甜樱桃品种的SSR鉴定

生物技术通报ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ・研究报告・２００７年第５期收稿日期：２００７－０４－１０作者简介：蔡青（１９８２－），女，山东，果树学，硕士；Ｅ－ｍａｉｌ：ｃａｉｑｉｎｇ８２０２２１＠１６３．ｃｏｍ通讯作者：马焕普（１９５６－），女，河北，研究员，主要研究方向为果树生理与调控技术，通讯地址：ｐｕｍａ５４３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ张开春（１９６５－），男，河南，研究员，主要研究方向为木本植物分子遗传，通讯地址：ｚｈｎａｇｋａｉｃｈｕｎ＠ｂａａｆｓ．ｎｅｔ．ｃｎ甜樱桃（ＰｒｕｎｕｓａｖｉｕｍＬ．）属于蔷薇科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）李属，被誉为果中珍品，享有“春果第一枝”的美称，是近几年北京地区发展迅速、经济价值较高的树种。

因此，甜樱桃种质鉴定是甜樱桃种质资源研究的基础和发展的前提，也是苗木市场管理的技术手段。

以往对品种鉴别主要靠形态指标，但对于差异并不明显的个体，传统的形态特征很难识别，而利用分子标记（ＲＡＰＤ，ＡＦＬＰ，ＳＳＲ等）对品种进行鉴定和分类，是一种简单准确而且可靠的方法。

ＳＳＲ技术由于具有多态性丰富和共显性遗传等特点和其他分子标记一起被广泛应用于植物基因组的研究，如苹果［１］、梨［２］、桃［３］、猕猴桃［４］、葡萄［５］等。

而ＳＳＲ标记应用于樱桃上的报道较少，仅在国外有报道，如ＹｉｌｄｉｚＡ等［６］对８１个土耳其酸樱桃品种进行亲缘关系分析，而在国内尚未见报道。

本研究应用Ｓ－基因和ＳＳＲ分子标记技术鉴定３０个甜樱桃品种并绘制指纹图谱，以期为甜樱桃种质资源鉴定和品种亲缘关系分析在分子水平上提供依据。

１材料与方法１．１材料试材甜樱桃（ＰｒｕｎｕｓａｖｉｕｍＬ．）品种取自北京市农林科学院林业果树研究所。

（品种及其亲本见表１）１．２方法１．２．１模板ＤＮＡ的制备春季取嫩叶，按顾红雅等［７］报道的ＣＴＡＢ法，从嫩叶中提取基因组ＤＮＡ。

提取的ＤＮＡ质量和浓度采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定。

样品稀释到２０ｎｇ／μｌ保存备用。

１．２．２ＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系在１５μｌ的ＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系中，加入１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ１．５μｌ，２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２１．５μｌ，甜樱桃品种的ＳＳＲ鉴定蔡青１姜立杰２马焕普１张开春２张晓明２闫国华２（１北京农学院，北京１０２２０６；２北京市农林科学院林业果树研究所，北京１０００９３）摘要：在建立甜樱桃品种ＳＳＲ分析体系基础上，从２４对引物中筛选出５对多态性高、分辨能力强的引物（即ＰｃｅＧＡ２５、ＰＭＳ３、ＰＭＳ４９、ＰＳ０８Ｅ０８、ｐｃｈｐｇｍｓ３），并且结合Ｓ－基因共同对３０个甜樱桃品种进行区分鉴别。

对生产上应用ＳＳＲ技术和Ｓ－基因检测甜樱桃品种真实性和纯度作了展望。

关键词：樱桃ＳＳＲＳ－基因品种鉴定指纹图谱ＳＳＲＡｎａｌｙｓｉｓｆｏｒＣｈｅｒｒｙＣｕｌｔｉｖａｒｓＣａｉＱｉｎｇ１ＪｉａｎｇＬｉｊｉｅ２ＭａＨｕａｎｐｕ１ＺｈａｎｇＫａｉｃｈｕｎ２ＺｈａｎｇＸｉａｏｍｉｎｇ２ＹａｎＧｕｏｈｕａ２（１Ｂｅｉｊｉｎｇｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０２２０６；２ＢｅｉｊｉｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００９３）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｉｖｅｐａｉｒｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓ（ｉ．ｅＰｃｅＧＡ２５，ＰＭＳ３，ＰＭＳ４９，ＰＳ０８Ｅ０８，ｐｃｈｐｇｍｓ３）ｗｉｔｈｈｉｇｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓａｎｄｐｏｗｅｒｆｕｌｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅｎｅｓｓｈａｖｅｂｅｅｎｓｅｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍ２４ｐａｉｒｓｏｆｐｒｉｍｅｒａｆｔｅｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｔｈｅＳＳＲａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍｉｎｃｈｅｒｒｙｖａｒｉｅｔｉｅｓ．Ｂｅｓｉｄｅｓ，ｔｈｅＳｇｅｎｅｗａｓａｌｓｏｃｏｍｂｉｎｅｄｔｏｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｔｈｅ３０ｃｕｌｔｉｖａｒｓ．ＫｅｙｐｏｉｎｔｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｔｒｕｅｎｅｓｓａｎｄｐｕｒｉｔｙｏｆｃｈｅｒｒｙｖａｒｉｅｔｉｅｓｏｆＳＳＲｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｗｅｒｅｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＣｈｅｒｒｙＳＳＲＳ－ｇｅｎｅＣｕｌｔｉｖａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＤＮＡＦｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ２００７年第５期２ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ１．５μｌ，１０μｍｏｌ／Ｌ引物１μｌ，５Ｕ／μｌＴａｑ聚合酶０．２μｌ，２０ｎｇ模板ＤＮＡ，用双蒸水补足体系到１５μｌ。

引物序列参照ＹｉｌｄｉｚＡＫａｃａｒ等［６］、Ｅ．Ｄｉｒｌｅｗａｎｇｅｒ［８］报道的序列由上海ｓａｎｇｏｎ公司合成，ＴａｑＤＮＡ酶、ｄＮＴＰｓ均购自北京华美公司。

１．２．３ＳＳＲ－ＰＣＲ扩增程序９４℃４ｍｉｎ，９４℃４５ｓ，５７℃１ｍｉｎ，７２℃１ｍｉｎ，３５个循环，７２℃１０ｍｉｎ。

ＰＣＲ仪为ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｃ生产的ＰＴＣ－１００ＴＭ型。

１．２．４ＰＣＲ产物的检测在扩增反应结束后，用６．０℅的聚丙烯酰胺胶７０ｍｌ加入１０％过硫酸铵４００μｌ和ＴＥＭＥＤ４０μｌ制胶。

用ＢｉｏＲａｄ３０００电泳系统７０Ｗ恒功率电泳３￣４ｈ，银染检测。

２结果与分析２．１Ｓ－基因电泳分析图１所示，通用引物ＢＦＰ７３／７４在３０个甜樱桃品种的基因组ＤＮＡ扩增后得到的谱带。

可以分十种谱带类型，例如：红灯（４）、先锋（１７）和红艳（２７），它们都在８８６和９００处有带，和陈晓流等所鉴定的结果相似。

２．２引物筛选从２４对ＳＳＲ引物中筛选出５对多态性较高、带型较清楚、分辨率较高的引物。

其引物序号分别为ＰｃｅＧＡ２５、ＰＭＳ３、ＰＭＳ４９、ＰＳ０８Ｅ０８、ｐｃｈｐｇｍｓ３。

表２为筛选出的５对引物。

２．３品种区分鉴定通过Ｓ－基因电泳图谱（图１）将３０个供试品种分为十类，在这个基础上通过ＳＳＲ引物扩增出的谱带（图２），可以将全部供试甜樱桃品种区分开。

例如：引物ＰｃｅＧＡ２５可以将引物ＢＦＰ７３／７４区分不开的红艳（２７）、红灯（４）和先锋（１７）区分出红艳（２７）；再用引物ＰＭＳ３把红灯（４）和先锋（１７）区分开。

其余材料都可以按此方法区分开。

３０个甜樱桃品种鉴别表（表３）。

３结论与讨论ＳＳＲ标记是继ＲＡＰＤ标记后出现的基于ＰＣＲ反应的ＤＮＡ标记技术。

因其ＳＳＲ两侧的序列在种间甚至是属间具有很强的保守性，使得ＳＳＲ引物具有很好的通用性；由于ＳＳＲ因重复数目的不同，而得到ＳＳＲ标记呈现出高度多态性；ＳＳＲ－ＰＣＲ反应中采用双引物，且引物的长度均为２０ｂｐ左右，而使它的结果更为稳定，重复性也比ＲＡＰＤ大大的增强，这也使得ＳＳＲ反应体系的结果在很多实验室间交流。

ＳＳＲ标记的这些特点使ＳＳＲ技术已经应用于很多领域的研究。

我国作为樱桃的起源地之一，长期栽培驯化，已经培育出很多新品种。

在国内，本研究是首次对国内外的甜樱桃品种进行鉴定区分［９］。

图１引物ＢＦＰ７３／７４扩增电泳图表２试验中所使用的ＳＳＲ引物蔡青等：甜樱桃品种的ＳＳＲ鉴定１７１表１试验中所使用的材料分子标记技术作为一种新的品种资源鉴定技术要应用于生产实际，应该满足稳定性好、分辨率高、多态性强、效率高和方便快捷。

本实验研究结果表明，ＳＳＲ技术和Ｓ－基因鉴定相结合的方法是稳定可靠的，分辨精度可达突变变异水平，以筛选出的多态性强的引物，具有很高的工作效率，以满足上述要求。

随着分子标记技术的不断发展和完善，ＳＳＲ技术将在ＤＮＡ水平上鉴别不同品种是否存在差异，从而科学、准确地判断特定品种的特异性、一致性和稳定性，为保护育种产、鉴定和检测果树品种苗木真实性和纯度提供客观、科学和准确的技术保障［１０］。

Ｍ３０该图点样顺序从右到左依次为１－３０１图２引物ｐｃｈｐｇｍｓ３对３０个甜樱桃品种的ＳＳＲ扩增情况图３引物ＰＳ０８Ｅ０８对３０个甜樱桃品种的ＳＳＲ扩增情况编号和品种名称见表１编号和品种名称见表１（下转第１７８页）频再生体础，本研究初步建立了串叶松香草高频再生体系（以幼嫩叶片为受体材料，ＭＳ＋６－ＢＡ（２ｍｇ／Ｌ）＋ＮＡＡ（０．１ｍｇ／Ｌ）为愈伤组织诱导和芽分化培养基，１／２ＭＳ＋ＩＢＡ（０．１ｍｇ／Ｌ）为根诱导培养基）。

本研究中选择兔出血症病毒的外壳蛋白基因ＶＰ６０作为转化基因，是由于兔出血症病毒是高度致死性的疾病，传统灭活苗应用成本高，并且有安全隐患，研究出可食用疫苗可以让兔在饲喂时获得对兔出血症的免疫力，此种途径高效、安全。

为了提高ＶＰ６０－ｐＢＩ１２１对串叶松香草的转化效率，在实验中对外植体的预培养时间、侵染的农杆菌菌液浓度、外植体与农杆菌的共培养时间、适宜的羧苄青霉素浓度以及筛选阳性植株的卡那霉素浓度进行了优化，以期得到ＶＰ６０－ｐＢＩ１２１对串叶松香草高转化效率的因素组合（外植体预培养时间为３ｄ，侵染的农杆菌浓度为ＯＤ６００＝０．８，共培养天数为３￣４ｄ，筛选的卡那霉素浓度为４０ｍｇ／Ｌ）；在农杆菌脱菌过程中，随着继代次数的增加，外植体彻底脱菌的难度较大，可能是由于农杆菌进入了维管束，对抗生素不是很敏感，此时应该缩短继代的培养时间和加大羧苄青霉素浓度到５００ｍｇ／Ｌ。

在研究中ＶＰ６０基因的启动子为ＣａＭＶ３５Ｓ，ＣａＭＶ３５Ｓ作为最常用的组成型表达的启动子，在双子叶植物中有很高的启动效率，但是ＣａＭＶ３５Ｓ的持续表达会造成细胞能量的浪费和由此造成对细胞正常生理活动的干扰，选择组织特异性启动子、诱导型启动子或应用叶绿体转化技术有望可以解决这一问题。

实验中，我们筛选到了两株拟转基因植株，但是在卡那霉素的选择压力下，芽分化后，生根较为困难，植株长势相对弱点，因此暂时不方便移栽。

未来移栽后，等植株长到一定高度，可以进行ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测。

将为下一步在串叶松香草中生产兔出血症病毒可食用疫苗的研究提供基础资料，有较好的生产应用前景。

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