细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏
细胞培养基础知识详解-细胞的复苏、传代和冻存
细胞培养基础知识详解细胞的复苏、传代和冻存实验操作指导整理：江耀伦李美娣1 细胞复苏细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
1.1实验前准备（1）将水浴锅预热至37℃（2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的生物安全柜内部台面。
（3）在生物安全柜中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
1.2 细胞复苏培养（1）根据细胞冻存记录取出需要复苏的细胞。
（2）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
（3）约1-2 min后冻存管内液体完全溶解，取出放入离心机中以1000 rpm/min速度离心3~5 min。
（4）用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入生物安全柜内。
吸弃上清液，向离心管内加入1 mL培养液，吹打制成细胞悬液。
（5）将细胞悬液分装入培养瓶或者培养皿内，将培养瓶/培养皿放入37℃，5％ CO2的培养箱内过夜后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定。
1.3 初学者易犯错误（1）水浴锅未预热或者未预热到37℃。
（2）水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。
（3）离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。
（4）一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。
1.4 细胞传代1.4.1 传代前准备（1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
（2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的生物安全柜内台面和双手。
（3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
1.4.2 细胞传代（1）取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入生物安全柜内。
（2）从培养箱内取出细胞：注意培养瓶取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
细胞复苏、传代、冻存过程
一、细胞培养（复苏、换液、传代、冻存）（已正）进行细胞培养前，将所用物品放入超净台中，打开紫外开关，照射20-30分钟。
紫外结束后，打开鼓风，使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。
1.细胞培养液的配制：配制50ml培养液(45ml基础培养液+5ml的胎牛血清+500ul的青霉素/链霉素)（如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加）2.细胞复苏：将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解，大约1min。
将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中，用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15ml离心管中，这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml，混匀，1000rpm, 3分钟。
然后弃掉上清，加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。
在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基，然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
（将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解。
1000rpm, 离心3分钟。
弃掉上清，然后加入1ml配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。
此时将其转移到T25瓶内，再加入4ml配好的培养基，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
）3.细胞换液：复苏的细胞在37℃ 5%CO2的孵箱内孵育4-6个小时后就应该给细胞换液，去除未贴壁的死细胞（贴壁生长的细胞）。
贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入5ml新鲜培养基，喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏
细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基、培养皿、细胞传代液等。
2.涂覆培养皿：将培养皿内涂覆一层适宜的基质（如凝胶、基质蛋白等）使细胞黏附在培养皿表面。
3.移植细胞：将细胞传代液中的细胞取出，经过适当的处理（如洗涤），将其转移到新的培养皿中。
可选择不同的分离方法，如以胰酶来切割细胞聚集物或以细胞转染剂来解离细胞。
4.培养细胞：将新的培养皿放入恒温培养箱中，提供适宜的培养基和环境条件（如温度、湿度、CO2浓度等），使细胞可以继续增殖和生长。
5.观察细胞生长：每天观察细胞的形态、数量和健康状况，记录细胞的生长曲线和其他相关信息。
6.传代细胞：当细胞生长到达一定程度（一般为80-90%的密度）时，可将细胞传代到新的培养皿中。
首先将细胞培养液抽吸并丢弃，并用适当的缓冲液（如PBS）洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。
接着加入胰酶等酶消化液，使细胞分离，并加入培养基将细胞转入新的培养皿中。
7.重复培养：重复以上步骤，使细胞不断地进行传代培养。
细胞冻存及复苏：细胞冻存是将细胞在低温条件下保存，以便长期保持细胞的活力和功能。
细胞冻存可避免细胞在传代培养中的漂变和突变，并保持细胞库的物种多样性。
而细胞复苏则是指将冻存的细胞重新从冷冻状态回复到活跃状态，以供进一步的研究或应用。
细胞冻存及复苏的步骤如下：1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基和冻存液。
2.预培养：将要冻存的细胞在新鲜的培养基中进行预培养，以使细胞处于最佳的生长状态。
3.细胞冻存液配制：根据细胞的特性和需要，配制适宜的冻存液。
一般来说，冻存液中含有维持细胞生存的缓冲剂、保护剂（如DMSO）、营养物质和蛋白质（如血清）等。
4.细胞冻存：将细胞培养液去掉，并用PBS洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。
然后加入适量的冻存液，使细胞和冻存液混合均匀。
最后将混合物分装到试管或冷冻管中，并迅速放入低温处。
细胞冻存与细胞复苏标准操作规程(SOP)
背景知识：细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。
因此及时进行细胞冻存十分必要。
细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。
原理：细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
主体内容（操作步骤）：一、材料（一）仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）5. 倒置相差显微镜6. 培养箱7. 液氮冰箱易生物仪器库：/yp/product-list-42.html（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头、直头）2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 胶塞4. 移液管（10ml）5. 15ml离心管6. 冻存管（1～2ml）（四）其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5. 移液枪（五）试剂1. D-Hanks液2. 小牛血清3. 培养液4. 双抗（青霉素、链霉素）5. 胰蛋白酶（0.08%）6. 1NHCl7. 7.4%NaHCO38. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油易生物试剂库：/yp/product-list-43.html二、操作步骤（一）细胞冻存1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；3. 离心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107 /ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。
细胞的培养-传代-计数-冻存-复苏
一、细胞复苏（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液放在37℃水浴锅中预热备用。
（2）快速从液氮罐中取出细胞冻存管，即刻放入37℃水浴锅中解冻，1000r/min 离心5分钟。
（3）吸取弃去上清液，在冻存管中加入培养基混悬细胞，移液器转移至细胞培养皿中，反复两次用培养液清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。
（4）加入足量的培养液，放在CO培养箱中细胞培养，第二天换液。
2二、细胞冻存（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液，DMSO放在37℃水浴锅中预热备用。
生长状态良好的细胞铺满培养瓶底的约80%时，换液后 12～24h 换液培养。
吸去培养液，D-Hanks溶液冲洗瓶底一次再吸弃。
加入 0.25％胰酶到培养瓶，覆盖瓶底，来回转动培养瓶，观察等待细胞消化至多数细胞形状变圆或从瓶底脱落下来。
（2）加入 5ml 含血清的培养液中止消化。
反复吸取瓶内培养液吹打细胞，形成细胞悬液。
进行细胞计数，细胞悬液移植15ml离心管中，3500r/min 离心 5 min。
（3）静置吸弃上清液，然后加入冻存液（73% DMEM 培养液，20％FBS，最后添加 7％DMSO 二甲基亚砜），细胞计数达到2×106/ml 以上。
细胞混匀后加入冻存管中，每管 1ml。
注明细胞种类、代数、冻存时间、名字，检查密封性。
降温程序：冷冻管置于4℃ 10 分钟→-80℃ 16～18 小时（或隔夜）→液氮槽（-196℃）长期储存。
三、细胞传代（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液放在37℃水浴锅中预热备用。
当细胞长满培养瓶底的约80%时，吸弃原先的培养液。
（2）加D-Hanks溶液洗涤一次瓶底，吸弃。
加入 0.25％胰酶到培养瓶，覆盖瓶底，来回转动培养瓶，观察等待细胞消化至多数细胞形状变圆或从瓶底脱落下来。
细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏
. 细胞传代培养的原理及操作步骤（一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
（二）细胞传代培养具体操作1、细胞：贴壁细胞株2、操作步骤1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。
随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。
观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。
一般室温消化时间约为1-3分钟。
4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。
第二天观察贴壁生长情况。
细胞冻存1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。
3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。
吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。
4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。
5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储存。
-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。
细胞复苏1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。
冻存细胞的复苏与传代培养
实验一、冻存细胞的复苏与传代培养（9学时）一、清洗与灭菌（一）实验目的能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。
（二）实验原理清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。
体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。
细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。
清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。
如有毒的化学物质，哪怕残留0.1μg，也可能影响细胞生长。
灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。
假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。
以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。
（三）仪器、材料和试剂仪器超净台，干燥箱，高压锅，过滤器，过滤泵。
材料无臭氧型紫外灯，微孔滤膜（直径25 mm）：孔径为0.22μm，微孔滤膜（直径90 mm）：孔径为0.22μm，过滤器（直径25 mm）。
试剂（参见附录4）70%或75%酒精，0.1%新洁尔灭，煤酚皂溶液（来苏儿水），0.5%过氧乙酸，乳酸，37%甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸（工业），DEPC水[体积分数0.1%的碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）]。
（四）实验步骤清洗1．新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡5％稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。
2．使用过的玻璃器皿的清洗（1）使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。
（2）用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。
（3）浸酸性洗液过夜。
（4）从酸性洗液捞出后用自来水冲洗10～15次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，倒置烘干。
（5）包装（牛皮纸或一般纸）。
（6）高压（15磅20min）或干热（160℃ 2h）灭菌（见（二）消毒与灭菌）。
细胞培养传代及冻存操作规程
细胞培养、传代及冻存操作规程一、细胞的复苏1、实验器材及试剂保温杯、温度计、镊子、温水（39℃）、培养板(根据需要选择相应孔数的培养板如6孔板，12孔板，24孔板等)、培养基DMEM+10%血清、双抗、1.5ml 离心管。
2、操作步骤①取相应体积的培养基放入到培养板中并加入双抗，放入CO2培养箱中预热，然后取适量的冷水加入到保温杯中，把温度计置于保温杯中，边加开水边用温度计搅拌，时刻关注温度计的度数直到温度升至39℃为止（为防止在移动过程中温度降低可把温度调高1——2℃。
②用镊子将所需要的细胞从液氮中取出，迅速放入提前准备好的温水中并不停的搅拌使其迅速解冻，细胞解冻好之后用移液枪把冻存管中的细胞连同冻存液一起吸出放到1.5ml离心管中，5000rpm/min 离心2min，尽量的除掉上清，然后在加入500μl培养基反复吹打待混合均匀后放入到事先准备好的培养板中并注明名称、日期及操作人。
二、细胞的传代培养1、操作步骤①准备好培养板加入相应体积的培养基之后放入培养箱中预热，添加培养基的方法如下表②将长满的细胞取出，吸除培养基，用DPBS清洗两遍，在加入相应体积的0.25％胰蛋白酶，使板底细胞都浸入溶液中，然后将培养板置于培养箱中 6 分钟后取出，在显微镜下观察消化情况。
添加胰蛋白酶的体积如下表所示③消化时间完成后应立即终止消化，一是直接加入培养基，二是吸除胰蛋白酶之后在加培养基，加入培养基以后反复吹打在此期间通过显微镜观察培养板中的细胞是否成为单细胞悬液，如果为单细胞悬液则停止吹打，将此单细胞悬液平均分配到已经预热好的培养板中，摇动混匀后放入培养箱24小时后换液。
2、注意事项在细胞传代培养中要时刻注意细胞的生长状态，以便于下一步实验的顺利进行。
其中有两点很重要，第一消化的时间，消化的时间并不是一成不变的，要根据细胞的状态随时终止消化，上面②中所诉的6分钟只是较为理想的时间；第二吹打的力度跟全面性，吹打的力度一定要适中，不能太用力避免将细胞打碎，另外每个培养板都是有边角的，那里会有很多细胞残留，需要提醒的是一定要在显微镜下观察细胞是否全部离开培养板底，如有残留可用枪头将其刮下在吹打。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细胞传代培养的原理及操作步骤
（一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
（二）细胞传代培养具体操作
1、细胞：贴壁细胞株
2、操作步骤
1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。
随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。
观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。
一般室温消化时间约为1-3分钟。
4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。
第二天观察贴壁生长情况。
细胞冻存
1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水
浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液
2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。
3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。
吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的
细胞悬液。
4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。
5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀
6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储
存。
-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。
细胞复苏
1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。
2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。
3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。
4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养
5.记录复苏日期；次日换液。