蛋白质冻融过程中的物理化学变化ppt课件
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《蛋白质化学最终版》PPT课件
氨基酸
C.Edman法（苯异硫氰酸，PITC法）：P71，蛋白质自动分析仪 D.氨肽酶法：肽链外切酶，从多肽链的N-端逐个水解氨基酸。
A.肼解法:
C末端氨基酸分析
RO H2N CH C
R n-1O
Rn O
HN CH C HN CH C OH
N-端 氨 基 酸
C-端氨 基酸
H+
RO
Rn O
NH2NH2 H2N CH C NHNH2 +H2N CH C OH
免疫球蛋白G的立体结构
(五）蛋白质的三级结构
整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。 即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。
主要的化学键：次级键 疏水键、离子键、氢键和 范德华力等。
具有三级结构的蛋白质才具有生物学活性， 三级结构一旦破坏，蛋白质的生物学功能丧失。
溶菌酶的三级结构
胰岛素分子的三级结构
氨基酸酰肼
C-端氨 基酸
B.羧肽酶法：肽链外切酶，从多肽链的C-端逐个水解氨基酸。
大分子多肽氨基酸顺序的确定：裂解
A.化学裂解法：溴化氰裂解法；羟胺NH2OH裂解法 B.酶裂法:胰蛋白酶，胃蛋白酶等
确定肽段在多肽链中的次序：重叠法 P72 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间 的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸 顺序。 16肽，Ｎ端H ⑤ Ｃ端Ｓ Ａ法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT B法裂解：SEO WTON VERL APS HO 重叠法确定序列：HOWTONSEOVERLAPS
1、非极性疏水氨基酸
甘氨酸 丙氨酸 缬氨酸 亮氨酸 异亮氨酸
苯丙氨酸
脯氨酸
2
Gly G Ala A Val V Leu L Ile I Phe P
蛋白质冻融过程中的物理化学变化
没食子酸在长期保存时 浓度发生的变化
共晶点：-16.7℃ 即使共晶点以下， 溶质扩散还在发生
(3)相分离现象
诱导蛋白质结构损伤 • 蛋白质分配进两种相中，可能使稳定 剂失去保护作用 • 改变稳定所需的分子间相互作用 • 形成两相界面（在不完全分离体系中， 蛋白质大面积暴露） 可发生于 • 电解质-聚合物 • 聚合物-聚合物 • 聚合物-多糖 • 蛋白质-多糖 • 蛋白质-蛋白质 • 蛋白质-表面活性剂 • 糖-蛋白质-多糖 • 电解质-聚合物-多糖 存在相分离现象 • PEG/PVP-Dextran • PVP-ficoll • PEG-磷酸盐
溶质浓度与粘度升高 溶质重新分布 溶质结晶（过饱和） pH变化 相分离
(1)溶质浓度与粘度升高，溶质重分布
引起反应速率发生改变 冰-水界面上形成浓度梯度
Figure 2. Temperature, % solute concentration, and viscosity profiles as a function of temperature during freezing of 3% sucrose.The data were calculated by assuming ice crystallization occurs at −15°C and that the solution composition follows the equilibrium freezing point depression curve. The viscosities were estimated from a fit of viscosity data over a wide range of composition and temperature to a Vogel-TammannFulcher-type equation. Data taken from Reference 7
蛋白质化学ppt文档课件
NH 3
Tyrosine (Tyr) O
NH 3
谷氨酰胺 Glutamine
(Gln)
HS CH2 CH COO 半胱氨酸
NH 3
Cysteine (Cys)
H3C CH CH COO
苏氨酸 Threonine
HO NH3
(Thr)
3. 酸性氨基酸 带负电荷
OOC CH2 CH COO
NH 3
天冬氨酸 Aspartic acid (Asp)
蛋白质的主要化学组成
含N量平均——%， 即1克的N相当于——克的蛋白质。
粗蛋白% = N% ——
第二节 蛋白质的基本结构--氨基酸
氨基酸的结构通式∶
组 成 蛋 白 质 的 二 十 种 基 本 氨 基 酸
常见氨基酸的分类及结构
(1)、根据R基团的化学性质 (2)、根据R基团的酸碱性 (3)、根据R基团的电性质
红色代表带正点荷最多的阳离子氨基酸，与 离子交换树脂结合最紧密，洗脱时最晚流出
分离氨基酸常用的是 带有耐酸性非常强的 磺酸根SO3－Na＋ （以盐的形式出现） 的强阳离子交换树脂。
首先将这种树脂填充 到柱子中，然后注入 含有样品的流动相， 样品中含有阳离子成 分X＋，通过静电吸 引，与树脂中的带电 基团相互作用，结果 X＋与Na＋交换，即 发生阳离子交换后， 形成SO3－X＋。
Imino Acids
Proline
Pro - P
2.4 9.4 2.0 10.6
(三）、氨基酸的重要化学反应
1、α－氨基的反应 （A）与亚硝酸的反应
可用于氨基酸定量 和蛋白质水解程度 的测定
Pro是一个亚氨基酸，没有此反应
（B）与醛类反应
AA是一个两性电解质，但不能用酸、碱直接来滴定， 因为等电点pH或过高（12－13）或过低（1－2）没有适当 的指示剂可以被选用。醛类化合物与－NH2结合后降低了氨 基的碱性生成了弱碱（西佛碱-Schiff‘s base），是滴定终
蛋白质的理化性质PPT课件
第三章蛋白质的理化性质
蛋白质的理化性质
一、两性性质及等电点 二、胶体性质 三、变性与复性作用 四、蛋白质的沉淀作用 五、蛋白质的颜色反应 六、蛋白质的紫外吸收性质
一、蛋白质的两性解离与等电点
蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游离的 氨基和羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两 性解离性质，具有特定的等电点（pI）。 溶液pH＝pI时，蛋白质所带正负电荷相等； pH＞pI时，蛋白质带净负电荷； pH＜pI时，蛋白质带净正电荷。
2.沉淀种类：可逆与不可逆
3.沉淀方法：
沉淀后蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方 法
沉淀后蛋白质失去生物活性的沉淀方法
四、蛋白质的沉淀作用
2.沉淀种类：可逆与不可逆 3.沉淀方法：
沉淀后蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方 法
（1）盐析－中性盐沉淀法 （2）有机溶剂沉淀法 （3）酸沉淀法
蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
等电点时特点：
（1）净电荷为零 （2）一定离子强度的缓冲液：等离子点特征常数 （3）多数蛋白质在水中等电点偏酸（较低） 碱性AA/酸性AA 胃蛋白酶 0.2 等电点 1.0
血红蛋白
细胞色素C 菊糖酶
1.7
2.9 0.34
6.7
10.7 8.2
（4）导电性、溶解度、黏度及渗透压都最小。
蛋白质分子在一定pH的溶液中可带净的负电 荷或正电荷，故可在电场中发生移动。 不同蛋白质分子所带电荷量不同，且分子大 小也不同，故在电场中的移动速度也不同，
蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
（1）盐析—中性盐沉淀
常用的中性盐：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。
盐析时，pH在蛋白质的等电点处效果最好。
盐析沉淀蛋白质通常不会引起蛋白质的变性。 优点 盐析应用举例
蛋白质的理化性质
一、两性性质及等电点 二、胶体性质 三、变性与复性作用 四、蛋白质的沉淀作用 五、蛋白质的颜色反应 六、蛋白质的紫外吸收性质
一、蛋白质的两性解离与等电点
蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游离的 氨基和羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两 性解离性质，具有特定的等电点（pI）。 溶液pH＝pI时，蛋白质所带正负电荷相等； pH＞pI时，蛋白质带净负电荷； pH＜pI时，蛋白质带净正电荷。
2.沉淀种类：可逆与不可逆
3.沉淀方法：
沉淀后蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方 法
沉淀后蛋白质失去生物活性的沉淀方法
四、蛋白质的沉淀作用
2.沉淀种类：可逆与不可逆 3.沉淀方法：
沉淀后蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方 法
（1）盐析－中性盐沉淀法 （2）有机溶剂沉淀法 （3）酸沉淀法
蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
等电点时特点：
（1）净电荷为零 （2）一定离子强度的缓冲液：等离子点特征常数 （3）多数蛋白质在水中等电点偏酸（较低） 碱性AA/酸性AA 胃蛋白酶 0.2 等电点 1.0
血红蛋白
细胞色素C 菊糖酶
1.7
2.9 0.34
6.7
10.7 8.2
（4）导电性、溶解度、黏度及渗透压都最小。
蛋白质分子在一定pH的溶液中可带净的负电 荷或正电荷，故可在电场中发生移动。 不同蛋白质分子所带电荷量不同，且分子大 小也不同，故在电场中的移动速度也不同，
蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
（1）盐析—中性盐沉淀
常用的中性盐：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。
盐析时，pH在蛋白质的等电点处效果最好。
盐析沉淀蛋白质通常不会引起蛋白质的变性。 优点 盐析应用举例
蛋白质变性ppt课件
在多肽链中带有氨基的一端称作N端，而带有羧基的一 端称作C端。
30
胰岛素的一级结构
31
32
3. 三级结构：是指多肽链借助各种作用力在二级结 构基础上，进一步折叠卷曲形成紧密的复杂球形分 子的结构。
稳定蛋白质三级结构的作用力有氢键、离子键、 二硫键和范德华力。
肌球素的三级结构
肌球素的三级结构
33
55
（4）费林反应: 含有酪氨酸的Pr因酪氨酸的酚基能育费林试剂
中的磷钼酸和磷钨酸反应，还原成蓝色化合物。利 用这一反应定量测定Pr。
56
蛋白质的二、三、四级结构的构象不稳定，在 某些物理或化学因素作用下，发生不同程度的改变称 为变性。变性是指蛋白质高级结构发生改变，而肽键 不断裂。变性后的蛋白质某些性质发生变化，主要包 括：
些碳水化合物是氨基葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖、 甘露糖、海藻糖等中的一种或多种，与蛋白质间的共 价键或羟基生成配糖体。糖蛋白可溶于碱性溶液。哺 乳动物的物的粘性分泌物、血浆蛋白、卵粘蛋白及大 豆某些部位中之蛋白质都属于糖蛋白。
44
3．核蛋白： 由核酸与蛋白质结合而成的复合物。存在细胞
核及核糖体中。
11
4.非极性氨基酸：具有一个疏水性侧链，在水中的溶 解度比极性氨基酸低。共有： 甘氨酸，丙氨酸、缬氨酸，亮氨酸、甲硫氨酸和异 亮氨酸(蛋氨酸)．
12
1. 旋光性：除甘氨酸外， 氨基酸的碳原子均是手性 碳原子，所以具有旋光性。 旋光方向和大小取决于其 侧链R基性质，也与水溶液 的pH有关。
13
2. 紫外吸收：20种AA在可见区内无吸收，但在紫外光 区酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸有吸收，其最大吸收波 λman分别为278nm、279nm和259nm，故此利用此性质 对这三种氨基酸进行测定。酪氨酸、色氨酸残基同样 在280nm处有最大的吸收，可用紫外分光光度法定量 分析蛋白质。
30
胰岛素的一级结构
31
32
3. 三级结构：是指多肽链借助各种作用力在二级结 构基础上，进一步折叠卷曲形成紧密的复杂球形分 子的结构。
稳定蛋白质三级结构的作用力有氢键、离子键、 二硫键和范德华力。
肌球素的三级结构
肌球素的三级结构
33
55
（4）费林反应: 含有酪氨酸的Pr因酪氨酸的酚基能育费林试剂
中的磷钼酸和磷钨酸反应，还原成蓝色化合物。利 用这一反应定量测定Pr。
56
蛋白质的二、三、四级结构的构象不稳定，在 某些物理或化学因素作用下，发生不同程度的改变称 为变性。变性是指蛋白质高级结构发生改变，而肽键 不断裂。变性后的蛋白质某些性质发生变化，主要包 括：
些碳水化合物是氨基葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖、 甘露糖、海藻糖等中的一种或多种，与蛋白质间的共 价键或羟基生成配糖体。糖蛋白可溶于碱性溶液。哺 乳动物的物的粘性分泌物、血浆蛋白、卵粘蛋白及大 豆某些部位中之蛋白质都属于糖蛋白。
44
3．核蛋白： 由核酸与蛋白质结合而成的复合物。存在细胞
核及核糖体中。
11
4.非极性氨基酸：具有一个疏水性侧链，在水中的溶 解度比极性氨基酸低。共有： 甘氨酸，丙氨酸、缬氨酸，亮氨酸、甲硫氨酸和异 亮氨酸(蛋氨酸)．
12
1. 旋光性：除甘氨酸外， 氨基酸的碳原子均是手性 碳原子，所以具有旋光性。 旋光方向和大小取决于其 侧链R基性质，也与水溶液 的pH有关。
13
2. 紫外吸收：20种AA在可见区内无吸收，但在紫外光 区酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸有吸收，其最大吸收波 λman分别为278nm、279nm和259nm，故此利用此性质 对这三种氨基酸进行测定。酪氨酸、色氨酸残基同样 在280nm处有最大的吸收，可用紫外分光光度法定量 分析蛋白质。
蛋白质7教学课件.ppt
可逆变性、不可逆变性。
蛋白质变性后其பைடு நூலகம்理化学性质变化表现为：
①疏水性基团暴露，水中溶解性降低； ②某些蛋白质的生物活性丧失，如失去酶活或免疫活性； ③肽键暴露出，易被酶催化水解； ④蛋白质结合水的能力发生了变化； ⑤溶液粘度发生了变化； ⑥蛋白质结晶能力丧失。
引起蛋白质变性的因素
❖ 物理因素： 温度（热，冷）、机械处理、电磁
蚕豆 11S 蛋白
94
72
3.72
向日葵 11S 蛋白 95
76
4.16
燕麦球蛋白
108
2.冷冻
❖ 低温处理也会导致蛋白质变性。
❖ 有利：利用这一点，我们可以通过冷冻及 冻结贮藏抑制微生物和酶的活性，延长烹 饪原料的保鲜期。
❖ 不利：长期的低温处理也会导致烹饪原料 蛋白质冻结变性而被破坏，如冷冻的鱼类、 肉类长时间放置，蛋白质持水力下降、肉 质硬化等现象。
的影响，蛋白质在等电点时最稳定，溶解度最低， 在中性pH 环境中，除少数几个蛋白质带有正电 荷外，大多数蛋白质都带有负电荷。
❖ 酸碱引起的蛋白质变性可能是因为蛋白质溶 液pH值的改变导致多肽链中某些基团的解离 程度发生变化，从而破坏了维持蛋白质分子 空间结构所必需的某些带相反电荷基团之间 因静电作用形成的键。
冷冻对蛋白质产生不利影响的原因：
❖ 1、蛋白质水合环境发生变化。 ❖ 2、体系结冰后盐浓度增大产生盐效应。 ❖ 3、冷冻浓缩效应，使二硫键交换反应增加。
3 机械处理
揉捏、振动、挤压或搅打等高速机械 剪切，都能引起蛋白质变性。
剪切速率愈高，蛋白质变性程度则愈大。 同时受到高温和高剪切力处理的蛋白质，则 发生不可逆变性。
蛋白质
Td
平均疏水性
蛋白质变性后其பைடு நூலகம்理化学性质变化表现为：
①疏水性基团暴露，水中溶解性降低； ②某些蛋白质的生物活性丧失，如失去酶活或免疫活性； ③肽键暴露出，易被酶催化水解； ④蛋白质结合水的能力发生了变化； ⑤溶液粘度发生了变化； ⑥蛋白质结晶能力丧失。
引起蛋白质变性的因素
❖ 物理因素： 温度（热，冷）、机械处理、电磁
蚕豆 11S 蛋白
94
72
3.72
向日葵 11S 蛋白 95
76
4.16
燕麦球蛋白
108
2.冷冻
❖ 低温处理也会导致蛋白质变性。
❖ 有利：利用这一点，我们可以通过冷冻及 冻结贮藏抑制微生物和酶的活性，延长烹 饪原料的保鲜期。
❖ 不利：长期的低温处理也会导致烹饪原料 蛋白质冻结变性而被破坏，如冷冻的鱼类、 肉类长时间放置，蛋白质持水力下降、肉 质硬化等现象。
的影响，蛋白质在等电点时最稳定，溶解度最低， 在中性pH 环境中，除少数几个蛋白质带有正电 荷外，大多数蛋白质都带有负电荷。
❖ 酸碱引起的蛋白质变性可能是因为蛋白质溶 液pH值的改变导致多肽链中某些基团的解离 程度发生变化，从而破坏了维持蛋白质分子 空间结构所必需的某些带相反电荷基团之间 因静电作用形成的键。
冷冻对蛋白质产生不利影响的原因：
❖ 1、蛋白质水合环境发生变化。 ❖ 2、体系结冰后盐浓度增大产生盐效应。 ❖ 3、冷冻浓缩效应，使二硫键交换反应增加。
3 机械处理
揉捏、振动、挤压或搅打等高速机械 剪切，都能引起蛋白质变性。
剪切速率愈高，蛋白质变性程度则愈大。 同时受到高温和高剪切力处理的蛋白质，则 发生不可逆变性。
蛋白质
Td
平均疏水性
《蛋白质理化性质》PPT课件
2.1热力学第二定律 之熵判据
➢ 热力学将不能做功的随机和无 序状态的能定义为熵，以S表 示
➢ 宇宙或系统的各种过程总向着 熵增大的方向进展
在孤立体系或绝热体系中系统一切可以发生 的过程要么是熵变为0〔可逆，平衡态〕， 要么熵变大于0〔不可逆〕。熵不可能减小， 即熵总是增大的。
2.2热力学第二定律 之自由能判据
二、蛋白质折叠的热力学定律
熵判据和蛋白质折叠 自由能判据和蛋白质折叠 蛋白质折叠的热力学假说
1.熵判据和蛋白质折叠
未折叠的状态包含很多具有 不同构象的分子。
疏水作用是熵驱动的自发过程
当疏水化合物或基团进入水中，它周围的水分子 将排列成刚性的有序构造，即形成所谓笼形构造， 最常见的就是五角形十二面体笼形构造，这种构 造比冰更为有序。
热力学第一定律只能告诉人们一化学反响 中的能量效应，却无法解释，一定条件下， 一个化学反响能否自动进展及进展到何种程 度。也即无法解决化学变化的方向和限度问 题。
2.热力学第二定律的经典表述
1.克劳修斯：不可能将热从低温物体转到 高温物体，而不引起其它的变化。
2．开尔文：不可能从单一的热源取出热使 之完全转化为功，而不发生其它的变化。
1.热力学第一定律
➢ 热力学第一定律即能量 守恒定律
➢ 宇宙的能量是一个常数， 能量可以不断被转化和 转移，但不可能被创造， 也不可能被消灭
热力学第二定律 人人状学状学们们态变态变曾曾函化函化试试数或数或图图判物判物热用用展断理断理力热热到：变：变学力力何在化在化第学学种一能一能二第第程定否定否定一一度的自的自律定定？条发条发律律件的件的所所下 进下进建建，展，展立立一？一？的的化进化进
如果构象搜索的速度是 1012 构象/s，需要5 x 1035 s (1.6 x 1028 y)
第三节 蛋白质的理化性质 PPT课件
蛋白质具有稳定性。 原因：蛋白质与水亲和
蛋 白 质 亲水基团 分 子
羟基：-OH 水
溶于水 化
羧基：-COOH
膜
氨基：-NH2
稳定性增加
故蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性 质，如
（1）稳定性 （2）丁达尔现象 （3）电泳现象 （4）布郎运动 （5）不能通过半透膜等。
3、蛋白质的沉淀作用
在适当的条件下，蛋白质能够 从溶液中沉淀出来。
作用： 蛋白质的两性解离性质使其成
为人体及动物体中的重要缓冲剂， 调节体液正常pH。
2、蛋白质具有胶体性质
• 蛋白质属于生物大分子，分子量可自1万至 100万之巨，其分子的直径可达1～100nm， 为胶粒范围之内。因此，它在水中能够形成
胶体溶液。
故蛋白质溶液具有胶体溶液的典 型性质，如
（1）稳定性 （2）丁达尔现象 （3）电泳现象 （4）布郎运动 （5）不能通过半透膜等。
蛋白质 酒精
蛋白质沉淀
高温会变性，低温不会。
3、酸类沉淀法
用硝酸 苦味酸、三氯乙酸、目酸、钨酸
蛋白质
浓硝酸
蛋白盐沉淀
蛋白质已经失去活性
应用：在临床检验中，除去血液中的干扰蛋白质
（三）重金属盐沉淀
重金属盐：Cu2+ 、Hg2+、Ag+、Pb2+
蛋白质 铜离子
蛋白盐沉淀
蛋白质已经失去活性
应用：重金属盐中毒的解毒
1、硝酸与蛋白质反应
硝酸+蛋白质
蛋白质变黄
这是蛋白质的特征反应之一。 常用来鉴别部分蛋白质。
2、双缩脲反应
尿素 + 尿素
双缩脲
双缩脲+Cu2+ 碱性 紫红色配合物
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10
(2) pH变化
• 酸变碱 或碱变酸的pH巨大变化都是可能的 • 溶质结晶 • 一般发生在低浓度溶质中，原因可能在于离子在冰与水之中迁移，
不同离子迁移性质与速率不同
KH2PO4不容易析出 Na2HPO4过饱和析出
KH2PO4-Na2HPO4-H2O系统中 KCl 引起pH升高，＞6
NaCl 引起pH降低，＜4
-1360C为水的玻璃化温度， 水的结晶对细胞和组织不再 有明显伤害，样本内的各种 生化反应几近停止。
液氮箱/罐气相； 深冷冰箱
可中长期保持组织内生物 大分子、细胞和组织微观 结构的稳定性，为不少样 本库推荐用于长期冻存组 织。
-1960C为液氮蒸发的温度， 是常规方法所能实现的最低 温度。样本内的各种生化反 应可以认为停止，水的结晶 对细胞和微观组织的伤害可 以忽略。
• 变性温度与pH、蛋白浓度、添 加剂(如糖、离液剂等)有关
β-lactoglobulin
chymotrypsinogen
lactate dehydrogenase
myoglobin
低盐
phosphoglycerate kinase
低温
ribonuclease
and staphylococcal nuclease 7
存在相分离现象 • PEG/PVP-Dextran • PVP-ficoll • PEG-磷酸盐
重组血红蛋白 hemoglobin在 PEG-Dextran系统中的相图
混合液 7%PEG 7%Dextran
顶层 10%PEG 0.2%Dextran
底层 2%PEG 20%Dextran
14
3. 冰晶形成
各种冷冻冰箱
可中长期保持经过提纯的 生物大分子的稳定性，但 不能存保持组织中的生物 大分子稳定性、细胞活性 及组织微观结构。
-800C为水的结晶温度之下 较为安全的温度，同时样本 内的生化反应显著减弱。也 是目前自动化存储设备所能 使用的最低温度。
超低温冰箱
可中期保持组织内生物大 分子的稳定性；短期保持 细胞活性和组织微观结构。
液氮箱/罐液相
可长期保持组织中的生物 大分子稳定性、细胞活性 及组织微观结构，但对存 储耗材有较高要求。
5
一、物理胁迫 低温变性 冷冻浓缩效应 冰晶形成 二、化学胁迫
6
1. 低温变性效应
通常发生在0℃下，诱导蛋白质解折叠
• 蛋白质的吉布斯自由能随温度 变化趋势
• 认为跟温度下疏水残基的溶解 度增加
• 融解 工艺上有不同升温速率 Slow warming 1-5℃/min：室温或自来水摇 intermediate warming ＞5℃/min：37℃或以上的水浴
4
生物样品常用存储温度
温度
意义
设备
生物样品存储应用
0～-600C为组织和细胞内 水的结晶温度，温度进入此 范围组织内的水开始结晶伤 害细胞和组织微观结构。
(4)组织结构破坏
15
化学胁迫
1. 增强—NH2的羟胺反应 2. 共价聚合 3. 影响反应平衡
Reactions in Frozen Systems. Journal of the American Chemical Society
1
➢ 冻融过程到底发生了什么？
◦ 低温生物学 ◦ 化学 ◦ 热动力学 ◦ 晶体学
➢ 冻融胁迫的产生
➢ 冻融保护
2
肉眼能观察到的冻融现象
• 冰晶 • 浓度差异 • 在静置情况下融化，往往会看到溶液分层情况
不均匀 的体系 变化
3
目前常用的冻融工艺步骤
• 冷却cooling
• 冷冻freezing
• 等温保持
冷冻过程中的温度变化
8
溶质浓度与粘度升高 溶质重新分布 溶质结晶（过饱和） pH变化 相分离
9
(1)溶质浓度与粘度升高，溶质重分布
引起反应速率发生改变 冰-水界面上形成浓度梯度
Figure 2. Temperature, % solute concentration, and viscosity profiles as a function of temperature during freezing of 3% sucrose.The data were calculated by assuming ice crystallization occurs at −15°C and that the solution composition follows the equilibrium freezing point depression curve. The viscosities were estimated from a fit of viscosity data over a wide range of composition and temperature to a Vogel-TammannFulcher-type equation. Data taken from Reference 7
Ref: Protein Stability During Freezing， Separation of Stresses and
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没食子酸Gallic Acid在有NaCl存在时冻融发生分解 分解反应发生只在碱性溶液中，酸性环境基本不发生
提供一种思路：不添加碱性试剂的前提下，从中性或酸性环境下催化碱性反应。 12
没食子酸在长期保存时 浓度发生的变化
共晶点：-16.7℃ 即使共晶点以下， 溶质扩散还在发生
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(3)相分离现象
诱Байду номын сангаас蛋白质结构损伤 • 蛋白质分配进两种相中，可能使稳定
剂失去保护作用 • 改变稳定所需的分子间相互作用 • 形成两相界面（在不完全分离体系中，
蛋白质大面积暴露）
可发生于 • 电解质-聚合物 • 聚合物-聚合物 • 聚合物-多糖 • 蛋白质-多糖 • 蛋白质-蛋白质 • 蛋白质-表面活性剂 • 糖-蛋白质-多糖 • 电解质-聚合物-多糖
(1)冰晶生长 → 冷冻浓缩
(2)冰水界面 界面有可能是疏水性的，发生吸附变性 离子迁移性质不同，产生电势
快的冷却速率(小体积到液
(3)结冰时，蛋白质周围的水分子有序排列，氮更)多：的往冰往水形界成面大量小冰晶， 为熵增提供了热力学驱动力，产生吸附和 解折叠。结冰后水分子与蛋白质分子距离 发生改变，肽链发生拉扯，改变氢键、静 电、范德华力及疏水作用。
(2) pH变化
• 酸变碱 或碱变酸的pH巨大变化都是可能的 • 溶质结晶 • 一般发生在低浓度溶质中，原因可能在于离子在冰与水之中迁移，
不同离子迁移性质与速率不同
KH2PO4不容易析出 Na2HPO4过饱和析出
KH2PO4-Na2HPO4-H2O系统中 KCl 引起pH升高，＞6
NaCl 引起pH降低，＜4
-1360C为水的玻璃化温度， 水的结晶对细胞和组织不再 有明显伤害，样本内的各种 生化反应几近停止。
液氮箱/罐气相； 深冷冰箱
可中长期保持组织内生物 大分子、细胞和组织微观 结构的稳定性，为不少样 本库推荐用于长期冻存组 织。
-1960C为液氮蒸发的温度， 是常规方法所能实现的最低 温度。样本内的各种生化反 应可以认为停止，水的结晶 对细胞和微观组织的伤害可 以忽略。
• 变性温度与pH、蛋白浓度、添 加剂(如糖、离液剂等)有关
β-lactoglobulin
chymotrypsinogen
lactate dehydrogenase
myoglobin
低盐
phosphoglycerate kinase
低温
ribonuclease
and staphylococcal nuclease 7
存在相分离现象 • PEG/PVP-Dextran • PVP-ficoll • PEG-磷酸盐
重组血红蛋白 hemoglobin在 PEG-Dextran系统中的相图
混合液 7%PEG 7%Dextran
顶层 10%PEG 0.2%Dextran
底层 2%PEG 20%Dextran
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3. 冰晶形成
各种冷冻冰箱
可中长期保持经过提纯的 生物大分子的稳定性，但 不能存保持组织中的生物 大分子稳定性、细胞活性 及组织微观结构。
-800C为水的结晶温度之下 较为安全的温度，同时样本 内的生化反应显著减弱。也 是目前自动化存储设备所能 使用的最低温度。
超低温冰箱
可中期保持组织内生物大 分子的稳定性；短期保持 细胞活性和组织微观结构。
液氮箱/罐液相
可长期保持组织中的生物 大分子稳定性、细胞活性 及组织微观结构，但对存 储耗材有较高要求。
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一、物理胁迫 低温变性 冷冻浓缩效应 冰晶形成 二、化学胁迫
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1. 低温变性效应
通常发生在0℃下，诱导蛋白质解折叠
• 蛋白质的吉布斯自由能随温度 变化趋势
• 认为跟温度下疏水残基的溶解 度增加
• 融解 工艺上有不同升温速率 Slow warming 1-5℃/min：室温或自来水摇 intermediate warming ＞5℃/min：37℃或以上的水浴
4
生物样品常用存储温度
温度
意义
设备
生物样品存储应用
0～-600C为组织和细胞内 水的结晶温度，温度进入此 范围组织内的水开始结晶伤 害细胞和组织微观结构。
(4)组织结构破坏
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化学胁迫
1. 增强—NH2的羟胺反应 2. 共价聚合 3. 影响反应平衡
Reactions in Frozen Systems. Journal of the American Chemical Society
1
➢ 冻融过程到底发生了什么？
◦ 低温生物学 ◦ 化学 ◦ 热动力学 ◦ 晶体学
➢ 冻融胁迫的产生
➢ 冻融保护
2
肉眼能观察到的冻融现象
• 冰晶 • 浓度差异 • 在静置情况下融化，往往会看到溶液分层情况
不均匀 的体系 变化
3
目前常用的冻融工艺步骤
• 冷却cooling
• 冷冻freezing
• 等温保持
冷冻过程中的温度变化
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溶质浓度与粘度升高 溶质重新分布 溶质结晶（过饱和） pH变化 相分离
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(1)溶质浓度与粘度升高，溶质重分布
引起反应速率发生改变 冰-水界面上形成浓度梯度
Figure 2. Temperature, % solute concentration, and viscosity profiles as a function of temperature during freezing of 3% sucrose.The data were calculated by assuming ice crystallization occurs at −15°C and that the solution composition follows the equilibrium freezing point depression curve. The viscosities were estimated from a fit of viscosity data over a wide range of composition and temperature to a Vogel-TammannFulcher-type equation. Data taken from Reference 7
Ref: Protein Stability During Freezing， Separation of Stresses and
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没食子酸Gallic Acid在有NaCl存在时冻融发生分解 分解反应发生只在碱性溶液中，酸性环境基本不发生
提供一种思路：不添加碱性试剂的前提下，从中性或酸性环境下催化碱性反应。 12
没食子酸在长期保存时 浓度发生的变化
共晶点：-16.7℃ 即使共晶点以下， 溶质扩散还在发生
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(3)相分离现象
诱Байду номын сангаас蛋白质结构损伤 • 蛋白质分配进两种相中，可能使稳定
剂失去保护作用 • 改变稳定所需的分子间相互作用 • 形成两相界面（在不完全分离体系中，
蛋白质大面积暴露）
可发生于 • 电解质-聚合物 • 聚合物-聚合物 • 聚合物-多糖 • 蛋白质-多糖 • 蛋白质-蛋白质 • 蛋白质-表面活性剂 • 糖-蛋白质-多糖 • 电解质-聚合物-多糖
(1)冰晶生长 → 冷冻浓缩
(2)冰水界面 界面有可能是疏水性的，发生吸附变性 离子迁移性质不同，产生电势
快的冷却速率(小体积到液
(3)结冰时，蛋白质周围的水分子有序排列，氮更)多：的往冰往水形界成面大量小冰晶， 为熵增提供了热力学驱动力，产生吸附和 解折叠。结冰后水分子与蛋白质分子距离 发生改变，肽链发生拉扯，改变氢键、静 电、范德华力及疏水作用。