PCR引物设计基本思路
如何更好的设计出PCR引物
PCR引物设计PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。
如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。
一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
让我们先看看P1引物。
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。
而且四种碱基的分布最好随机。
不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。
否则P1引物设计的就不合理。
应重新寻找区域设计引物。
同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。
但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。
这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
pcr引物设计的基本理念 -回复
pcr引物设计的基本理念-回复PCR引物设计的基本理念PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA序列。
在PCR过程中，引物起着至关重要的作用，引物的设计质量直接影响PCR反应的效果。
因此，正确的PCR引物设计是成功进行PCR实验的基本前提。
本文将介绍PCR引物设计的基本理念，并分步回答如何设计合适的PCR 引物。
第一步：确认目标序列PCR实验通常是为了扩增某个特定的DNA序列，因此首先需要确定所需扩增的目标序列。
这个目标序列可以是基因片段、特定的DNA结构、启动子区域等。
在确认目标序列时，需要注意目标序列的长度和特异性，确保其能准确而特异地被引物扩增。
第二步：确定引物的长度引物通常由20到30个核苷酸组成，过短的引物可能不稳定，无法正确与模板DNA特异性结合，过长的引物则可能导致PCR产物过多的副产物。
因此，一般情况下引物长度约为18到24个核苷酸，适当选择引物长度有利于PCR的优化。
第三步：评估引物的理化性质引物的理化特性包括引物的GC含量、熔解温度（Tm）和自身引物结合能力。
高GC含量的引物更稳定，但也更难设计；Tm值表征了引物与模板DNA杂交的稳定性，通常理想的Tm值为50-65；自身引物结合能力的评估可以避免引物之间的非特异性结合。
多种软件可用于计算引物的理化性质，并为引物设计提供参考。
第四步：检查引物的特异性引物的特异性是PCR引物设计的关键点之一。
为了确保引物仅扩增目标序列，没有互补的序列存在于其他地方，可以使用引物设计软件进行特异性检查。
软件可以检查引物在基因组中的互补性和互补的副产物，以确保引物只扩增目标序列。
第五步：考虑引物间的配对引物在PCR反应中需要与目标序列的两端结合，因此两个引物（前向引物和反向引物）需要在目标序列上互补配对。
在设计引物时，需要确保两个引物的Tm值相近，以避免一个引物过早或过晚离开DNA链。
此外，还需要考虑引物之间的距离和可能的PCR产物长度，以确定引物的相对位置。
PCR引物设计原理及原则
PCR引物设计原理及原则PCR引物设计是聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的关键步骤之一、PCR引物是指PCR扩增反应中作为起始材料的两个DNA片段，通常是20-30个碱基对长的寡核苷酸序列。
PCR引物设计的目的是选择合适的引物序列，以实现特定DNA序列的扩增。
1.特异性：PCR引物应该非常特异地与目标序列相互作用，不与其他非特异性的序列发生非特异性的扩增反应。
为了实现特异性，引物序列应该在目标序列上具有高度互补性，但是在非特异性序列上没有互补性。
2.合适的长度：PCR引物的长度在20-30个碱基对之间，较短的引物可能无法特异性地与目标序列结合，而较长的引物可能导致PCR反应的效率降低。
3.避免结构性：PCR引物设计中应避免引物之间或引物与模板之间的二级结构形成。
二级结构会干扰PCR反应的进行，降低扩增效率。
4.避免引物间杂交：在PCR反应中，通过引物间的相互作用引发的非特异性扩增会干扰特异性扩增的结果。
因此，在设计PCR引物时，需要避免引物间的互补性。
1.选择位于目标序列上的合适区域进行扩增，通常选择区域位于目标序列上游和下游的相对保守区域。
这样可以确保PCR引物的特异性和稳定性。
2.引物应具有一定的GC含量，一般在40%-60%之间，过低的GC含量会降低PCR反应的特异性和稳定性。
3.引物的两端不应含有重复序列，这样可以避免模板序列的间断扩增。
4.引物的两端应该有相对稳定的酮基或磷酸基，这样可以提高引物的稳定性，确保特异性扩增。
5.避免引物的自身互补性，以防止引物间的二级结构形成。
引物的互补性会干扰PCR反应的进行。
6.引物应避免在末端存在带有杂质的碱基，因为这可能会导致扩增产物的杂交和二级结构形成。
7.引物序列应尽量避开重复序列、富含AT或GC的序列、高度变异的区域和基因座之间的序列相似性较高的区域。
8.引物设计应考虑到引物长度、温度和浓度的相互配合，以保证对目标序列的特异性扩增。
PCR使用说明引物设计技巧
PCR使用说明引物设计技巧PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，可用于扩增DNA片段以及进行基因分型、疾病诊断和DNA克隆等应用。
在PCR实验中，引物的设计是非常关键的步骤之一，合理的引物设计可以确保PCR反应的特异性和高效性。
以下是一些PCR引物设计的技巧和原则。
1.引物长度：引物长度应该在18到30个核苷酸对之间，一般来说，较短的引物可以提高反应的特异性，但也容易导致非特异性扩增。
较长的引物可以提高特异性，但也会降低PCR反应的效率。
2.引物的碱基组成：引物的G+C含量应在40%到60%之间，避免过高或过低的含量，以确保引物的熔解温度适中。
3.引物之间的互补性：引物之间不应有任何互补性，以避免引物之间的杂交和产生非特异性扩增。
4. 引物的熔解温度：引物的熔解温度（Tm）应该相近，通常设计为60℃至70℃之间。
可以使用一些在线工具来计算引物的Tm，例如NCBI的Primer-BLAST。
5.引物的位点选择：引物应该选择在目标序列上独特的位点，避免引物在其他不需要扩增的区域上产生扩增。
可以使用序列比对工具，如BLAST，来确定引物的特异性。
6.引物的末端设计：引物的末端应该避免酶切位点，以防止引物被酶切和降解。
此外，末端的碱基对的GC含量应保持平衡，以确保引物的稳定性。
7.引物的序列结构：引物的序列中应避免重复和倒序重复的碱基序列，因为这些序列容易形成引物间的二级结构和非特异性扩增。
8.引物的交叉反应：引物的序列应该经过认真筛选，避免与其他非目标序列发生交叉反应。
在引物设计前，可以先使用基因序列比对工具，如BLAST，来检查引物是否会与其他区域发生交叉反应。
9.引物的引导方向：引物的引导方向应与目标序列的末端互补，以确保正确的扩增方向。
总而言之，PCR引物的设计应遵循特异性、高效性和可重复性的原则。
合理设计的引物对PCR实验的成功至关重要，可以提高扩增产物的特异性和产量，并避免非特异性扩增和交叉反应的发生。
pcr引物设计原理
pcr引物设计原理PCR引物设计原理。
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，它可以在体外迅速扩增DNA片段，是分子生物学实验中常用的技术手段之一。
而PCR引物设计是PCR技术成功实施的关键，合理的引物设计可以保证PCR反应的准确性和高效性。
本文将介绍PCR引物设计的原理和关键要点。
1. 引物的选择。
在PCR反应中，引物是起到扩增目的DNA片段的作用，因此引物的选择非常重要。
引物通常是由20-30个碱基组成的寡核苷酸，它们分别位于目的DNA片段的两端。
在选择引物时，需要注意以下几点：引物的长度，引物的长度通常在18-25个碱基之间，过长的引物可能会导致非特异性扩增，而过短的引物可能会导致特异性不足。
引物的碱基组成，引物的碱基组成需要符合一定的比例，其中GC含量在40%-60%之间为宜，这样可以保证引物在反应温度下的稳定性和特异性。
引物的特异性，引物需要与目的DNA片段的序列完全匹配，以确保扩增的特异性。
2. 引物的设计。
引物的设计通常是通过计算机软件进行，常用的软件有Primer3、Oligo等。
在设计引物时，需要输入目的DNA片段的序列，软件会根据一定的算法和规则自动生成合适的引物。
在引物设计过程中，需要注意以下几点：引物之间的配对，引物对之间的碱基配对需要避免形成二聚体或者内聚体，这样可以避免引物之间的相互作用影响PCR反应的效果。
引物的位置，引物需要位于目的DNA片段的两端，同时需要避开重复序列或者其他干扰因素，以确保扩增的特异性和准确性。
3. 引物的验证。
设计好引物之后，需要进行一定的验证工作，以确保引物的质量和特异性。
常用的验证方法包括：电泳分析，通过电泳分析引物扩增产物的大小和特异性，可以初步判断引物的质量和特异性。
序列分析，对引物扩增产物进行测序分析，可以确保引物扩增的是目的DNA 片段，而不是其他非特异性产物。
4. 引物的优化。
在实际应用中，有时候设计的引物可能并不能满足要求，需要进行一定的优化工作。
PCR引物设计基本思路
PCR引物设计基本思路PCR（聚合酶链反应）引物设计是一项非常重要的实验技术，它是基因分析和遗传工程等领域中广泛应用的技术手段之一、PCR引物设计的基本思路主要包括以下几个方面：1.确定目标序列：首先需要确定目标序列，即希望通过PCR扩增的DNA片段。
这个目标序列可以是基因、片段、启动子、转录因子结合位点等。
可以通过数据库或文献等途径获取目标序列的信息。
2.序列分析：对目标序列进行序列分析，包括序列长度、碱基组成、GC含量、特殊结构等。
这些信息有助于设计合适的引物和优化PCR反应条件。
3.引物设计：设计引物是PCR实验中的关键步骤。
引物是PCR扩增的起始和终止点，它们应该与目标序列的两个相对互补的部分序列相匹配。
引物设计时需要遵循以下几点原则：(1)引物长度：通常引物的长度为18-30个核苷酸，过短的引物可能导致非特异性扩增，过长的引物可能导致扩增效率低。
(2)引物Tm值：引物的熔解温度（Tm）是引物设计时需要考虑的一个重要参数，它表示引物在反应中解离的温度。
引物的Tm应该在50-65摄氏度之间，引物间的Tm值差异不应超过5摄氏度，以保证PCR反应的特异性。
(3)引物末端：引物的末端需要避免引入无法拓展的结构或序列，如酶切位点、重复结构等。
(4)引物互补性：引物之间的互补性需要避免，避免引物间形成二聚体或别构体，会影响PCR反应的特异性和效率。
(5)引物的特异性：引物应该与目标序列特异性地匹配，避免与其他DNA序列发生不特异性结合，可以通过引物序列的BLAST分析来评估引物的特异性。
(6)引物GC含量：引物的GC含量会影响引物的稳定性和Tm值，通常引物的GC含量应在40-60%之间。
4.引物修饰：在设计引物时还可以考虑引入一些修饰，如引物末端的磷酸化、荧光标记或化学修饰物等，用以增加PCR扩增产品的检测灵敏度或特异性。
5.设计控制实验：为了验证PCR扩增实验的结果，应设计相应的对照实验。
比如设计阳性对照，使用已知的模板DNA进行PCR扩增，用以验证PCR反应的可靠性和灵敏性。
PCR引物设计技巧
PCR引物设计技巧PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，用于扩增目标DNA序列。
PCR的成功与否，很大程度上依赖于引物的设计质量。
一个好的PCR引物设计可以确保反应的特异性、有效性和稳定性。
以下是一些PCR引物设计的技巧。
1.引物长度和GC含量：一般而言，引物长度应在18-24个碱基之间。
引物的GC含量应在40-60%左右。
过低的GC含量可能导致反应特异性不足，而过高的GC含量可能导致引物相互结合和非特异性扩增。
2.引物序列选择：引物序列应选择在目标序列上具有一定变异性的区域。
引物的序列不应包含重复序列、自身互补序列或多聚性序列，以免导致引物间的相互结合或非特异性扩增。
3.引物特异性检测：在设计引物时，应进行引物特异性的检测。
可以使用生物信息学工具，如BLAST，检查引物序列是否与其他非目标序列有任何匹配。
特别是在设计引物用于复杂的基因组中时，应特别关注引物的特异性。
4. 引物互补性检测：在进行引物设计时，应检查引物之间的互补性。
引物之间的互补性可能导致引物相互结合，影响扩增效率和特异性。
可以使用生物信息学工具，如OligoAnalyzer，检查引物之间的互补性。
5.引物长度和跨越剪切位点：在设计用于检测RNA的引物时，应特别注意引物的长度和是否跨越了剪切位点。
过长的引物可能跨越剪切位点导致扩增产物的长度不一致，降低扩增特异性。
6.引物末端修饰：PCR引物的末端可以根据需要进行一些修饰，如磷酸化、生物素化、荧光标记等。
这些修饰可以用于后续的检测和分离。
7.引物浓度和混合物：在PCR反应中，引物的浓度对反应的成功与否至关重要。
一般而言，两个引物的浓度应保持一致。
此外，在进行多重PCR反应时，不同引物的混合物也需要进行优化，以确保特异性和扩增效率。
8.引物的核酸相互作用力：引物的核酸相互作用力是指引物与模板DNA之间的结合力。
引物的核酸相互作用力可以通过计算引物的熔解温度（Tm）来评估。
PCR引物设计原理及原则
PCR引物设计原理及原则PCR引物设计是指在聚合酶链反应（PCR）中使用的引物的设计过程。
PCR引物起到了在PCR扩增过程中特异性识别和引导DNA复制反应的作用。
因此，PCR引物的设计直接影响PCR反应的成功与否。
以下是PCR引物设计的原理及原则。
一、PCR引物设计的原理1.引物长度：引物的长度通常为18-25个碱基对。
引物过短可能导致非特异性引物结合，引物过长可能导致反应条件不佳。
较长引物（20-25个碱基对）通常用于扩增目标DNA较长的片段，而较短引物（18-20个碱基对）通常用于扩增较短的目标DNA片段。
2.引物序列：引物的序列应与目标DNA序列互补，以确保引物与模板DNA的特异性结合。
引物序列应尽量避免重复序列或序列中的碱基。
此外，引物序列的催化部位（3'端）应该具有高度的特异性与模板DNA序列匹配，以确保PCR反应的特异性。
3.引物的Tm值：引物的Tm值是指反应温度下引物和目标DNA序列的熔解温度。
引物的Tm值应相似，通常在56-64℃之间，以保证引物与目标DNA序列结合的特异性和稳定性。
4.引物的GC含量：引物的GC含量对PCR反应的效率和特异性有重要影响。
引物的GC含量应控制在40-60%之间，过高或过低的GC含量可能导致引物结合能力不佳。
二、PCR引物设计的原则1.引物特异性：引物应与目标DNA序列的特异区域互补，以确保特异性扩增。
在设计引物时，应避免引物与非目标序列互补或有任何交叉杂交现象。
2.引物长度：引物长度通常为18-25个碱基对，过短或过长的引物可能导致PCR反应效果不佳。
3.引物序列中避免重复序列：引物序列中避免过多的重复序列，以免引发非特异性引物结合。
4.引物催化部位特异性：引物的催化部位（3'端）应具有高度的特异性与模板DNA序列匹配，以确保PCR反应的特异性。
5.引物的Tm值匹配：引物的Tm值应相似，通常在56-64℃之间，以确保引物在反应温度下与模板DNA序列结合的稳定性。
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PCR引物设计基本思路1.根据实验需要，确定需要扩增的DNA序列，并知道其CDS区序列（编码结构基因区,即从起始密码子区至终止密码子区）ncbi网站查询RBS 149..153/gene="eryF"CDS 158..1372/gene="eryF"1 ggatcccgat cgtgtcggag g aa gaggcc a agtcgcgccg ccc cgaccag ctgctggtgc61 tgccctggat ctaccgcgac gggttcgtcg aacgcgagca ggagttcctc gctggcggcg121 gaaagctgat cttcccccta ccccgactgg aagtcgt atg acgaccgttc ccgatctcga181 aagcgactcc ttccacgtcg actggtaccg cacctacgcc gagctgcgcg agaccgcgcc241 ggtgacgccg gtgcgcttcc tcggccagga cgcgtggctg gtcaccggct acgacgaggc301 gaaggccgcg ctgagcgacc tgcgcctgag cagcgacccg aagaagaagt acccgggcgt361 ggaggtcgag ttcccggcat acctcggttt ccccgaggac gtgcggaact acttcgccac421 caacatgggc accagcgacc cgccgaccca cacccggctg cgcaagctgg tgtcgcagga481 gttcaccgtc cgccgcgtgg aggcgatgcg gccccgcgtc gagcagatca ccgcggagct541 gctcgacgag gtgggcgact ccggcgtggt cgacatcgtc gaccgcttcg cccacccgct601 gcccatcaag gtcatctgcg agctgctcgg cgtcgacgag aagtaccgcg gggagttcgg661 gcggtggagc tcggagatcc tggtcatgga cccggagcgg gccgaacagc gcgggcaggc721 ggccagggag gtcgtcaact tcatcctcga cctggtcgag cgccgccgca ccgagcccgg781 cgacgacctg ctgtccgcgc tgatcagggt ccaggacgac gatgacggtc ggctcagcgc841 cgacgagctg acctccatcg cgctggtgct gctgctggcc ggtttcgagg cgtcggtgag901 cctcatcggg atcggcacct acctgctgct cacccacccg gaccagctcg cgctggtgcg961 gcgggacccg tcggcgctgc ccaacgccgt cgaggagatc ctgcgctaca tcgctccgcc1021 ggagaccacc acgcgcttcg ccgcggagga ggtggagatc ggcggtgtcg cgatccccca1081 gtacagcacg gtgctggtcg cgaacggcgc ggccaaccgc gacccgaagc agttcccgga1141 cccccaccgc ttcgacgtca cccgcgacac ccgcggccac ctgtcgttcg ggcagggcat1201 ccacttctgc atgggccggc cgctggccaa gctggagggc gaggtggcgc tgcgggcgct1261 gttcggccgc ttccccgctc tgtcgctggg aatcgacgcc gacgacgtgg tgtggcggcg1321 ttcgctgctg ctgcggggca tcgaccacct accggtgcgg ctcgacgga t ga gcacctgg1381 ctgcggcggt tcggtcctcc cgtcgagcac cgggcgcggc tggtgtgctt cccgcacgcg1441 ggagccgcgg ccgactccta cctcgacctc gcgcgcgcct tggcgcccga gatcgacgtg1501 cacgccgtgc agtacccggg gcgccaggac cgccgcgacg aggagcccct gggcaccgcc1561 ggcgagatcg ccgacgaggt ggccgccgtg ctgcgcgcgt cgggcggcga cggcccgttc1621 gccctg ttcg ggcacagcat g ggcgcg ttg atcgcctacg agacggcgcg caggctcgaa1681 cgcgagcccg gcggcgggcc gctgcggctg ttcgtgtccg ggcagaccgc cccgcgcgtg1741 cacgagcgcc gcaccgacct gcccggcgac gacggtctgg tggacgagct gcgccggctc1801 ggcaccagcg aggcggcgct ggccgacgag gccctgctcg ccatgtcgct gccggtgctg1861 cgcgccgact accgcgtgct gcgctcctac gcctgggcgg acggaccacc gctgcgggcc1921 ggcatcaccg cgctgtgcgg cgacgccgac ccgctgaccg cgaccgggga cgccgagcgc1981 tggttgcagc actcggtcat ccccggccgg accaggacct tccccggcgg gcacttctac2041 ctgggtgaac aggtcaccga ggtggccggt gccgtgcgcc gggacctgct acgcgccggg2101 cttgcgggct gaggcgatca cgaagtcgag cgcgggcagc tcgcccttca tgcccgagtc2161 gctggtcagc gaccgcttga cctggctgta gaagagcctg ctcacgctct tcttgaacga2221 ctcgtcctgc aggcacctgg ctg2.选择所需的载体,确定合适的酶切位点。
所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点，且载体上其它地方无该酶切位点。
这样连接以后再构建新的质粒时选择酶的空间更大些。
并保证所需扩增的DNA序列中无该酶切位点（generuner分析）。
3.初步确定设计的引物长度。
一般为15～30bp，引物过短会影响到扩增的特异性，过长会影响扩增速率。
如果扩增产物≤500bp，引物长度为16～18bp即可。
若扩增产物为4～5kb，引物最好不要少于24bp。
引物3’末端应含有所研究基因特异序列中的17～30bp。
4.5正向引物的设计：4.1 酶切位点的位置选择。
一般情况下都需要在引物的5’，3’端增加酶切位点，然后利用该酶将扩增产物切下，接到相应的载体上。
A：扩增的DNA用于表达时：（1）自身有启动子。
如：LOCUS VITVHBA 689 bp DNA linear BCT 26-APR-1993 DEFINITION Vitreoscilla sp. hemoglobin (VHb) gene, partial cds.ACCESSION M30794 M31721 X13516VERSION M30794.1 GI:155319KEYWORDS hemoglobin; promoter region.SOURCE Vitreoscilla sp.ORGANISM Vitreoscilla sp.Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales;Neisseriaceae; Vitreoscilla.REFERENCE 1 (bases 42 to 689)AUTHORS Khosla,C. and Bailey,J.E.TITLE The Vitreoscilla hemoglobin gene: molecular cloning, nucleotidesequence and genetic expression in Escherichia coliJOURNAL Mol. Gen. Genet. 214 (1), 158-161 (1988)MEDLINE 89143453PUBMED 3067078REFERENCE 2 (bases 1 to 210)AUTHORS Khosla,C. and Bailey,J.E.TITLE Characterization of the oxygen-dependent promoter of theVitreoscilla hemoglobin gene in Escherichia coliJOURNAL J. Bacteriol. 171, 5995-6004 (1989)COMMENT Original source text: Vitreoscilla sp. DNA.SWISS-PROT; P04252; BAHG$VITSP.FEATURES Location/Qualifierssource 1..689/organism="Vitreoscilla sp."/mol_type="genomic DNA"/db_xref="taxon:60"misc_signal 33..40/note="promoter 2"-35_signal 55..61-10_signal 73..79misc_signal 86..92/note="promoter 1"RBS 130..133/note="putative ribosome binding site; putative"CDS 142..582/note="hemoglobin"/codon_start=1/transl_table=11/protein_id="AAA27585.1"/db_xref="GI:155320"/translation="MLDQQTINIIKATVPVLKEHGVTITTTFYKNLFAKHPEVRPLFDMGRQESLEQPKALAMTVLAAAQNIENLPAILPAVKKIAVKHCQAGVAAAHYPIVGQELLGAIKEVLGDAATDDILDAWGKAYGVIADVFIQVEADLYAQAVE"ORIGIN1 aagcttaca g gacgc tgggg ttaaaagtat ttgagttttg atgtggatta agttttaaga61 ggcaataaag gtgctgctac accatactga tgtatggcaa aaccataata accatactga121 atgaactta a gga agaccct c atg ttagac cagcaaacca ttaacatcat caaagccact181 gttcctgtat tgaaggagca tggcgttacc attaccacga ctttttataa aaacttgttt241 gccaaacacc ctgaagtacg tcctttgttt gatatgggtc gccaagaatc tttggagcag301 cctaaggctt tggcgatgac ggtattggcg gcagcgcaaa acattgaaaa tttgccagct361 attttgcctg cggtcaaaaa aattgcagtc aaacattgtc aagcaggcgt ggcagcagcg421 cattatccga ttgtcggtca agaattgttg ggtgcgatta aagaagtatt gggcgatgcc481 gcaaccgatg acattttgga cgcgtggggc aaggcttatg gcgtgattgc agatgtgttt541 attcaagtgg aagcagattt gtacgctcaa gcggttgaa t aa agtttcag gccgctttca601 ggacataaaa aacgcaccat aaggtggtct ttttacgtct gatatttaca cagcagtttg661 gctgttgcca aaacttggga caaatattg①扩增片段里应包含启动子，所以酶切位点应该在启动子前面。