小分子肽电泳

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析小分子多肽[日期：2007-02-13] 来源：[字体：大中小]SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析小分子多肽第四军医大学学报2000年第21卷第6期石继红赵永同王俊楼韩苇颜真张英起摘要：目的研究SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示小分子多肽的方法.方法观察不同方法处理的样品，上样量对电泳结果的影响及对分子量标准（M r2512～16949）进行直线回归分析.结果样品的不同处理条件未见有差异；在该实验系统条件下上样样品为每孔5～10μg较佳；分子量标准直线回归系数r=-0.962.结论样品处理方便；上样量少；在160 g·L-1 T，60 g·kg-1 C较低的丙烯酰胺含6 mol·L-1脲的分离胶中能够显示M r为2512的多肽，是一种显示小分子多肽的较好方法.关键词：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；肽；蛋白质0引言20世纪60年代Shapiro建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法之后，Weber，Glossmann和Douglas等人进行了多次改进，已显示出了在分离、鉴定和纯化蛋白质方面的优越性，但对于M r小于10000的蛋白质来说是无能为力的［1］. 20世纪80年代初Schägger等［2］应用脲分离蛋白质复合体亚单位的11种蛋白质，但分离效果不甚理想且重复性较差.之后他们又进行了系统地研究和摸索，能够分离较大M r范围内的蛋白质.随着生物技术的飞速发展和基因工程药物的大量涌现，具有高生物活性的小分子多肽的分离、纯化和鉴定已显得尤为突出.我们在进行基因工程药物的开发研制中，对SDS-PAGE方法进行了多次改进，在较低的丙烯酰胺浓度下取得了理想的结果.此法所需仪器简单，操作方便，重现性好，时间短，只需微克量的多肽便可显带且能迅速估计出其M r，值得进一步推广和利用.1材料和方法1．1试剂和仪器SDS、脲、甘油、过硫酸铵均为分析纯，西安化学试剂厂出品；丙烯酰胺（分析纯）为汕头市光华化学厂产品；N，N′-甲叉双丙烯酰胺（分析纯）为浙江黄岩人民化工厂生产；tris（分析纯）为成都试剂厂出品；TEMED为BIO-RAD产品；Tricine(Ultra pure Grade)为Solon Ind产品. BIO-RAD小型垂直式电泳附件模具；FD-201稳压稳流电泳仪（上海医用分析仪器厂）.1．2肽分子质量标准肽分子质量标准的M r范围2512～16949为Pharmacia lKB 公司产品. 胸腺肽α1是美国加州圣马刁市赛生药品公司产品（商品名“ZADAXIN”），是一乙酰化的多肽，M r为3108，pI 3.8. 经Sephadex G-25柱去除所含的甘露醇，然后冷冻干燥，用样品缓冲液配成所需样品.1．3方法1．3．1电泳贮存液的配制阳极缓冲液中Tris为0.2 mol·L-1用HCl调pH值至8.9.阴极缓冲液为0.1 mol·L-1的Tris，0.1 mol·L-1的Tricine和0.01 g·L-1的SDS溶液，其pH 值约为8.25. 胶缓冲液为3.0 mol·L-1的Tris和0.03 g·L-1的SDS，用HCl调pH值至8.4.称取48 g丙烯酰胺和1.5 g N，N′-甲叉双丙烯酰胺溶于100 mL纯水中，溶解混匀后经4号滤纸过滤即得到495 g·L-1 T，30 g·kg-1 C的贮存液；称取46.5 g丙烯酰胺和3.0 g N，N′-甲叉双丙烯酰胺溶于100 mL纯水中，同样得到495 g·L-1 T，60 g·kg-1 C的贮存液（T代表丙烯酰胺的总浓度，C代表交联度）.1．3.2胶的制备与一般SDS-PAGE电泳相似［3］，按Tab1给出的数据分别配制分离胶、间隙胶和浓缩胶，依次灌胶.表1分离胶、间隙胶和浓缩胶的组成tab 1Composition of separating, spacer and stacking gelsa:495 g·L-1T,30 g·kg-1C;B:495 g·L-1 T,60 g·kg-1C. T: the total percentage concentration of both monomers；C: the percentage concentration of the corosslinkage.1．3.3样品缓冲液的制备及样品的处理蛋白质样品与上样缓冲液（4 g·L-1 SDS，120 g·L-1甘油，50 mol·L-1 tris，20 mL·L-1巯基乙醇含0.1 g·L-1溴酚蓝，pH6.8）混合均匀，分别按40 ℃孵育30 min；60 ℃孵育10 min和煮沸2 min处理.1．3．4电泳条件内槽装阴极缓冲液、外槽用阳极缓冲液恒压电泳，先40 v约1 h，当样品进入分离胶时，电压升至60 V约2 h.1．3．5染色、脱色和胶的保存电泳完毕时胶置于染色液［2.5 g·L-1考马斯亮蓝R-250的乙醇（V）∶冰乙酸（V）∶水（V）为9∶2∶9］中振荡染色1.5～2 h，转至脱色液（400 mL·L-1的乙醇，40 mL·L-1的冰乙酸）中扩散脱色，直到背景清晰.胶的保存与一般SDS-PAGE类同［3］.2结果2．1不同处理的样品对SDS-PAGE的影响多肽样品经上述3种不同处理，经SDS-PAGE后，分子质量蛋白标准（M r2512～16949）没有电泳差异，均能较清晰地显示6条带（Fig 1）.分子质量蛋白标准分别在每孔上不同量的蛋白质（Fig 2），当上样量为1μg 时，分子质量蛋白标准仅能显示其中的5条带.当上样量达到5～10 μg时，M r 2512的肽带明显可见.2．2分子量标准蛋白回归方程及对低分子量标准品的分析应用160 g·L-1T，60 g·kg-1C含6 mol·L-1脲的丙烯酰胺凝胶能够较好地显示标准蛋白的6条带（Fig1）. 对其M r对数（lgM r）和在分离胶中迁移的距离（μ）进行直线回归分析，回归方程为=-0.0378x + 4.5512，相关系数r = -0.962，从曲线查及胸腺肽α1单体的M r为3135（其理论M r为3108）.图1样品的不同处理fig 1Treated samples with different conditionlane 1, 4: 40℃30 min; Lane 2, 5: 60℃10 min; Lane3,6:100℃2 min图2样品量的不同对电泳的影响fig 2Quantity's effect on electrophrosisfrom lane 1 to 6 the protein quantity is 4, 8, 12, 16, 20, 24 μg respectively.3讨论SDS-PAGE的有效分离范围取决于聚丙烯酰胺的浓度和交联度，其孔径随着双丙烯酰胺：丙烯酰胺比率的增加而减小，比率接近于1∶20时，孔径达到最小值［3］. m r低于10 000的小分子肽，即使用较高浓度的聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE也不能完全分离［2］.杨联萍等［4］指出用含脲的SDS-PAGE，即使用银染方法M r小于8000的蛋白标准品也无着色.而我们用含6 mol·L-1脲160 g·L-1 t，60 g·kg-1 C的SDS-PAGE方法，不需银染而直接用2.5 g·L-1的考马斯亮蓝R-250染色1.5～2 h，即可把标准品中的6条带显示得非常清楚，且简单方便，上样量小，重复性好.实验范围内（蛋白标准M r为2512～16 949）肽M r的对数与迁移率呈良好的线性关系，相关系数r= -0.962. 我们以低M r胸腺素α1作参照，其结果3153与实际M r3108标准相符，从而证明该方法的准确性和待测样品结果的可信性，该方法是一种显示小分子多肽和估测其M r的较好方法.在含SDS缓冲液的样品中，小分子多肽的浓缩是较困难的，这是因为小分子多肽与SDS形成的复合体具有和SDS本身类似的电荷和大小，因此浓缩对于小分子多肽的SDS-PAGE来说就成了一个突出的问题［5］.上述方法中Tricine以阳离子形式存在可以作为拖尾离子，使小分子多肽能够在浓缩胶中形成尽可能窄的带.此外，快速的固定、染色和脱色对于小分子多肽电泳是必要的.这主要是由于小分子多肽对染料的结合力较弱，易扩散冲洗掉而着色较差.随着生物活性多肽物质的发现和多肽类药物的研制，小分子多肽电泳变得越来越重要，已成为生物活性物质纯化分析过程中不可缺少、经常使用的快速鉴定方法.作者简介：石继红（1963-），男（汉族），河北省枣强县人.讲师. Tel.(029)3374774石继红（第四军医大学生物技术中心，陕西西安710033)赵永同（第四军医大学生物技术中心，陕西西安710033)王俊楼（第四军医大学生物技术中心，陕西西安710033)韩苇（第四军医大学生物技术中心，陕西西安710033)颜真（第四军医大学生物技术中心，陕西西安710033)张英起（第四军医大学生物技术中心，陕西西安710033）参考文献：［1］Cleveland DW, Fischer SG, Kirschner MW et al. Peptide mapping by limited proteolysis in sodiun dodecyl sulfate and analysis by gel electrophoresis［J］. J Bio Chem,1977;252(3):1102-1106.［2］Schgger H, Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 KDa［J］. analBiochem, 1987; 166(2): 368-397.［3］金冬雁，黎孟枫译. 分子克隆实验指南［M］，第2版.北京：科学出版社，1992：880-887.［4］杨联萍，孔祥平，易学瑞. SDS-PAGE电泳对小分子多肽的分析［J］.生物工程进展，1998；18（6）：49-51.［5］Fish WW, Reynolds JA, Tanford C. Gel chromatography of proteins indenaturing solvents［J］. J Bio Chem, 1977; 245(19): 5166-5168。