胶体金标记抗体，实现对目标抗原 的检测 特点：灵敏度高、特异性强、操作简便、快速
免疫胶体金法快速检测水产品中喹诺酮类药
免疫胶体金法快速检测水产品中喹诺酮类药引言近年来，随着水产品加工业的迅猛发展，水产品中喹诺酮类药物残留的问题日益凸显，给人民群众的健康带来了严重的危害。
开发一种高灵敏度、高特异性、快速检测水产品中喹诺酮类药物的方法迫在眉睫。
免疫胶体金法是一种新型的生物技术手段，具有快速、简便、低成本等优点，被广泛用于食品、水产品等领域的药物残留检测。
本文介绍了免疫胶体金法在水产品中喹诺酮类药物残留检测方面的应用和发展。
一、喹诺酮类药物的概述喹诺酮类药物是一类广谱抗生素，主要用于预防和治疗动物细胞内寄生虫、细菌等疾病。
目前已有多种喹诺酮类药物被广泛应用于水产品养殖过程中，以控制和预防水产品中的细菌和寄生虫感染。
而由于水产品中残留的药物对人体健康造成一定程度的危害，开发一种快速、灵敏的方法用于检测水产品中喹诺酮类药物是非常必要的。
二、免疫胶体金法的概述免疫胶体金法是一种利用金纳米颗粒和抗体等生物标记物相结合的技术，通过颜色变化的方式来检测A检测物在样品中的存在和浓度的一种方法。
它具有快速、简便、低成本等优点，被广泛用于食品、水产品等领域的药物残留检测。
三、免疫胶体金法在水产品中喹诺酮类药物残留检测中的应用免疫胶体金法在水产品中喹诺酮类药物残留检测方面具有一定的优势和应用前景。
该方法具有高灵敏度，可以检测到极低浓度的喹诺酮类药物残留；该方法具有高特异性，可以准确鉴别水产品中的喹诺酮类药物；该方法操作简便，不需要复杂的仪器和技术支持，可以在实验室和现场快速进行检测；该方法成本低廉，适合大规模生产和应用。
结论免疫胶体金法是一种快速、简便、低成本的药物残留检测方法，在水产品中喹诺酮类药物残留检测中具有广阔的应用前景。
相信随着技术的不断创新和发展，免疫胶体金法将为保障水产品质量和人民群众的健康提供更可靠的技术支持。
免疫胶体金技术常见影响因素分析
免疫胶体金技术常见影响因素分析自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。
免疫胶体金技术的反应过程就是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。
而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响与制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。
1耗材的选择1、1不同型号膜的筛选。
硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。
不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物与表面活性剂的来源、类型与数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径与分布结构不同。
膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但就是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就就是假阳性越高。
用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小与分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。
1、2结合垫的选择。
结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物与待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。
1、3样品垫及吸水纸的选择。
样品垫与吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。
试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫与吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。
如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸与样品垫。
免疫胶体金技术常见影响因素分析
免疫胶体金技术常见影响因素分析免疫胶体金技术是一种常用的生物检测方法，主要通过胶体金纳米颗粒与抗原或抗体的特异性结合反应来实现对目标物质的检测和定量分析。
然而，在实际应用过程中，免疫胶体金技术的结果往往受到多种影响因素的影响。
下面将对免疫胶体金技术常见的影响因素进行分析。
首先，溶液的pH值是影响免疫胶体金技术的重要因素之一、在免疫胶体金技术中，溶液的pH值对胶体金纳米颗粒的稳定性和表面电荷有一定的影响。
一般来说，胶体金纳米颗粒在弱酸性条件下比较稳定，而在碱性条件下容易发生凝聚。
因此，在实验过程中，选择合适的缓冲液来调节溶液的pH值是非常重要的。
其次，离子强度也是影响免疫胶体金技术的重要因素之一、离子强度的增加会导致胶体金纳米颗粒表面的电荷屏蔽，从而使胶体金纳米颗粒发生凝聚。
为了解决这个问题，可以通过加入适当的离子强度调节剂来降低离子强度，从而增加胶体金纳米颗粒的稳定性。
此外，胶体金纳米颗粒的浓度也会对免疫胶体金技术的结果产生影响。
在浓度较高时，胶体金纳米颗粒之间的空间距离较小，容易发生凝聚，从而影响检测结果的准确性。
因此，在实验操作中，需要根据具体情况调整胶体金纳米颗粒的浓度，以确保检测结果的可靠性。
此外，免疫胶体金技术中还涉及到抗体或抗原的结合效率。
免疫反应的结合效率受到多种因素的影响，例如抗体或抗原的浓度、结合时间、温度等。
因此，在进行免疫反应时，需要对这些因素进行优化，以提高结合效率和准确性。
最后，非特异性吸附也是影响免疫胶体金技术的重要因素之一、在实际应用中，样品中存在的其他非目标物质往往会与胶体金纳米颗粒发生非特异性吸附，形成背景信号。
因此，在进行实验前，需要对样品进行预处理，如去除杂质、选择合适的探针等，以减少非特异性吸附的影响。
综上所述，免疫胶体金技术的结果可能受到溶液的pH值、离子强度、胶体金纳米颗粒浓度、抗体或抗原的结合效率以及非特异性吸附等影响因素的影响。
在实际应用中，需要认真分析和处理这些影响因素，以提高免疫胶体金技术的准确性和可靠性。
免疫胶体金技术常见影响因素分析
免疫胶体金技术常见影响因素分析自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。
免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。
而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。
1耗材的选择1.1不同型号膜的筛选。
硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。
不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径和分布结构不同。
膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高。
用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。
1.2结合垫的选择。
结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。
1.3样品垫及吸水纸的选择。
样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。
试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。
如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。
免疫胶体金法的影响因素
免疫胶体金法的影响因素
免疫胶体金法（Immunochromatographic Assay）是一种常用于
快速、简便、阳性结果可直观观察的免疫分析方法。
其影响因素包括：
1. 样品稀释系数：适当的样品稀释系数能够避免高浓度样品的背景干扰，同时保证所检测物质的有效浓度。
2. 抗原抗体反应性：抗原和抗体的选择和质量对免疫胶体金法的灵敏度和特异性有重要影响。
3. 膜滤纸的选择：膜滤纸是免疫胶体金法的重要组成部分，其表面性质和孔径大小决定了反应物质的传输速率和分离效果。
4. 胶体金颗粒的性质：胶体金颗粒的大小、浓度和稳定性直接影响了免疫胶体金法的灵敏度和稳定性。
5. 反应时间：反应时间的选择直接影响了胶体金颗粒在膜滤纸上的迁移速率和反应的充分性。
6. pH和离子强度：适当的pH和离子强度有助于提高免疫胶
体金法的灵敏度和特异性。
7. 操作技巧：正确操作和使用标准操作程序能够减少人为误差，提高免疫胶体金法的准确性和可重复性。
免疫胶体金技术及其在兽医临床上的应用
免疫胶体金技术及其在兽医临床上的应用免疫胶体金技术在人类医学上是一种常用的免疫标记技术，有其独特的优点。
近几年来在生物医学各领域中得到了日益广泛的应用。
目前该技术在医学检验中的应用主要是胶体金快速免疫层析法(colloidal gold enhanced immunochronmtography assay，CGEIA)和快速斑点免疫金渗滤法(dot-immunogold filtration assay，DIGFA)，用于检测人类乙肝表面抗原、人绒毛膜促性腺激素、艾滋病病毒等。
近几年随着该技术的不断发展，已在兽医临床上得到了广泛应用，具有简便、快速、灵敏、特异性高和无污染等优点。
1胶体金的制备及基本原理1.1胶体金的发现1857年，法拉第用还原法从氯金酸水溶液中制备胶体金，并发现在其中加入少量电解质后，可使胶体金由红色变为蓝色，最终凝集成无色，而加入明胶或其他大分子物质便可阻止这种变化，他的重大发现奠定了胶体金制备和应用的科学基础。
直至1971年Faulk W P等[1]将胶体金引入免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学领域得到了日益广泛的应用[2-3]。
1.2胶体金的制备胶体金是通过在氯金酸水溶液中加入还原剂使之还原并聚集形成胶体金粒子而形成的。
使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小，即粒子的大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。
还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯金酸水溶液的还原也就从更多的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，体积也越小。
粒子直径每增加1倍，数量减为原来的1/8。
目前，制备胶体金的方法有许多种，根据时间的先后，依次为抗坏血酸还原法、柠檬酸三钠还原法、乙醛超声波还原法、放射性胶体金法、硼氢化钠还原法、鞣酸-柠檬酸三钠还原法、白磷还原法及白磷还原法的改良法和微波制备胶体金法。
根据不同的制备方法，可以制备出直径1 nm～500 nm的胶体金粒子，但作为免疫标记探针，其直径一般在3 nm～50 nm的范围内。
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免疫胶体金技术影响因素分析张付贤1,2,王兴龙2(1.吉林大学农学部畜牧兽医学院,长春 130062;2.军事医学科学院军事兽医研究所,长春 130062)摘要:免疫胶体金技术以其快速、准确、简捷的特点,受到国内外科研工作者及基层工作人员的普遍关注。
笔者从耗材的选择、胶体金的制备及标记、膜包被条件、缓冲液和产品保存及验证等方面分析免疫胶体金技术的影响因素,为制备胶体金检测产品提供理论依据和技术参考。
关键词:免疫胶体金技术;影响因素;选择;检测中图分类号:Q-33 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2009)05-0199-04 自20世纪70年代,Faulk等(1971)用胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。
免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。
而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。
1 耗材的选择1.1 不同型号膜的筛选 硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。
不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响—膜的孔径和分布结构不同。
膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高(李云等,2002)。
用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标收稿日期:2008-11-28作者简介:张付贤(1982-),男,河南人,硕士,研究方向:兽医微生物与免疫学。
通信作者:王兴龙(1959-),男,吉林人,博导,从事分子免疫学研究。
E-mail:w ang xl-2006@基金项目:吉林省科技厅计划项目(20050549)。
记物在膜上的流动速率为最佳(邓省亮等,2007)。
1.2 结合垫的选择 结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附(张美玲,2006);玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。
1.3 样品垫及吸水纸的选择 样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。
试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。
如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。
吸水纸则要有很好的蓄水能力,保证样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸收和蓄积。
2 关于胶体金的制备制备颗粒均匀、分散度好的胶体金在金标免疫快速试验中非常关键,如果金颗粒直径的变异范围太大就会影响到试验的稳定性和重复性,如果金颗粒的形状不规则或粒径不均一,使得胶体金标记物容易解离和沉淀而产生金标扩散不完全、反应区底色过深和假阳性现象;而且胶体金质量不好,胶体金结合物就不能快速而完整的从玻璃纤维上解离,从而影响试验结果(Bassab等,2001)。
胶体金的制备除了保证药品的质量外,制备过程中的细节关乎胶体金制备的成败。
首先是操作环境和所用容器的清洁度(翟雷等,1996)。
所有进入溶胶内的污物都会干扰胶体金颗粒的生成或使生成的胶体金出现聚堆现象,容器最好经酸洗和硅化处理。
操作环境应保持清洁无尘粒,最好有专用工作区。
其次,配制溶液均需使用双蒸水或三蒸去离子水配制,烧制胶体金最好用去离子水。
再者是不同的还原剂对胶体金质量的影响。
胶体金制备基于还原法,改变还原剂的性质和浓度,可制备粒径不同的胶体金悬液。
根据试验目的选择胶体金的粒径,根据选择的粒径确定还原剂,如制备金颗粒直径在5～12nm的胶体金溶液用白磷或抗坏血酸还原氯金酸;如制备大于12nm直径的金颗粒的胶体金则用柠檬酸三钠还原氯金酸。
此外不同的烧制方法、胶体金的制备量、还原剂的加入方式、加热容器的大小及加热的时间等也影响胶体金颗粒的大小和均一性(唐景峰,2006)。
根据所需胶体金的粒径和数量,结合自身试验条件选择合适的胶体金制备方法。
3 标记蛋白与相关抗原、抗体的制备标记蛋白、T线和C线的抗原或者抗体的纯度和浓度直接影响金标探针的质量。
获得纯度高、浓度适中的抗原、抗体,关键在于制备和纯化方法的选择及条件的优化。
试验前须采用高速离心去杂质,应用饱和硫酸铵沉淀、亲和层析、透析除盐等一系列处理方法,尽可能去除单克隆抗体、二抗和相关蛋白溶液中的高浓度的杂质和多余离子,避免其干扰目的蛋白与胶体金的吸附结合,或导致胶体金粒子的凝聚(李希友,2006);特别是硼酸盐和磷酸盐不利于胶体金和蛋白的结合,应尽量避免接触。
同时,充分处理各种大分子蛋白,使其尽量分散为单体和具有适当的分子质量,提高胶体金与蛋白质的结合比,便于与胶体金充分而稳定的结合。
4 胶体金的标记胶体金标记的两个关键环节是标记时的pH和最佳蛋白质标记量的确定(吴海波,2006)。
根据胶体金标记的原理,只有在pH接近和稍高于蛋白质的等电点时,胶体金蛋白质的吸附力最强;pH过高过低都不利于两者的结合,因此标记时选择精密的酸碱度测定仪器或者试纸条,采用不同方法重复校正,并进行梯度试验找到最佳的标记pH。
溶胶与被标蛋白质的用量比例是否合适是影响标记成功的一个重要因素。
过多蛋白质标记,造成浪费的同时引起试纸的拖带现象;过少蛋白质标记,导致胶体金标记不完全,从而降低试纸的灵敏度及假阳性现象的出现。
也需要在试验中进行梯度试验,反复比较不同标记量的标记物在破坏试验中的稳定性,确定最佳的标记量(邓省亮等,2007)。
5 膜包被条件的优化处理膜的包被条件,包括膜的封闭、环境的湿度、T 线和C线上抗原或抗体的浓度、点膜条件、温度、包被时间等,需要结合试验实际情况进行反复调整。
包被过程中需要特别注意以下两点:①膜上T线和C线抗原或抗体的包被量要相对饱和;②包被后的膜一定要在适宜的温度下彻底干燥,否则会造成拖带、显色不清晰,灵敏度也大受影响(张辉,2008)。
5.1 封闭 对使用的膜进行处理,特别是进行封闭是一个十分有争议的问题,理论上来说购买回的膜基本上都是已经优化处理好的,直接点膜就可使用。
如果点膜前将膜浸泡在封闭液内进行封闭处理,必然扰乱了膜内正常的物质分布,由此引发了许多不必要的麻烦。
但是如果在实际的试验操作过程中,发现没有进行封闭的膜出现非特异性条带或者出现拖带现象,或遇到膜不封闭就无法将蛋白质或抗体包被在膜上的问题,就应考虑封闭问题。
建议在制作试纸条过程中根据各自标记物的性质及其在膜上的显色情况来选择封闭与否,如果标记效果比较好且在膜上显色清晰而无拖带及假阳性现象出现,则完全没有必要进行膜的封闭。
反之,可进行膜的封闭,查找不理想现象出现的原因。
用来对膜进行封闭的物质很多,多选用大分子蛋白质如牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEGM W20000)等(戴荣四, 2004)。
常用的封闭方法有流动封闭和膜上定点封闭,前者将封闭物处理在样品垫上,后者将作用物质配成溶液喷涂在膜的特定位置上。
5.2 环境湿度 环境湿度对点膜过程非常重要。
最佳湿度一般在45%～65%。
湿度过低,膜上容易聚集静电荷,点膜容易出现散点,导致测试时出现疏水斑;湿度过高,膜上毛细作用加强,点膜容易引起T线、C线变宽甚至扩散。
为了保证点样时膜湿度的均一性,一般在点样前把膜放到该湿度条件下平衡一段时间。
5.3 T线和C线上抗原或抗体的浓度 T线和C 线上抗原或抗体的包被浓度直接影响其与金标记物的结合比例,最终影响试纸条条带的显色效果。
包被浓度过低,膜上的条带显色不清晰或出现条带中空现象;包被浓度过高,会导致C线不显色或者出现拖带现象。
若要获得反应稳定、显色清晰的试纸条,须对2条线上抗原或抗体的配合浓度及两者与金标记物的结合比进行调整和比对,以期得到最佳的组合。
5.4 点样位置 不同的T线、C线点样位置将带来不同的灵敏度,点样位置上移,金标复合物通过T 线位置时速度变慢,反应时间增加,灵敏度升高;反之灵敏度降低。
可采用这个方法来改变灵敏度和消除假阳性。
5.5 点样仪器 目前有2种点样方式,划膜式和非接触点膜式。
非接触点膜式优于划膜式,划膜式需用软管将抗体划到膜表面,而膜本身的物理性质较为软脆,划管会在其表面留下印痕。
划痕容易对层析的金标复合物形成阻力,导致假阳性,同时容易出现跑板时在T线位置出现若有若无一条细线,影响结果的判定。
点样仪器不仅可以控制T线、C线点样位置,也可通过点膜仪器各种参数的调整控制T 线与C线宽度及喷膜速度等细节,达到最好显色效果。
需要在试验过程反复调整各项参数做比对试验,观察试纸条的显色情况来决定。
6 缓冲液缓冲液构成胶体金免疫层析技术的液相载体,在不影响胶体金与蛋白质、抗原与抗体、硝酸纤维素膜与T线及C线蛋白结合的前提下,并为它们的结合反应提供最佳的酸碱环境。
缓冲液并不是通用的,不同的反应体系需要不同的缓冲液来支持,这就需要试验者结合自己的试验尝试不同的缓冲液,确定适合自己的缓冲液配方。
常用的缓冲体系是在选用的缓冲液(磷酸盐、硼酸盐等)中添加相应的作用物质配制而成,所谓作用物质是解决反应体系出现的某一特定问题而添加的相应物质。
比如通过在缓冲液中添加适量的表面活性剂(如Tw een-20),可起到增加亲水力、增色和避免线条中空现象;也可同时添加几种物质,通过它们之间的相互协同作用共同解决相关的问题,如少量NaCl,减少信号强度,消除假阳性;糖和聚乙二醇作为保护剂,能减缓老化速度,也可以增加亲水力,但也要注意作用物质的添加宜简不宜繁。
试纸条制备过程中的很多处理液都是在选择的缓冲液的基础上添加相应的作用物质配置而成的(如封闭液、结合垫处理液等)。
7 样品的处理与结果的判定7.1 样品的处理方法和加样量 临床送检标本(如全血、血清、血浆),不同的单位和检测人员采用的处理方法不统一,也会对结果判定造成影响。
如血浆内大量的纤维蛋白原,影响到层析的速度及均一性,直接影响到抗原抗体结合,处理不当甚至出现一种非特异性结合。
检测时样品的添加量要相对充足,使膜上的反应充分进行,以便得到清晰的结果。