植物亚细胞定位载体卡盒pCEG的构建及验证

Key words: construction of vector box; subcellular localization; GFP; tobacco
在基因的功能研究过程中，外源重组基因表达 产物的功能与其在宿主细胞中的定位有重要的关 系，特别是对于真核细胞，蛋白质位于不同的细胞 部位所行使的功能也不同，所以研究其在宿主细胞
头，与切成线性的 pCAMBIA-1302 连接，构建成中 间表达载体，命名为 pCEbT。将 pCEbT 转化大肠杆 菌 DH5α，在含有 Km 的 LB 培养基平板上筛选转化 菌落，提取转化子质粒，并用 SalⅠ和 BglⅡ进行 双酶切鉴定，酶切电泳图结果显示不能切下约 700 bp 大小的条带，证明 SalⅠ酶切位点已被消 除，即证明质粒 pCAMBIA-1302 中的 MCS 已被消 除（见图 1）。
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东北农业大学学报
第 42 卷
GFP）。绿色荧光蛋白是细胞生物学和分子生物学 研究中的一个重要的工具，绿色荧光蛋白相对分 子质量很小，能与多种不同的蛋白质 N 端或 C 端 融合而保持其天然蛋白的特性，因此是一种直观 性很强的遗传标记物 。 [1-3] 通过与某单一序列的融 合，可特异地进行细胞核、线粒体、质体、内质 网等细胞器的定位。由于 GFP 基因其产物可以自 身发光，不需要任何底物和辅助因子参与就能检 测其活性，所以用 GFP 进行亚细胞定位，避免了 提纯蛋白、标记异硫氰酸荧光素等荧光染料、经 显微注射或其他方式导入细胞的复杂方法，从而 使研究蛋白在活细胞的准确定位变得简单易 行 。 [4-6] 但在研究基因在植物细胞中的定位时，必 须构建与基因融合的 GFP 亚细胞定位载体，常常 会因酶切位点的难以选择使得构建周期长，操作 复杂，如果能构建出具有多个可用酶切位点的植 物表达载体卡盒，将大大缩短载体构建周期，节 省大量人力物力[7-8]。
第4期
朱 丹等：植物亚细胞定位载体卡盒 pCEG 的构建及验证
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2 结果与分析
2.1 植物 GFP 亚细胞定位载体 pCAMBIA-1302 中 MCS 的消除
用 Eco R Ⅰ 和 Pst Ⅰ 双 酶 切 质 粒 pCAMBIA1302，消除其多酶切位点（MCS），同样用 Eco RⅠ 和 PstⅠ双酶切质粒 pEbTIP 并回收切下的大小约 280 bp 不含有常用酶切位点的基因片段作为小接
（ 东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030 ）
摘 要：GFP 基因被广泛地应用于植物转基因以及基因功能验证研究，然而构建与 GFP 融合的植物表达载
体，常会因酶切位点难以选择，而使得载体构建过程复杂，周期长。以含 GFP 的质粒 pCAMBIA-1302 为基础，消
除此质粒本身的多克隆位点（MCS），并在此质粒 GFP 基因序列前插入原核表达载体 pET-32b 的多克隆位点，构建
1 材料与方法
1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒
大 肠 杆 菌 菌 株 DH5α， 根 癌 农 杆 菌 菌 株 EHA105。
植物 GFP 亚细胞定位载体 pCAMBIA-1302，植 物表达载体 pEbTIP，原核表达载体 pET-32b 均由 东北农业大学植物生物工程研究室保存；中间表 达 载 体 pCEbT 和 植 物 GFP 亚 细 胞 定 位 载 体 卡 盒
trxA pEbTIP 6 108 bp
烟草品种为本氏烟。 1.2 方法 1.2.1 质粒 DNA 提取、电泳、酶切、大肠杆菌及 农杆菌感受态制备、转化、菌落 PCR
均采用常规分子生物学操作技术，具体操作步 骤参照文献[9]。 1.2.2 琼脂糖凝胶中 DNA 片段的回收
按照试剂盒操作说明进行。 1.2.3 连接反应方法
具体操作步骤参照文献[10]。 1.2.4 引物设计
BEaHcSmXKSSoiSmPnpbpaaHRsdhaancltⅢⅠⅠⅠⅠⅠⅠⅠⅠⅠ
NcoⅠ Bgl Ⅱ
P35S GCAMBIA-1302 hpt11 10 549 bp
T34S
His Tag Eco RⅠ PstⅠ Bgl Ⅱ
fl origin Gs TIP
Ampr
了植物 GFP 亚细胞定位载体卡盒 pCEG；采用农杆菌介导的转化方法，将此载体卡盒 pCEG 导入模式植物烟草叶片
中进行瞬时表达，用激光共聚焦显微镜观察 GFP 蛋白的亚细胞定位情况，发现 GFP 蛋白均匀的在细胞质和细胞核
中表达，证明此载体卡盒可用于植物基因的亚细胞定位分析，并为构建目的基因与 GFP 融合的植物表达载体提供
pCEG 由 本 研 究 室 构 建 ； 测 序 载 体 pGEM-T 购 自 Promega 公司。质粒图谱见结果与分析。 1.1.2 常用试剂及酶类
LA TaqDNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、限制性 内 切 酶 及 DNA 胶 回 收 试 剂 盒 均 购 自 大 连 宝 (TaKaRa)生物工程公司。卡那霉素、氨苄青霉素等 其他试剂均为进口或国产分析纯。引物合成、 DNA 测序由上海生物工程公司完成。 1.1.3 植物材料
了很多可用的酶切位点，对植物基因功能验证提供了分子操作简便的植物表达载体卡盒，具有重要的利用价值。
关键词：载体卡盒构建；亚细胞定位；GFP；烟草
中图分类号：Q782
文献标志码：A
文章编号：1005-9369（2011）04-0083-05
Construction and application of a plant subcellular localization vector box of pCEG/ZHU Dan, WANG Xi, ZHU Yanming, CHEN Chao, LI Yong, BAI Xi, CAI Hua, JI
Wei (College of Life Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)
Abstract: GFP gene was widely applied in the transgenic plants and genes function's proving study.
本研究通过酶切连接手段消除 pCAMBIA-1302 载体本身的多克隆位点（Multip cloning site，MCS）， 同 时 通 过 高 保 真 PCR 扩 增 克 隆 了 原 核 表 达 载 体 pET-32b 的多克隆位点，并将此多克隆位点插入已 消除本身多克隆位点的载体 pCAMBIA-1302 的 GFP 基因序列前，构建成植物 GFP 亚细胞定位载体卡 盒 pCEG；通过农杆菌介导的转化方法，将此载体 卡盒 pCEG 于烟草叶片中进行瞬时表达，用激光共 聚焦显微镜观察 GFP 蛋白的亚细胞定位情况，发 现 GFP 蛋白在细胞质和细胞核都有表达，证明此 载体卡盒可用于植物基因的亚细胞定位分析；本 研究所构建的载体卡盒为目的基因的植物亚细胞 定位载体的构建带来了很大的便利，也为目的基 因在宿主细胞中的亚细胞定位研究奠定基础。
However, the construction of GFP fused plant expression vectors was always complicated and time consuming due to the hard choose of restriction enzyme cutting sites. Use plasmid pCAMBIA-1302 which included GFP gene as a original vector, and eliminated its own multiple clone site (MCS), and then inserted pET-32b's multiple clone site in front of GFP gene sequences, named the eventual plant GFP subcellular localization vector box pCEG. By Agrobacterium-mediated transformation method, pCEG instantaneous expressed in tobacco leaves, and GFP protein subcellular localization was observed by laser confocal microscope.The result displayed that the GFP proteins expressed in both cytoplasm and nucleus, this means the pCEG box can be used conveniently for plant genes subcellular localization analysis and provide a lot of usable restriction enzyme cutting site for plant genes fusioned with GFP, and the pCEG box is convenient for plant genes function analysis and has great use value.
根据原核表达载体 pET-32b 上 MCS 区附近的 序列，应用 Primer Premier 5.0 软件分析其内部酶切 位点，设计一对 MCS 的克隆引物，为方便后续载 体构建，上游引物端从 NcoⅠ位点开始设计，并在 下游端加入了 BglⅡ位点。最终确定引物序列如下：
上游引物: 5' GTACCGACGACGACGACAAGGC 3' 下游引物: 5' AGATCTACCATTTTAGCAGCCGG ATCTAAG 3' 根据载体 pCEG 上新插入的 MCS 上游区的碱基 序列，应用 Primer Premier 5.0 软件设计了一条引物 用于载体卡盒 pCEG 中新插入的 MCS 的测序，其引 物序列如下： 5' AGTGGATTGATGTGATATCTCC 3' 1.2.5 农杆菌介导的亚细胞定位载体卡盒 pCEG 对 烟草的转化 将质粒 pCEG 转入农杆菌 EHA105，通过 PCR 鉴定阳性转化子，将转入质粒 pCEG 的农杆菌注射 培养 4 周大小的烟草叶片。 1.2.6 GFP 亚细胞定位观察 取侵染后 3 d 的烟草叶片，在激光共聚焦显微 镜 488 nm 检测波长下，观察 GFP 蛋白的表达情况 以及亚细胞定位情况。