H9c2细胞培养方法
《参芪益心方对H9C2心肌细胞能量代谢的影响及机制研究》
《参芪益心方对H9C2心肌细胞能量代谢的影响及机制研究》一、引言心肌细胞能量代谢是维持心脏正常功能的关键过程，对心肌细胞的健康与功能具有重要影响。
近年来，随着对中药研究的深入，越来越多的研究者开始关注传统中药方剂对心肌细胞能量代谢的调节作用。
参芪益心方作为一种经典的中药复方，被认为具有调节心肌细胞能量代谢、改善心脏功能的潜力。
本文旨在研究参芪益心方对H9C2心肌细胞能量代谢的影响及其作用机制，为临床应用提供理论依据。
二、材料与方法1. 材料（1）细胞：H9C2心肌细胞系。
（2）药物：参芪益心方（由人参、黄芪等中药组成）。
（3）实验仪器与试剂：细胞培养板、酶标仪、荧光定量PCR仪、Western blot相关试剂等。
2. 方法（1）细胞培养与处理：将H9C2心肌细胞培养于适宜的培养基中，分为对照组与实验组，实验组加入不同浓度的参芪益心方处理。
（2）能量代谢指标检测：通过酶标法检测ATP含量、乳酸脱氢酶活性等指标，评估心肌细胞能量代谢水平。
（3）基因表达分析：采用荧光定量PCR技术检测相关基因的表达情况。
（4）蛋白质表达分析：利用Western blot技术检测关键蛋白的表达水平。
（5）数据分析与统计：采用SPSS软件进行数据分析，结果以均数±标准差表示，组间比较采用t检验或方差分析。
三、结果1. 参芪益心方对H9C2心肌细胞能量代谢的影响实验结果显示，参芪益心方处理后，H9C2心肌细胞的ATP 含量显著提高，乳酸脱氢酶活性降低，表明参芪益心方能够改善心肌细胞的能量代谢水平。
2. 参芪益心方对相关基因表达的影响通过荧光定量PCR技术检测发现，参芪益心方处理后，与能量代谢相关的基因表达水平发生明显变化，如线粒体相关基因、糖酵解相关基因等表达上调。
3. 参芪益心方对关键蛋白表达的影响Western blot结果显示，参芪益心方处理后，与能量代谢相关的关键蛋白表达水平发生改变，如AMPK、mTOR等蛋白的表达水平发生变化。
铁死亡抑制剂预培养的大鼠心肌细胞抵抗素诱导后细胞肥大程度及铁死亡相关蛋白表达观察
铁死亡抑制剂预培养的大鼠心肌细胞抵抗素诱导后细胞肥大程度及铁死亡相关蛋白表达观察朱贲贲1，2，海日汗3，王巍嵩4，杨鹏杰5，61 内蒙古自治区肿瘤医院药剂科，呼和浩特010020；2 内蒙古医科大学附属人民医院药剂科；3 内蒙古医科大学麻醉系；4 内蒙古医科大学附属医院药学部；5 内蒙古自治区肿瘤医院胸外科；6 内蒙古医科大学附属人民医院胸外科摘要：目的 观察铁死亡抑制剂Fer -1预培养的大鼠心肌细胞系H9c2抵抗素诱导后细胞肥大程度及铁死亡相关蛋白的表达情况。
方法 将H9c2细胞饥饿培养16 h ，随机分为1、2、3、4组。
1组用含1 μmmol /L 的Fer -1的培养基培养16 h ，后换为含50 ng /mL 抵抗素的培养基培养32 h ；2组用含1 μmmol /L 的Fer -1培养基培养16 h ，后换为0.1% FBS 培养基培养32 h ；3组用含50 ng /mL 抵抗素的培养基培养48 h ；4组（正常对照组）用0.1% FBS 培养基培养48 h 。
取各组细胞，采用Image J 软件测量细胞表面积，采用BCA 法测算单细胞蛋白含量，采用RT -qPCR 法检测心肌细胞肥大相关胚胎基因ANP 、BNP 和β-MHC ；采用WESTERN Blotting 法检测各组铁死亡相关蛋白谷胱甘肽过氧化物酶 4 （Glutathione Peroxidase 4，GPX4）、酰基辅酶 A 合成酶长链家族成员 4（Acyl -CoA synthetase long -chain fami⁃ly member ，ACSL4） 及环氧合酶2（COX2）。
结果 与4组比较，3组H9c2细胞表面积增大，单细胞蛋白含量高，ANF 、BNF 及β-MHC 基因相对表达量高，GPX4蛋白相对表达量低、ACSL4及COX2蛋白相对表达量高（P 均 <0.05）。
与3组相比，1组细胞表面积小，单细胞蛋白含量低，ANF 、BNF 及β-MHC 基因相对表达量低（P 均 <0.05）；与3组相比，1组细胞GPX4蛋白相对表达量高、ACSL4及COX2蛋白相对表达量低（P 均 <0.05）。
利拉鲁肽通过调控自噬和Na+,K+-ATPase活
网络出版时间：２０２２－１２－０９１８：２４：０６ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／／３４．１０８６．Ｒ．２０２２１２０９．１４２７．０１１．ｈｔｍｌ利拉鲁肽通过调控自噬和Ｎａ＋，Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅ活性抑制高糖诱导的心肌细胞肥大张 哲１，野战鹰２，王 杏１，杨林泉１，马慧娟１（河北省人民医院１．代谢病重点实验室、２．神经外三科，河北石家庄 ０５００５１）收稿日期：２０２２－０８－０７，修回日期：２０２２－１０－１８基金项目：国家自然科学基金青年基金资助项目（Ｎｏ８１２００６３８）；河北省卫生厅基金资助项目（Ｎｏ２０１８００５１）作者简介：张 哲（１９８０－），女，博士，助理研究员，研究方向：糖尿病及代谢疾病，Ｅ ｍａｉｌ：ｚｈｅ＿ｚｈａｎｇ８０＠１２６．ｃｏｍ；马慧娟（１９７６－），女，教授，博士生导师，研究方向：糖尿病及代谢疾病，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｈｕｉｊｕａｎｍａ７６＠１６３．ｃｏｍｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２２０１０１７文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）０１－００４３－０８中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ３２９ ２４；Ｒ３２９ ４１１；Ｒ３９４ ２；Ｒ５８７ １；Ｒ９７７ １５摘要：目的 探讨利拉鲁肽（ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ，ＬＲＧ）抑制高糖（ＨＧ）诱导的心肌细胞肥大的可能机制。
方法 体外培养Ｈ９ｃ２细胞，分为对照（ＣＯＮ）组、ＨＧ组、低、中、高剂量ＬＲＧ（ＬＲＧ Ｌ、ＬＲＧ Ｍ、ＬＲＧ Ｈ）组、ＬＲＧ Ｈ＋自噬抑制剂３ 甲基腺嘌呤（３ ＭＡ）组。
鬼笔环肽染色观察细胞表面积；试剂盒测定细胞膜Ｎａ＋，Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅ（ＮＫＡ）活性；Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ测定ＮＫＡα１、ＮＫＡα２ｍＲＮＡ和蛋白表达；单丹磺胺戊二胺（ＭＤＣ）荧光染色观察自噬囊泡数量；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ测定肥大标志基因（ＡＮＰ、β ＭＨＣ）、自噬标志基因（Ｂｅｃｌｉｎ １、ＬＣ３、ｐ６２）蛋白表达。
利用低氧／厌氧工作站建立H9c2细胞缺氧复氧模型的探讨
利用低氧／厌氧工作站建立H9c2细胞缺氧复氧模型的探讨储倩雯;李伟秋;鲁诗史;黄丹梅;张艳美【摘要】目的：利用低氧／厌氧工作站，结合不同的缺氧条件，探讨建立H9c2细胞缺氧复氧（hypoxia／reoxygenation， H／R）模型的最佳方法。
方法缺氧时将H9c2细胞置于低氧／厌氧工作站中，分别以完全培养基，无糖培养基和酸性缺氧液培养1、2、4、6、8 h，缺氧后换用完全培养基于培养箱中按常规条件培养1 h。
流式细胞仪测定细胞内活性氧（ reactive oxygen species ，ROS）含量，噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测细胞生存率，倒置显微镜下观察H9c2细胞形态变化。
结果与对照组比较，缺氧时以完全培养基和无糖培养基处理的H9c2细胞H／R后，细胞内ROS含量和细胞存活率随缺氧时间延长无明显改变，且倒置显微镜下未观察到明显的形态变化。
缺氧时以酸性缺氧液处理的H9c2细胞，随H／R时程的延长，细胞内ROS含量不断增加（P＜0.01），且细胞存活率逐渐降低（P＜0.01），倒置显微镜下观察到细胞H砄1 h／R：1 h后开始出现部分细胞皱缩，少量坏死细胞漂浮，随时间延长损伤加重；缺氧8h后，细胞皱缩成圆形，大量坏死细胞漂浮，复氧1h后可见细胞膜表面不平滑，复氧液中仍有少量坏死细胞漂浮。
结论采用低氧／厌氧工作站，并结合酸性缺氧液，可成功建立重现性非常好的H9 c2细胞H／R模型。
%Objective To investigate optimal method of establishing hypoxia/reoxygenation(H/R) model ofH9c2 cell by using hypoxia/anoxic workstation under different conditionsin hypoxia.Methods H9c2 cell was placed into hypoxia/anoxic workstation and simultaneously cultured with complete medium, glucose-free DMEM and acidic hypoxic solution for 1,2,4,6 and 8 h respectively, and then reoxygenated with complete medium for 1 h in normoxic incubator.Thelevel of ROS was measured by flow cytometry.The cell viability was detected by MTT assay.The cellular morphology was observed by inverted microscope.Results With the extension of cell hypoxia time, there were no significant differences in the ROS level and cell viability in complete medium-and glucose-free DMEM-treated H/R groups compared with control group(P<0.05).There was no obvious morphologic change observed with inverted microscope, either.Nevertheless, when H9c2 cells were treated with acidic hypoxic solution in hypoxia, the ROS level continuously increased and the cell viability decreased with the extension of cell hypoxia time ( P<0.01 ).Since H:1 h/R:1 h, some of the cells shrunk and a few necrotic cells floated in the media under the inverted microscope , and the damage was aggravated with the extension of hypoxia time.After the cells were exposed in hypoxia for 8 h, they wrinkled to be round and a large number of floating necrotic cells were observed.When the cells were reoxygenated for 1 h, the cytomembrane was not smooth and there were still a few necrotic cells floating in culture dish .Conclusion The H9c2 cell H/R model with good repeatability can be established successfully by using hypoxia/anoxic workstation combining with acidic hypoxic solution.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2015(000)011【总页数】4页(P11-14)【关键词】低氧/厌氧工作站;H9 c2细胞;缺氧复氧模型【作者】储倩雯;李伟秋;鲁诗史;黄丹梅;张艳美【作者单位】汕头大学医学院药理教研室，广东汕头 515041;汕头大学医学院分析细胞实验室，广东汕头 515041;汕头大学医学院第一附属医院药剂科，广东汕头 515041;汕头大学医学院药理教研室，广东汕头 515041;汕头大学医学院药理教研室，广东汕头 515041【正文语种】中文【中图分类】R363心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion， I/R)损伤是心脏缺血性疾病和心脏外科手术后常见的一种病理生理现象。
醛固酮的应用
醛固酮的应用摘要：醛固酮(英文：Aldosterone)是一种类固醇类激素(盐皮质激素家族)，主要作用于肾脏，为一种增进肾脏对于离子及水分再吸收作用的一种激素，是调节细胞外液容量和电解质的激素，醛固酮的分泌主要受肾素—血管紧张素调节，即肾的球旁细胞感受血压下降和钠量减少的刺激，分泌肾素增多，肾素作用于血管紧张素原，生成血管紧张素。
血管紧张素可刺激肾上腺皮质球状带合成和分泌醛固酮。
当循环血量减少时，醛固酮的分泌量会增加，使钠和水的重吸收增强，以此维持水盐代谢的平衡。
醛固酮不但对水盐调节起作用，对心律失常及高血压患者的糖代谢、对肝硬化患者的血浆心钠素含量、钙调神经磷酸酶的活化作用都有影响。
关键词：醛固酮、心律失常、糖代谢、血浆心钠素正文：(1)水盐调节醛固酮在调节细胞外液，醛固酮重要的生理功能有赖于通过调控肾上皮钠通道（ENaC）对钠的重吸收，醛固酮的基因组作用方式：醛固酮进入集合管主细胞后，与胞浆内的盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor，MR)结合，形成激素-受体复合体，后者进入细胞核与核中DNA特异性结合位点相互作用，调节特异性mRNA转录，最终合成多种醛固酮诱导蛋白(aldosterone-induced protein, AIP)，使管腔膜(apicalside)ENaC活性增强，基侧膜(basolateral side)钠钾泵的活性增加，从而促进跨上皮细胞的Na＋重吸收。
醛固酮基因组作用的特点是作用起效较慢，作用时间长，对MR阻断剂敏感。
(2)心律失常影响南昌大学内科学硕士在探讨不同浓度醛固酮对H9C2细胞缝隙连接蛋白①（Connexin，Cx）43蛋白及mRNA表达的影响，进一步探讨心律失常的深层机制②的试验中。
利用下述方法：1、应用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液培养H9C2细胞，随机分为对照组和实验组，实验组用不同浓度(1x10-8mol/L、1x10-6mol/L、1x10-4mol/L)醛固酮处理，对照组用不含胎牛血清的高糖DMEM培养液处理，分别处理24小时。
白藜芦醇可减轻高糖诱导的心肌细胞肥大：基于促进SSIIRRTT1表达维持线粒体稳态
糖尿病心肌病（DCM ）是糖尿病最常见的并发症之一，心肌细胞肥大是DCM 患者心脏主要的病理特征，最终发展为心力衰竭，很大程度上增加了糖尿病患者的死亡风险［1,2］。
高血糖状态下，葡萄糖氧化的增加使心肌细胞线粒体负担过重，导致电子泄漏和活性氧（ROS ）的产生增加，其引起的氧化应激损伤在DCM 心肌肥大的病理变化中发挥关键作用［3］。
心肌细胞是线粒体高度依赖型细胞，维持线粒体稳态是保证线粒体正常功能的重要基础，线粒体稳态失衡可引起心肌细胞ROS 产生增Resveratrol alleviates hyperglycemia-induced cardiomyocyte hypertrophy by maintaining mitochondrial homeostasis via enhancing SIRT1expressionYE Hongwei 1,2,ZHANG Yuming 1,2,YUN Qi 1,2,DU Ruoli 1,2,LI Lu 1,2,LI Yuping 1,2,GAO Qin 1,21Department of Physiology,2Key Laboratory of Basic and Clinical Cardiovascular Diseases,Bengbu Medical University,Bengbu 233000,China摘要：目的探讨白藜芦醇是否通过促进沉默信息调节因子2同源体1（SIRT1）表达调控线粒体稳态，减轻高糖诱导的H9c2心肌细胞肥大。
方法将对数生长的H9c2心肌细胞随机分为4组：正常糖浓度组（NG 组）、高糖组（HG 组）、高糖+白藜芦醇组（HG+RES 组）、高糖+白藜芦醇+SIRT1基因干扰组（HG+RES+si-SIRT1组）。
各组细胞培养72h 后，检测细胞超氧化物歧化酶（SOD ）活力和丙二醛（MDA ）含量，检测细胞活性氧（ROS ）水平，计算细胞相对面积，检测心房利钠因子（ANF ）和脑钠肽（BNP ）mRNA 表达，SIRT1蛋白、线粒体融合相关蛋白视神经萎缩蛋白1（OPA1）和线粒体融合蛋白2（MFN2）、线粒体分裂相关蛋白线粒体动力相关蛋白1（DRP1）和线粒体分裂蛋白1（FIS1）以及线粒体自噬相关蛋白BNIP3L 和LC3的表达。
不同剂量阿霉素对H9C2心肌细胞的影响
不同剂量阿霉素对H9C2心肌细胞的影响发表时间：2018-03-16T13:45:00.170Z 来源：《医师在线》2017年12月下第24期作者：李潇徐繁通讯作者房亮曹向宇姜海军赵博[导读] 对阿霉素的安全用药,尤其显得重要。
本实验研究也为临床上寻找能抑制阿霉素损伤心肌的药物奠定了实验基础。
（河北承德医学院附属医院；河北承德067000）[摘要]目的：研究不同剂量阿霉素对H9C2细胞的影响，为阿霉素临床研究提供参考依据。
方法：将不同浓度多柔比星（1、2、4、6、10ug/ml）与H9C2心肌细胞共培养6、12、24h，观察细胞形态变化，并计算不同作用时间及药物浓度的细胞抑制率。
结果：阿霉素剂量从1-10ug/ml均能抑制心肌细胞活性并呈剂量依赖性。
结论：一定剂量阿霉素对心肌细胞有毒性作用，可致心肌细胞坏死和调往率增加。
[关键词] H9C2心肌细胞阿霉素细胞抑制率Effect of Doxorubicin on H9C2 Myocardial Cells [ABSTRACT]Objective: To study the effect of different doses of doxorubicin on H9C2 cells and to provide a reference for the clinical study of doxorubicin.Methods: Doxorubicin (1, 2, 4, 6，10ug/ml) was co-cultured with H9C2 cardiomyocytes for 6, 12 and 24 hours.The morphological changes of cells were observed and the cytotoxicity rate. Results: Doxorubicin dose-dependently inhibited cardiomyocyte activity from 1 to 10ug/ml. Conclusion: A certain dose of doxorubicin has a toxic effect on cardiomyocytes, resulting in increased myocardial necrosis and transfer rate.[Key words] H9C2 Cardiomyocytes；Adriamycin；Cell inhibition rate 阿霉素( doxorubicin) 是一种广泛用于恶性肿瘤化疗的蒽环类药物，其效果显著。
219415347_二甲双胍对H9C2_心肌细胞肥大的改善作用及其机制
第 49 卷第 3 期2023年 5 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.3May 2023DOI：10.13481/j.1671‑587X.20230316二甲双胍对H9C2心肌细胞肥大的改善作用及其机制黄德盛1, 赵亚楠1, 陈云1, 孙艺瑶1, 覃伟林1, 刘谋杰2, 谢菊华1（1. 沈阳医学院组织胚胎学教研室，辽宁沈阳110034；2. 中国医科大学附属第一医院心内科，辽宁沈阳110034）［摘要］目的目的：探讨二甲双胍对异丙肾上腺素（ISO）诱导的H9C2心肌细胞肥大的作用，并阐明其可能的分子机制。
方法方法：培养H9C2细胞，采用50 μmol·L－1 ISO干预H9C2细胞建立心肌细胞肥大模型作为ISO组；不予处理的细胞作为对照组。
Western blotting法检测2组H9C2心肌细胞中脑钠肽（BNP）蛋白表达水平。
将H9C2心肌细胞分为对照组、ISO组、ISO+二甲双胍组和二甲双胍组。
采用CCK-8法检测各组H9C2细胞活力，选取二甲双胍的最佳药物干预浓度和时间，采用结晶紫染色观察各组H9C2心肌细胞形态表现和横截面积，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞中心房钠尿肽（ANP）mRNA表达水平，线粒体荧光探针观察各组细胞中线粒体形态表现，Western blotting法检测各组细胞中线粒体融合标志性蛋白神经萎缩蛋白1（OPA1）和线粒体融合蛋白（MFN）2蛋白表达水平。
结果：与对照组比较，ISO 组H9C2心肌细胞横截面积增加（P<0.05），细胞中BNP蛋白表达水平升高（P<0.05），提示心肌细胞肥大模型造模成功。
CCK-8法检测，2 mmol·L－1 二甲双胍作用8 h时细胞活力恢复效果最佳。
RT-qPCR法检测，与对照组比较，ISO组细胞中ANP mRNA表达水平升高（P<0.05）；与ISO组比较，二甲双胍+ISO组和二甲双胍组细胞中ANP mRNA表达水平降低（P<0.05）。
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大鼠心肌细胞H9C2
细胞描述：
大鼠心肌细胞H9C2是来源于胚胎期BD1X大鼠心脏组织的亚克隆细胞系，表现很多骨骼肌细胞的特性。
当H9c2细胞汇合时，细胞就会融合成多核的肌管并对乙酰胆碱刺激有反应，但该细胞缺少像心肌细胞一样的节律性搏动。
此外，多项生化、电生理指标的检测也表明其具有骨骼肌的很多特点。
由于来源于心脏，H9C2细胞作为心脏成肌细胞也用于心肌疾病的研究。
大鼠心肌细胞H9C2增殖能力取决于细胞取材、培养技术、培养条件等综合因素。
请按照正确的培养方法来解冻、传代，以此保证细胞具备良好的增殖能力，方便您的后继研究顺利进行。
货号规格培养基运输保存
C0048 1×106个/管DMEM+10% FBS 干冰运输液氮保存
质量控制：
本细胞经过了检测，不含有细菌、真菌、病毒（HIV、HBV、HCV）、支原体。
培养条件：
37℃，5% CO2，PH值7.2~7.4，无菌恒温培养。
用途：
本产品只提供给进一步的科研使用，不可应用于治疗等其他方面。
细胞相关操作（注意：细胞操作都需严格按照无菌操作）
收到复苏好的贴壁细胞的处理方法：
1. 先从外包装盒拿出细胞瓶，在细胞瓶表面喷一层酒精，并小心去掉封口膜；
2. 在显微镜下观察细胞状态，并确定是否染菌，如有染菌，请立即拍照，并将细胞丢掉；
3. 将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养4-6小时；
4. 倒掉多余的培养基，留正常体积的培养基；
5. 重新将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养过夜；
6. 第二天传代。
收到冻存细胞的处理方法：
1.37°C水浴预热培养基；
2.从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）；
3.在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min；
4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀；
5.置于37°C，5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧)；
6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。
细胞传代
1.当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代；
2.37°C水浴预热培养基；
3.在超净台中，弃培养基，加入2-5mlPBS清洗细胞后，再加入1ml胰酶消化细胞；
4.显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5ml培养基终止消化；
5.用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散；
6.将细胞移入离心管中，1000rpm离心5min；
7.弃上清，加入15-20ml的培养基重悬细胞后转入T75培养瓶中或按适当比例传到T25瓶中（确保细胞贴壁后融合度在25-50%之间），细胞密度在1×104 cells/cm2 (2.5×105 cells/T-25瓶），混匀细胞悬液，确保细胞均匀分布；
8.将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养。
细胞冻存
1.37°C水浴预热培养基；
2.消化细胞后给细胞计数:
1)洗净晾干血小板计数板和盖玻片，将盖玻片完全覆盖计数区；
2)充分混匀细胞，取少量(0.1-0.5ml)细胞悬液与等体积的染色液台盼蓝混合，移液器吹吸混合均匀，用移液器取20ul混合液从盖玻片两端(与中间凹槽平行的两端)分别打入细胞，以细胞悬液刚好浸湿盖玻片为佳；
3)显微镜下，数四个计数区的总细胞数，无活性细胞染成蓝色，活细胞不被染色；
4)细胞密度=细胞总数/4×10000×2；
这里10000是不变的，因为计数的细胞是在体积为1mm×1mm×0.1mm即10-4cm3计数池内，1cm3=1ml，将四个计数区的细胞数除以4取平均数，乘2是补偿加等体积台盼蓝形成的稀释。
5)细胞活性=活细胞数/细胞总数×100%。
注:细胞密度高时，可调整细胞悬液和台盼蓝的比例，计数时乘以相应的稀释倍数即可。
3.当细胞密度达到传代密度且细胞活性在90%以上时，可以冻存细胞。
4.在超净台中将要冻存的细胞移入离心管，1000rpm离心5min。
5.弃上清，用90%培养液+10%DMSO的混合液重悬细胞，并调整细胞密度为1-3×106/ml。
6.将细胞悬液分装到冻存管中(1-1.5ml/管)。
7.将装有细胞的冻存管放入程序降温冻存盒，-20°C放1-2h后，-80°C过夜，然后快速转移到液氮中。