最详细：CRISPR-Cas9系统原理应用及发展
基因编辑技术的新突破CRISPRCas在生物学研究中的应用
基因编辑技术的新突破CRISPRCas在生物学研究中的应用基因编辑技术的新突破CRISPR-Cas在生物学研究中的应用随着科技的飞速发展，基因编辑技术正逐渐成为生物学研究领域的热门话题。
其中，CRISPR-Cas系统被公认为最具潜力的基因编辑技术之一。
本文将介绍CRISPR-Cas技术的原理及其在生物学研究中的应用。
一、CRISPR-Cas技术的原理CRISPR-Cas系统是一种细菌和古细菌天然存在的免疫系统。
它通过特定的基因编辑工具，如Cas9酶，识别并切割DNA序列，从而实现基因组的定点修改。
CRISPR-Cas技术的核心是靶向性寻找和修饰DNA序列，其革命性在于只需简单设计合适的RNA引导序列即可实现对特定基因的编辑。
二、CRISPR-Cas技术在生物学研究中的应用1. 基因功能研究CRISPR-Cas技术为研究人员提供了一种高效的基因编辑方法，能够准确地揭示基因在细胞和生物体中的功能。
通过引入特定的突变或删除特定基因，研究人员可以验证基因对生物体生理和病理过程的影响，为研究疾病治疗提供有力的依据。
2. 疾病模型建立CRISPR-Cas技术使得建立动物模型更加简单和高效。
通过编辑动物模型的特定基因，研究人员能够模拟人类疾病的发展过程，进一步研究疾病的发生机制和药物治疗策略。
这为疾病的早期筛查和新药开发提供了重要的平台。
3. 农作物遗传改良CRISPR-Cas技术还在农业领域发挥着重要作用。
通过对农作物基因组的编辑，研究人员能够改良作物的品质、抗病能力和产量，从而提高农作物的经济效益和耐逆性。
这对于全球粮食安全和可持续发展具有重要意义。
4. 基因治疗CRISPR-Cas技术为基因治疗提供了新的可能性。
通过修复或替换患者异常基因，CRISPR-Cas技术可以治愈一些遗传性疾病，如囊性纤维化和遗传性失聪。
然而，基因治疗涉及伦理和安全等问题，仍需更多的研究和临床试验来验证其可行性和安全性。
三、CRISPR-Cas技术的挑战和前景尽管CRISPR-Cas技术在基因编辑领域具有巨大潜力，但仍面临一些挑战。
CRISPR-Cas9技术的发展与应用
普通生物学课程论文论文题目：CRISPR-Cas9技术的发展与应用姓名李沛哲专业班级：草业科学1702学院：动物科技学院学号：2017046402018年6月目录1．研究背景 (3)2.CRISPR的发展历程 (4)3．CRISPR的工作原理 (5)4．CRISPR/Cas9技术在疾病研究中的应用 (6)5．Cas9的应用优势 (7)6. 存在的问题 (7)7.展望 (8)【摘要】：CRISPR/ Cas9是一种用于靶向特定基因的DNA修饰工具，产生于细菌和古细菌，是一种适应性免疫系统，就像文字纠错软件，可以检测到病毒DNA并将其消灭并修复。
经过不断发展，已有多个物种应用这一系统用于研究，还可能将应用于基因编辑的科研、临床治疗等，现已证明CRISPR/ Cas9技术拥有一定优势，比如设计简单，操作容易，但是背后还存在道德伦理问题，以及该技术本身存在的问题如脱靶效应。
【关键词】：CRISPR/ Cas9 基因编辑疾病治疗免疫防御1．研究背景20世纪70年代DNA重组技术开始发展，这标志着生物学进入了一个新阶段。
分子生物学家第一次获得了操纵DNA分子的能力，使研究基因和利用它们开发新的药物和生物技术成为可能。
广义来说，基因组工程指的是对基因组进行有针对性的修改、其上下片段(如表观遗传标记)或其输出(如转录本)的过程。
在真核生物中，特别是在哺乳动物细胞中能够十分容易且有效地做到这一点，对改变基础科学、生物技术和医学有着巨大的作用生物的遗传信息储存在基因中，蛋白质是由编码基因决定的。
基因突变时，其编码的蛋白质的氨基酸组成也会改变，有些蛋白质会提前终止翻译，遗传疾病就会发生。
特异性的修饰基因组靶点，可以用来治疗遗传病，人们研究修饰位点时，在细菌和古细菌中找到了某种RNA，它可以用来标记位点，命名为gRNA。
CRISPR/Cas9蛋白和gRNA彼此之间相互作用，使得切割都发生在正确的位置。
CRISPR/ Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种用于靶向基因特定DNA修饰的工具，细菌在其成长环境中需要不断对抗病毒，CRISPR指的是一种适应性免疫系统，其产生于细菌和古细菌，它们为了应对病毒的攻击而逐渐进化，产生了这种系统，在CRISPR作用之下，可以检测到病毒的DNA并将其消灭，该机制中，Cas9是一种蛋白质，作用是寻找并切断病毒的DNA，使其降解，crRNA（CRISPR- derived RNA）与tracrRNA（trans- activating RNA）会结合形成一种复合物，该复合物能特异性识别靶基因序列，引导Cas9核酸内切酶在定位点将双链DNA剪断，然后，其非同源末端与修复机制相连接，将重新连上断裂处的基因组DNA，精准插入特定的DNA片段，这就是说，假如能够造成双链断裂，则可以诱发细胞进行修复，方式为干预或融入新基因，另外还有一种修饰DNA的方法即将外源DNA的一个片段整合进断裂处。
基因编辑技术CRISPR的原理及应用探索
基因编辑技术CRISPR的原理及应用探索近年来，基因编辑技术CRISPR-Cas9在科学界引起了广泛的关注和讨论。
这项技术不仅在基础研究中有着广阔的应用前景，也被认为是治疗一些遗传性疾病的有力手段。
本文将向读者介绍CRISPR的原理、应用及其对人类的影响。
一、CRISPR的原理CRISPR是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats的缩写。
CRISPR系统的起源可以追溯到细菌的天然免疫机制。
细菌在进化长期中演化出了一套高效、可靠的免疫机制，可以识别并摧毁入侵自身的病毒。
这项天然免疫机制的关键在于CRISPR基因，它能够记录病毒的遗传信息，并把这些信息存储在自身的DNA序列中。
当同样的病毒再次侵袭时，CRISPR基因能够识别并摧毁这些病毒。
这项天然免疫机制的厉害之处在于，它可以不断地学习和进化，遗传下来的CRISPR序列可以更好地适应环境变化。
利用这种自然免疫机制的原理，科学家们发现，CRISPR系统能够被用来在人类细胞中进行特定的DNA序列编辑。
这种编辑可以实现对基因的切除、插入或更改等操作。
CRISPR的核心组成部分是Cas9蛋白和RNA指导序列。
RNA指导序列能够识别并结合到具有特定序列的目标DNA上， Cas9蛋白则能够“剪切”目标DNA。
二、 CRISPR的应用1.基础研究CRISPR-Cas9技术是基础研究中的有力工具。
利用CRISPR技术，科学家们可以删除、修改、插入或移动目标DNA序列，从而直接观察目标基因在细胞或动物中的功能，进一步研究基因的生物学过程。
2. 遗传性疾病遗传性疾病是指由基因缺陷引起的一类疾病。
科学家们一直在探索利用基因编辑技术治疗遗传性疾病的可能性，CRISPR-Cas9技术的问世燃起了这种治疗的希望。
利用CRISPR技术，科学家们可以删除、修复及替换与疾病相关的基因缺陷部位。
目前，科学家们已经利用CRISPR技术成功治疗了一些小鼠模型的遗传性疾病。
CRISPR-Cas9技术的发展与应用
CRISPR-Cas9技术的发展与应用CRISPR/Cas9技术的发展与应用Zujia.W摘要：成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins, CRISPR/Cas)技术是近两年出现的一种定点基因组编辑新工具，具有灵活、高效、廉价且易于操作等优点。
这种新的基因编辑工具的出现，为基因功能、疾病分子机制的研究带来了便利,并且在研究和使用过程中不断创新发展，扩大了其应用范围。
关键词：成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白基因编辑转录调控基因治疗ABSTRACT: Clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR-associated proteins (CRISPR/Cas) has been developed as a new targeted genome editing tool since the last 2 years. Because it's flexible, efficient, cheap and easy to operate, it quickly surpass the previous technologies to become the hottest genome editing tool.The emergence of this new gene editing tool have brought great convenience for researcher in gene function, molecular mechanisms ofdisease.In the process of research and use,this technology is going through continuous innovation and development, expanding its scope of application.Key words: CRISPR/Cas genome edting transcription regulation gene therapy基因编辑技术指采用一定的方法技术对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的的突变，敲除、插入等改变。
基于CRISPRCas9的水稻多基因编辑及其在育种中的应用
基于CRISPRCas9的水稻多基因编辑及其在育种中的应用一、本文概述本文旨在探讨基于CRISPR-Cas9技术的水稻多基因编辑及其在育种中的应用。
我们将概述CRISPR-Cas9技术的原理及其在植物基因编辑中的优势，并详细介绍如何利用该技术实现水稻的多基因编辑。
我们还将讨论多基因编辑水稻在育种中的潜在应用，包括提高产量、改善品质、增强抗逆性等方面。
本文旨在为读者提供关于CRISPR-Cas9技术在水稻基因编辑和育种中应用的全面理解，以期为未来的植物育种研究提供参考和借鉴。
二、CRISPR-Cas9技术原理及其在水稻中的应用CRISPR-Cas9是一种强大的基因编辑工具，其基本原理源于细菌的自然防御机制。
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）序列是细菌基因组中的一段特定DNA序列，能够记住并抵抗外源DNA（如病毒DNA）的入侵。
Cas9蛋白是一种核酸酶，能够切割DNA。
当外源DNA侵入时，CRISPR序列指导Cas9蛋白在入侵DNA上特定位置进行切割，从而破坏外源DNA，保护细菌不受侵害。
在基因编辑领域，科学家们将CRISPR-Cas9系统用于在特定基因位置进行精确的DNA切割。
这一过程首先需要设计一个RNA分子（称为gRNA），它能够与目标DNA序列精确配对。
随后，Cas9蛋白与gRNA 结合，形成一个复合体，这个复合体能够在目标DNA位置进行切割，造成DNA双链断裂。
细胞为了修复这种断裂，会启动两种主要的DNA 修复机制：非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HDR）。
NHEJ修复常常导致DNA序列的插入或删除，从而引发基因功能的丧失，即所谓的基因敲除；而HDR修复则可以在存在外源DNA模板的情况下，精确地修复断裂的DNA，实现基因的定点替换或插入。
在水稻中，CRISPR-Cas9技术已被广泛应用于多个方面，包括功能基因鉴定、性状改良和抗病抗虫等。
crisprcas9基因编辑技术原理
crisprcas9基因编辑技术原理CRISPR-Cas9基因编辑技术是一种革命性的生物技术，它允许科学家以前所未有的精确度和效率对DNA进行编辑。
这项技术基于细菌的自然防御机制，已被广泛用于生物医学研究和基因治疗领域。
CRISPR-Cas9技术的原理CRISPR-Cas9系统是由两部分组成的：CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）和Cas9蛋白。
CRISPR是细菌基因组中的一种特殊结构，由一系列重复的DNA序列组成，这些序列之间由非重复的间隔序列隔开。
这些间隔序列实际上是细菌在遭遇病毒入侵时，从病毒DNA中截取的片段，用作识别和防御未来入侵的标记。
Cas9蛋白是一种核酸酶，它能够切割DNA。
在自然状态下，Cas9蛋白与CRISPR RNA（crRNA）和转录自CRISPR区域的一段RNA（tracrRNA）结合，形成复合体。
crRNA和tracrRNA的结合使得Cas9能够识别并结合到特定的DNA序列上，然后切割双链DNA。
CRISPR-Cas9的应用科学家们利用CRISPR-Cas9技术，通过设计特定的导向RNA（gRNA），可以指导Cas9蛋白精确地定位到目标DNA序列上。
一旦定位成功，Cas9蛋白就会在目标位点切割DNA，造成DNA双链断裂。
细胞自身的DNA修复机制会尝试修复这个断裂，科学家可以利用这一点，通过提供特定的DNA模板，引导细胞修复机制将特定的基因序列插入到目标位点，实现基因的添加、删除或替换。
CRISPR-Cas9的优势1. 精确性：CRISPR-Cas9可以精确地定位到基因组中的特定位置，实现单碱基的编辑。
2. 灵活性：通过改变导向RNA的序列，可以轻松地将Cas9蛋白引导到不同的基因位点。
3. 效率：CRISPR-Cas9技术大大提高了基因编辑的效率，使得基因编辑变得更加快速和经济。
CRISPR基因编辑技术的原理与应用
CRISPR基因编辑技术的原理与应用随着科技的不断进步，人类对基因组学的研究也越发深入。
而CRISPR基因编辑技术，作为一种全新的基因编辑工具，引起了科学界和公众的广泛关注。
它被广泛认为是基因编辑领域里的突破性技术，被预测会对农业、医学、能源和环境等领域产生深远的影响。
本文将介绍CRISPR基因编辑技术的原理和应用。
一、CRISPR基因编辑技术的原理CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein）系统是大肠杆菌或其他细菌中的一种天然免疫系统。
它能从吞噬入侵细菌的病毒中提取特定的DNA序列，并把这些序列保存在它的基因组里。
当细菌再次遭受同类的病毒入侵时，CRISPR/Cas系统就会识别并精确切割病毒的DNA，以此来抵御病毒感染。
CRISPR基因编辑技术则是基于这个天然免疫系统发展而来的一种人工基因编辑技术。
它利用了Cas9蛋白这个病毒识别和切割DNA的“剪刀”，并通过改变CRISPR/Cas系统中保存的目标DNA 序列，让Cas9精确切割目标DNA序列。
在具体的操作过程中，可以通过合成一种人造的RNA序列，让这种RNA序列与Cas9蛋白相结合，并导向它精确切割指定的DNA序列。
由此，CRISPR基因编辑技术就实现了对生命体的基因组进行高效和精确的编辑。
二、CRISPR基因编辑技术的应用CRISPR基因编辑技术的应用极其广泛，包括在农业、医学和科学研究等领域。
下面将介绍一些CRISPR基因编辑技术的应用案例。
1. 农业CRISPR基因编辑技术在农业领域的应用主要包括两个方面：改良农作物和改进畜牧业。
（1）改良农作物：CRISPR基因编辑技术可以被用来改进农作物的产量、抵御病虫害和适应气候变化。
例如，科学家们已经利用CRISPR基因编辑技术改造了一些作物，使其能够在盐度高的土壤中生长，以此适应干旱和盐浸带环境。
浅析CRISPR-Cas9系统发展及其原理
浅析CRISPR-Cas9系统发展及其原理作者：李奕阳来源：《中国科技纵横》2020年第11期摘要：CRISPR-Cas系统是一种对生物物基因组定点编辑技术。
因为它操作简单、成本低、耗时短等优点，从而逐渐取代锌指核酸酶（ZFNs）TALE核酸酶（TALENs），成为对目标基因进行高效、定点编辑的技术，引起生物科学界的巨大变革。
本文介绍了CRISPR-Cas9系统的作用原理和优势，指出尚未解决的问题，结合其在各个国家的研究现状，展望CRISPR-Cas9系统的应用前景。
关键词：CRISPR-Cas9;基因编辑;基因治疗0 引言原核生物基因内的一段重复序列称为CRISPR，是其在长期而复杂的进化过程中获得的对抗病毒侵入的免疫工具。
概括地说，病毒通过对自身的基因整合进入细菌体内完成侵入，并利用细菌体内的蛋白质等物质进行复制繁殖，而细菌演化出CRISPR-Cas9系统，抵抗这种侵入。
通过CRISPR-Cas9系统，细菌可以将自身基因内病毒侵入的片段进行切除，从而实现免疫防御。
细菌拥有多种手段切除病毒的遗传信息，通过合成一种特殊的复合物进行切除的方法最为常见，该复合物可以定向地寻找特定的基因序列，之后进行定点切除。
该复合物在细菌体内较为复杂，有Cas9蛋白参与基因组的定点编辑，这种技术被命名为CRISPR/Cas9基因编辑技术，在当下拥有非常广阔的科研前景，并且逐渐开发完善。
此系统具有低成本、易操作、精准度高、周期短等优点[1]。
1 CRISPR系统简介CRISPR技术具有改变生物科技领域基本规则的能力，这种系统主要分为两个部分，具有引导功能的sgRNA以及具有核酸内切酶活性的Cas9蛋白，CRISPR-Cas9系统的科研前景非常广阔，可以改变生物的遗传物质达到改变性状的目的，通过对植物的基因组定点编辑加强该植株对某种特定病毒的抵抗能力;通过修复细胞DNA治疗特定遗传病等。
CRISPR是在微生物的免疫系统中发现的，通过对Cas9酶的利用，能在DNA中插入作为引导序列的RNA，之后实现切除DNA片段等目的。
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1 基因表达研究方 法
干扰基因表达（过表达或低表达），或者表达突变体并检 测其相关生理功能，是基因功能研究中最重要的方式之一； 基因表达技术- 质粒转染，病毒转染等传统方法得到广泛 运用，但同时其也存在缺点；
1 基因修饰的方法 与各自优势
质粒- 瞬时转染 - 某些细胞效率偏低 - 表达结果不稳定，有 内源表达的干扰； 质粒- 稳定细胞 - 表达结果不稳定，筛选效率不高，在重组 插入基因组中可能干扰其它基因表达；
through Replacing TALENs with CRISPRs》一文中，作者 利用TALENs和CRISPRs对同一基因进行修饰，效率分别为 0%-34%和51%-79%。
4 CRISPR-Cas系统前景分析
而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更 容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于 CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。
重复序列之间被 26~72 bp 间隔序列(spacer)隔开。CRISPR
就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行识别。
1.1 CRISPR结构
1.2 Cas家族
Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在 guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似， 但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。
最主要的要求：
PAM（protospacer-adjacent motif）为NGG。
2 CRISPR-Cas系统靶向要求
在人类基因组中，平均每8bp就出现一个NGG PAM。
2 CRISPR-Cas系统靶向要求
3 CRISPR-Cas系统介导基因修饰
3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换
3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰
3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰
3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰
Cas9
sg-RNA
3.3 cr-RNA：Cas介导双基因修饰
2013年2月15日在《science》上发表的《Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems》一文 中，作者利用一个包含两个靶向不同基因的spacers的 crRNA实现了同时对两个基因进行编辑。
4 CRISPR-Cas
技术优势
只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas
蛋白不具特异性。
编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs和ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱZFNs更简单方便。
较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复的TALENs编
码载体带来的并发症。
5 我们的工作 利用CRISPR-Cas9载体肿瘤基因M在卵 巢癌细胞HeLa的编辑与敲除
6
Models generated by CRISPR/Cas9 system Dumpier nematodes Zebrafish embryos Fruit flies
Monkey
Rice
Pennisi E. 2013. Science, (6148):833-6.
7
1 CRISPR-Cas概述
2013年1月29日在《nature biotechnology》上发表的 《RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems》一文中，作者利用CRISPR-Cas系 统用设计好的DNA模板替换的相应基因来达到基因的定向 修饰。
1987年，日本大阪大学（Osaka University）在对一种细菌 编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究时， 发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA 片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的
两端还存在一段不太长的特有的序列。
2013以后，研究者们在包括《science》和《nature
DNA
+donor DNA DNA sequence disrupted DNA sequence replaced
NHEJ: Non-homologous end joining
HDR: homology directed repair
非同源性末端接合修复机制(Nonhomologous end joining, NHEJ)
CRISPR-Cas主要由两部分组成：
切割
识别
1.1 CRISPR结构
CRISPR： （clustered regularly interspaced short palindromic repeats）
CRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族, 广泛分布于
细菌和古细菌基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守 的重复序列(repeats) 组成, 重复序列的长度通常 21~48 bp,
5 我们的结果 验证肿瘤增殖、迁移等功能受到影响；
3.3 cr-RNA：Cas介导双基因修饰
4 CRISPR-Cas系统前景分析
这是一项靶向基因修饰的革新技术，一项极具有 可能获得诺贝尔奖技术。
4 CRISPR-Cas系统前景分析
2013年4月12日在《cell stem cell》上发表的《Enhanced
Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing
(缺失2个碱基，移码） (缺失6个碱基，不移码） (缺失6个碱基，不移码） (缺失2个碱基，移码） (缺失2个碱基，移码） (缺失2个碱基，移码） (缺失2个碱基，移码） (缺失2个碱基，移码） (插入1碱基，移码) (缺失2个碱基，移码） (缺失2个碱基，移码） (缺失6个碱基，不移码） (插入1碱基，移码) (插入1碱基，移码)
2 CRISPR-Cas系统的发现
CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，
通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进
行切割，从而达到对自身的免疫。
2 CRISPR-Cas系统的发现
2 CRISPR-Cas系统的发现
2 CRISPR-Cas系统的发现
CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免
病毒- 瞬时感染 - 表达结果不稳定，质粒容易在细胞复制过
程中丢失，随机插入基因组中可能会干扰其它基因表达； 新一代的基因编辑技术- 利用重组酶在基因组水平修饰基
因，产生的遗传性质稳定，直接作用于内源，减少表达干扰，
目前有成熟的技术如CRISPR/Cas9；
DNA修复的机制与 基因编辑原理
NHEJ and HDR
同源介导的修复机制(Homologydirected repair, HDR)
ZFN与TALEN基因 编辑原理
ZFN and TALEN
5
Genome Editing in Mammalian Cells
I: Genome modification
II: Genomic deletion
Le C, F Ann R, David C, et al. 2013, Science, (6121):819-823.
疫, 而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主 防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细
菌进化了CRISPR 介导的适应性免疫。这种免疫功能的发
挥是由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删 除间隔序列（spacer）来实现的。
2 CRISPR-Cas系统靶向要求
biotechnology》等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas
系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确 的基因修饰。
1 CRISPR-Cas概述
CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas 蛋白对靶向基因进行修饰的技术。
1 CRISPR-Cas概述
5 我们的结果 成功获得了M基因敲除的HeLa细胞系，
模板 CCCGGCAGGCTGGACAC-TTCGTGGAGGGCTCCAAAG 11-5-1 CCCGGCAGGCTGGACAC--TCGTGGAGGGCTCCAAAG 11-5-2 CCCGGCAGGCTGGACAC------GGAGGGCTCCAAAG 11-5-3 CCCGGCAGGCTGGACAC------GGAGGGCTCCAAAG 11-5-5 CCCGGCAGGCTGGACAC--TCGTGGAGGGCTCCAAAG 11-5-4 CCCGGCAGGCTGGACAC--TCGTGGAGGGCTCCAAAG 11-5-6 CCCGGCAGGCTGGACAC--TCGTGGAGGGCTCCAAAG 11-18-1 CCCGGCAGGCTGGACAC--TCGTGGAGGGCTCCAAAG 11-18-2 CCCGGCAGGCTGGACAC--TCGTGGAGGGCTCCAAAG 11-18-4 CCCGGCAGGCTGGACACTTTCGTGGAGGGCTCCAAAG 11-18-6 CCCGGCAGGCTGGACAC--TCGTGGAGGGCTCCAAAG 11-18-8 CCCGGCAGGCTGGACAC--TCGTGGAGGGCTCCAAAG 11-18-9 CCCGGCAGGCTGGACAC------GGAGGGCTCCAAAG 11-18-5 CCCGGCAGGCTGGACACTTTCGTGGAGGGCTCCAAAG 11-18-7 CCCGGCAGGCTGGACACTTTCGTGGAGGGCTCCAAAG
流程-
a.sgRNA的引物设计（4条）； b.px459-cas9载体构建 ，HeLa细胞上的转染与基因靶 点筛选（1次）； c.母克隆的基因剪切的确定（2-3个母克隆）； d.单克隆筛选（2-3轮，100个子克隆） f. 单克隆的鉴定（Q-PCR以及WB检测）；